由人类胚泡来源的干细胞衍生的多能心脏前体细胞新种群的制作方法

专利名称：：由人类胚泡来源的干细胞衍生的多能心脏前体细胞新种群的制作方法由人类胚泡来源的干细胞衍生的多能心脏前体细胞新种群发明领域本发明涉及源自hBS细胞的新的多能心脏前体(MCP)细胞种群，以及这种MCP细胞在例如医学治疗、药物开发、细胞治疗和毒性检测中的潜在应用。此外，MCP细胞具有分化成自发收縮性心肌细胞样细胞的能力，这使得它们具有用于心脏发生的体外研究例如早期心肌发生过程或心肌再生性疾病或畸形的吸引力。MCP细胞在对同样源自于hBS细胞的所谓基细胞(basementcell)进行培养后获得。因此，本发明也涉及这些已被证明能够提供MCP细胞的基细胞。
背景技术：
：心血管疾病是造成世界上大量死亡的原因，是医疗保健系统的主要负担。对于末期心脏病来说，心脏移植仍然是最好现有治疗方法。但是，除了这种干预手段的高昂花费之外，这种方法的限制还涉及由于使用免疫抑制剂带来的副作用以及可获得的器官供体有限。在其它的可能性中，细胞移植已经呈现为一种刺激心肌再生的新的尝试性选择。通过减少对器官的需求，基于细胞的治疗对于社会和患有严重退变性疾病例如心肌梗塞的个体来说，都是极其重要的。在过去几年间，传统的关于心脏是终末分化器官的观点受到了挑战，已经记载有肌细胞更新以及在成年哺乳动物心脏中存在干细胞/祖细胞(Urbanek等PNAS2003,100(18),10440-45;Laugwitz等Nature,2005,433,647-653;Messina等CircRes2004,95,911-921;Beltrami等Cell,2003,114,763-776;Cai等DevCell2003,5,877-889)。已经提出了许多不同的组织作为能够产生新的心肌细胞的干细胞源(例如胎儿心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、骨髓源干细胞、从脐带血分离的干细胞、脂肪组织源干细胞、和胚胎干细胞)。到目前为止，只有胚胎干细胞显示出能够在体外有效分化成自发收縮性心肌细胞样细胞(Kehat等JClinInvest,108:407-414,2001;Xu等CircRes,91:501-508,2002;He等CircRes，93:32-39，2003;Mummery等Circulation,107:2733-2740,2003)。但是，从人类胚泡干细胞衍生和分离的心脏干细胞或MCP细胞，以前还没有描述过。值得注意的是，MCP细胞是未成熟的细胞，还没有获得心肌细胞样细胞的功能特征。另一方面，已报道从人类新生儿心脏活体组织中分离出心脏干细胞，并在组织培养中增殖(Messina等CircRes2004;WO2005/012510Al;WO2006/052925A2)。这些细胞是产克隆的，表达有干细胞和内皮细胞标志(例如c-kit、CD-34、Sca-1)，并且在体内能够分化成肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。但是，这些分离依赖于人类活体组织的可得性以及获取它们的外科技术。许多报道证实了人类胚胎干细胞分化成收缩性肌细胞的能力，但到目前为止，还没有关于从人类胚胎干细胞中鉴定和分离到个别的中间心脏祖细胞种群的报道。对于简单的、非外科的衍生、分离和扩增心脏祖细胞以后续用于药物开发、毒性检测和细胞治疗的方法，存在极大的需求。发明简述本发明涉及多能心脏前体(MCP)细胞以及从hBS细胞制备它们的方法。此外，本发明涉及作为MCP细胞来源的特定基细胞类型。本发明的MCP细胞特别适合用于药物发现、毒性检测和细胞治疗，因为它们天生具有分化成自发收縮性心肌细胞样细胞的能力。因此，本发明的一个方面涉及人类胚泡来源的干细胞(hBS)包括多能性心脏前体(MCP)细胞的细胞种群，以及MCP细胞本身。MCP细胞根据形态学特征很容易鉴定，此外，含有MCP细胞的细胞种群具有下面的特征i)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4，ii)至少1%的细胞没有表现出一种或多种神经标志包括巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志包括短尾蛋白(brachyury)、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，iv)至少1%的细胞表现出Flk-l(KDR)的蛋白和/或基因表达。此外，至少1%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达。MPC细胞的重要特征在于它们是非收縮性的，并且如本文所述，它们具有非常特别的形态。从本公开将可以明显看出，MCP细胞源自于所谓的基细胞。基细胞可以通过将hBS细胞进行相对短时期的包含分化因子或培养基的悬浮培养或强制聚集方法来获得l从该悬浮培养物中将细胞铺板并增殖，呈现单层基细胞。在进一步培养后，成簇的MCP细胞显得象带线的气球。因为基细胞是获得MCP细胞的重要中间产物，本发明还涉及含有基细胞的细胞种群以及基细胞本身。其它方面，本发明涉及源自于MCP细胞的心肌细胞样细胞，以及基细胞、MCP细胞和心肌细胞样细胞在药物发现、药物筛选、医学等中的应用。此外，本发明涉及获得细胞种群的方法。发明详述定，裙写本文使用的术语ASA是指乙酰水杨酸，它是阿司匹林中的活性物质。本文使用的术语"胚泡来源的干细胞"表示为BS细胞，其人类形式被称为"hBS细胞"。在文献中，该细胞通常被称为胚胎干细胞，更具体来说是人类胚胎干细胞。本文使用的术语"DMSO"是指二甲亚砜。本文使用的术语"基细胞".是指产生MCP细胞的细胞层。基细胞还由形态学特征以及特异性标志特征来进一步定义。本文使用的术语"MCP"是指多能心脏祖细胞，是能够产生中胚层谱系中的许多不同细胞类型的一种细胞类别。它可以产生的一种这样的细胞类型是心肌细胞样细胞，它是共有成熟心肌细胞特征的细胞。MCP细胞还由形态学特征以及特异性标志特征、例如Flk-l(KDR)、ISL-1、Notch-l、Nkx2.5、GATA-4和2型肌钙蛋白T(TNNT2)的基因表达来进一步定义。此外，MCP细胞被定义为非收缩:性心脏前体。本文使用的术语"MCP簇"和"MCP细胞簇"是指一组至少两个彼此附着的MCP细胞。本文使用的术语"下调"和"上调"是指与未分化细胞相比至少两倍差别的调控。词养细胞本文使用的饲养细胞是指单独或组合使用的支持细胞类型。该细胞类型可以进一步是人类或其它物种来源的。可以衍生出饲养细胞的组织包括胚胎、胎儿、新生儿、幼年或成年组织，还包括源自于皮肤包括包皮、脐带、肌肉、肺、上皮、胎盘、输卵管、腺体、基质或乳腺的组织。饲养细胞可以源自属于人类成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、角质细胞、内皮细胞和上皮细胞的细胞类型。可用于产生饲养细胞的具体细胞类型的例子包括胚胎成纤维细胞、胚外内胚层细胞、胚外中胚层细胞、胎儿成纤维细胞和/或纤维细胞、胎儿肌细胞、胎儿皮肤细胞、胎儿肺细胞、胎儿内皮细胞、胎儿上皮细胞、脐带间质细胞、胎盘成纤维细胞和/或纤维细胞、胎盘内皮细胞、新生儿包皮成纤维细胞和/或纤维细胞、新生儿肌细胞、新生儿皮肤细胞、新生儿内皮细胞、成人皮肤成纤维细胞和/或纤维细胞、成人肌细胞、成人输卵管内皮细胞、成人子宫内膜腺细胞、成人基质子宫内膜细胞、成人乳腺癌实质细胞、成人内皮细胞、成人上皮细胞或成人角质细胞。当饲养细胞源自于hBS细胞时，细胞可以是成纤维细胞。本文使用的术语"MEF细胞"是指小鼠胚胎成纤维细胞。本文使用的术语"胚层"是指发育生物学已知的三个主要谱系即外胚层(产生例如神经组织)、中胚层(产生例如结缔组织、软骨和骨)和内胚层(产生内部器官的组织，例如肠上皮、肝脏和胰脏)的任何一种。本文使用的术语"hFF细胞"是指人类包皮成纤维细胞。hFF细胞可以商购或按照本文方法部分中的描述衍生。本文使用的术语"FGF"是指成纤维细胞生长因子，优选为人类和/或重组来源的，属于它的亚型是例如bFGF(有时也被称为FGF2)禾口FGF4。本文使用的术语"EGF"是指上皮生长因子。术语"BMP2"是指骨成型蛋白-2，它是生长因子的BMP家族的一个成员。本文使用的术语"无外源物(xeno-free)"是指完全避免了直接或间接暴露于非人类动物成分。本文使用的术语"强制聚集"是指通过施加外部力量来增加细胞彼此之间或与表面的附着。未分化的hBS细胞的标志SSEA-3、SSEA-4(阶段特异性胚胎抗原3和4)、TRA-l-60、TRA-l-81、Oct-4、ALP(碱性磷酸酶)。早期分化的hBS细胞的标志SSEA-1从发育生物学观点来看，中胚层谱系或胚层的早期标志是波形蛋白、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白，中内胚层细胞的标志是短尾蛋白。内胚层谱系细胞的标志巢蛋白、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白或GFAP是只在中枢神经系统的星形细胞中发现的III型中间丝蛋白)。心脏干细胞标志c-kit;心脏祖细胞标志Islet-l、Nkx2.5、GATA-4。这里作为早期心脏标志。心肌细胞标志cTnl、cTnT(心肌肌钙蛋白I禾口T)、a-MHC(a-肌球蛋白重链)、连接蛋白-43。如上所述，本发明提供了MCP细胞以及成为心肌细胞样细胞的中间基细胞和分化的MCP细胞。可以设想MCP细胞以及基细胞是新的。这些细胞可以有利地用于广泛的研究目的，例如在药物发现过程中、在药物筛选过程中、研究药物对心脏细胞类型的潜在影响的体外模型、研究心脏发生例如早期心脏发生的体外模型、研究人类心脏退变性疾病的体外模型、体外心脏毒性测试等。此外，MCP细胞、中间的基细胞以及衍生的心肌细胞样细胞可以有利地用于治疗和/或预防由组织退变例如心脏组织的退变引起的病理和/或疾病。更具体来说，这些疾病包括心脏病，例如与坏死、凋亡、损伤、功能障碍和/或形态异常的心肌相关的疾病。其它疾病包括缺血性心脏病、心肌梗塞、风湿性心脏病、心内膜炎、自体免疫心脏病、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、心脏节律紊乱、心功能不全等。因此，细胞，特别是本发明的MCP细胞和心肌细胞样细胞可用于医学和药物制备中。MC尸一鍾在本发明中，MCP细胞是指具有非常特别的形态并具有特定标志特征的细胞。因此，本发明的第一方面涉及含有多能心脏前体(MCP)细胞、人类胚泡来源的干(hBS)细胞衍生的细胞种群。该细胞种群具有下面的特征i)至少1。/。的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4，ii)至少1%的细胞没有表现出一种或多种神经标志包括巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志包括短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，iv)至少1%的细胞表现出Flk-l(KDR)的蛋白和/或基因表达。从本文的实施例可以明显看出，Flk-l是MCP细胞的极好标志。此外，对于MCP细胞来说，至少1%，例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少卯％或至少95%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志包括islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达。与例如心肌细胞相反，MCP细胞是非收縮性细胞。因此，本发明的包含MCP细胞的细胞种群具有至少50%的非收缩性细胞，例如至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%。正如本文实施例中所证实的，肌钙蛋白T2是MCP细胞的良好标志。因此，本发明的细胞种群是其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出肌钙蛋白T2的蛋白和/或基因表达的种群。此外，CD31也已经显示出是MCP细胞的极佳标志。因此，本发明的细胞种群是其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70°/。、至少80%、至少85%、至少90%或至少95°/。的细胞表现出CD31的蛋白和/或基因表达的种群。在特定情况下，Nkx2.5和GATA-4也是MCP细胞的良好标志。正如在实施例中所示，当MCP细胞是在小鼠饲养细胞上培养后获得时，情况尤为如此。因此，本发明的细胞种群是其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出Nkx2.5禾口/或GATA-4的蛋白和/或基因表达的种群。在具体实施方案中，本发明的细胞种群具有至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25/q、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少卯％或至少95°/。的细胞表现出Flk-l(KDR)、肌钙蛋白T2、CD31、Nkx2.5和GATA-4的蛋白和/或基因表达，即细胞是MCP细胞。在另一个具体实施方案中，本发明的细胞种群具有至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30/。、至少40%、至少50%、至少60%、至少70°/。、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出祖细胞的一种或多种标志Flk-l(KDR)和ISL-1的蛋白和/或基因表达，即细胞是MCP细胞。在另一个具体实施方案中，本发明的细胞种群具有至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少卯％或至少95。/。的细胞表现出祖细胞的两种或多种标志Flk-l(KDR)、Notch-l或ISL-1的蛋白和/或基因表达，即细胞是MCP细胞。特征i)确保细胞总的来说是分化的细胞，即它们与衍生出它们的hBS细胞不同。特征ii)确保细胞总的来说没有分化成神经样细胞，特征iii)表明细胞具有中胚层特征，以及特征iv)确保hBS细胞已经发育成MCP细胞。此外，至少1%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达。该特征确保细胞还没有分化成心肌样细胞，即细胞仍然是具有发育成不同种类细胞的潜能的前体细胞。如本文实施例所示，MCP细胞可以发育成心肌细胞样细胞或其它分化的细胞类型，但是它们也具有提供基细胞的能力。MCP细胞具有非常特征性的形态，这可以使用光学显微镜看到。此外，MCP细胞被显示在本文的图中。因此，在一个实施方案中，本发明涉及含有MCP细胞的细胞种群，其外观为小而圆的并且亮相(phase-bright)的细胞簇；单个细胞的直径为5-20^m，每簇由2-500个细胞构成。MCP细胞簇的形状为圆形或细长形，如图2的a、b和c部分所示。一般来说，MCP细胞簇表现为松散的粘附的细胞簇，其如果生长在基细胞上，则覆盖单层的基细胞。此外，MCP细胞具有相对高的细胞核与细胞质的比率，例如细胞总体积的1:2-1:64。另一个特征性形态特点可以从图2看出，即MCP细胞簇显得象带线的气球，如同图18中的示意略图所示。因此，在具体实施方案中，本发明的细胞种群是其中至少50%下述的MCP细胞1.生长为小而圆的并且亮相的细胞簇，2.形成圆形或细长形的簇块，表现为松散粘附的细胞簇，如果生长在基细胞上，则覆盖单层的基细胞，3.具有相对高的细胞核与细胞质的比率，禾Q/或4.外观象带线的气球具有所有下列特征i)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81和Oct-4，ii)至少1%的细胞没有表现出一种或多种神经标志例如巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，以及iv)至少1%的细胞表现出Flk-l(KDR)的蛋白和/或基因表达。在具体实施方案中，至少1%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达(特征v)。优选，至少50n/。的MCP细胞具有该四种特征中的至少两种，例如四种特征中的至少三种或所有四种特征。在本发明的一个实施方案中，至少55%、例如至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的MCP细胞满足对于特征i)、ii)、iii)和/或iv)的要求。如上所述，本发明还涉及含有MCP细胞的细胞种群。这样的细胞种群满足至少特征i)，例如至少特征i)的至少两个、例如至少3个、至少4个或所有i)中提到的标志。该特点是重要的，因为非常希望能够将MCP细胞与未分化的hBS细胞辨别开。在本发明的一个实施方案中，含有MCP细胞的细胞种群中至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA_r-60、TRA-1-81禾BOct-4。此外或可选地，细胞种群具有至少特征ii)的在ii)中提到的两种标志。该特征对于确保避免分化成神经类型的细胞是重要的。在本发明的一个实施方案中，含有MCP细胞的细胞种群中至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40°/。、至少50%、至少60%、至少70%、至少80°/。、至少85%、至少90%或至少95%的细胞没有表现出一种或多种神经标志例如巢蛋白或GFAP的蛋白表达。特征iii)与中胚层特征的存在有关，优选满足至少特征iii)的在iii)中提到的两种或三种标志。在本发明的一个实施方案中，含有MCP细胞的细胞种群中至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达。特征v)对于确保细胞还没有发育成早期心肌样细胞来说是重要的，因此，细胞种群优选具有至少特征iv)的在iv)中提到的至少2种、例如2、3、4、5或6种标志。在本发明的一个实施方案中，含有MCP细胞的细胞种群中至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90°/。或至少95%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白和/或基因表达。具体来说，细胞种群具有四种特征中的至少两种，例如四种特征中的至少三种或所有四种特征。本发明的细胞种群可以是无外源物的，如果用于医学目的，这一点是有利的。本发明的MCP细胞在培养过程中能够维持它们表现出的特征i)-v)。在这种背景下，术语"维持的特征"是指在确定的培养和分析期限中，蛋白、基因或抗原的稳定表达，它们可以进一步用例如免疫组织化学来显示并计算和比较表达的强度。因此，本发明的含有MCP细胞的细胞种群可以在体外培养。此外，MCP细胞可以再生并随后从同层基细胞分离。这样的再生可以进行最多20次。基细胞和MCP细胞都显示出前体性质例如Flk-1(KDR)基因表达，通过延时(time-laps)研究(实施例14)显示，MCP细胞产生基细胞以及基细胞产生MCP细胞，即所述细胞是具有某些共同性质的紧密关联的前体细胞。分众游MC尸潘^t新MCP细胞一个非常重要的性质是它们分化成心肌细胞样细胞的能力。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的细胞种群通过铺板和使用分化培养基进行为期至少5天的分化，然后它具有至少一种下面的特征i)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出一种或多种心脏标志例如islet-l、GATA-4、Nkx2.5、cTNI、cTNT或连接蛋白43的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出未分化干细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4。与MCP细胞的特征相比，可以看出这些源自于MCP细胞的心肌细胞样细胞维持了它们有关于中胚层标志的特征。在具体实施方案中，这些细胞满足至少特征i)例如至少特征i)的在i)中提到的两种或三种标志。在具体实施方案中，对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞，特征i)是有效的。此外，源自于MCP细胞的心肌细胞样细胞应该具有特征ii)以证实它们的心肌细胞样特征，即它们具有阳性的心脏标志，即分化成心肌样细胞得到了证实。在具体实施方案中，这些细胞满足至少特征ii)的在ii)中提到的至少2种、例如2、3、4、5或6种标志。在具体实施方案中，对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50°/。、至少60%、至少70°/0、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞，特征H)是有效的。分化的细胞也保留了关于分化的特征，即细胞种群在进行分化后具有至少特征iii)的在iii)中提到的至少2种、例如2、3、4或5种标志。在具体实施方案中，对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20°/。、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞，特征m)是有效的。优选，细胞种群在进行分化后具有至少两种或所有三种特征。基鍾基细胞是MCP细胞形成中的重要居间细胞。它们与它们所源自的hBS细胞不同，它们在形态上也与MCP细胞不同。因此，本发明还涉及人类胚泡来源的干(hBS)细胞衍生的细胞种群，该细胞种群含有基细胞。该细胞种群具有下列特征i)至少1%的细胞表现出短尾蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出a-横纹肌肌动蛋白的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出波形蛋白的蛋白表达，iv)至少1%的细胞没有表现出结蛋白的蛋白表达，以及v)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4。33从本文的实施例可以看出，基细胞表现出许多基因的基因和/或蛋白表达，例如在实施例3表II中列出的。因此，本发明的含有基细胞的细胞种群还具有下列特征i)至少1%的细胞表现出实施例表11中列出的至少一种或多种基因的基因表达，例如碱性核蛋白1(BNC1)、肾连蛋白(NPNT)、纤维蛋白原a链(FGA)、膜联蛋白A8(ANXA8)、基质Gla蛋白(MGP)、透明带糖蛋白4(ZP4)、血栓调节蛋白(THBD)、同源异型框B7(HOXB7)、心脏和神经嵴表达衍生物1(heartandneuralcrestderivativesexpressed1)(HAND1)、桥粒芯胶蛋白3(DSC3)、白介素6信号转换因子(IL6ST)、水通道蛋白1(AQP1)、巻曲相关蛋白(FRZB)、缓激肽受体B1(BDKRB1)、生长激素受体(GHR)和激酶插入结构域受体(F仪-7)(KDR)。ii)与未分化的hBS细胞相比，至少1%的细胞具有下调的oct-4禾口nanog基因表达。一般来说，对于细胞种群中至少5%、例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30°/。、至少40%或至少50%的细胞来说，上面列出的基细胞特征是有效的。基细胞具有非常特征性的形态，可以使用光学显微镜看到。此外，基细胞显示在本文的图中。因此，在一个实施方案中，本发明涉及含有基细胞的细胞种群，这些基细胞具有与原始内胚层相似的形态并且该细胞是上皮样的，即它们具有内皮细胞样形状。基细胞还是暗相的且分界良好(即相邻细胞间有明显的边界)，禾口/或它们可以具有光学显微镜所显示的有角的形状(图19)。在具体实施方案中，本发明涉及含有基细胞的细胞种群，其中至少5%的下述基细胞1.具有与原始内胚层相似的形态，2.是上皮样的，3.通过光学显微镜显示是暗相的和分界良好的，和/或4.通过光学显微镜显示具有有角的形状。具有至少一种下面的特征i)至少1%的细胞表现出短尾蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出a-横纹肌肌动蛋白的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出波形蛋白的蛋白表达，以及iv)至少1%的细胞没有表现出结蛋白的蛋白表达，v)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81和Oct-4。在具体实施方案中，至少5%的基细胞具有五种特征中的至少两种，优选这两种特征是i)和iv)，或它们具有至少三种、四种或所有五种特征。一般来说，对于至少10°/。、例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，这些特征是有效的。在具体实施方案中，本发明的GATA-1是重要的转录因子。GATA-1的功能是特别值得注意的，因为已报道GATA-1参与造血(生血)(Huber和Zon1998,10(2):103-109,SeminImmunol)。这里我们提出GATA-1也可以通过调控发育过程中发生的早期细胞过程来提供心脏发生和造血之间的生物争联系。产生血管细胞和血细胞的成血管细胞，与心脏祖细胞具有相同的发育途径，并且也源自于早期胚胎的中胚层。如上所述，本发明还涉及含有基细胞的细胞种群。这样的细胞种群满足至少特征i)，五种特征中的至少两种，这两种特征优选为i)和iv)，五种特征中的至少三种，五种特征中的至少四种，或细胞种群具有所有五种特征。一般来说，对于至少5%、例如至少10°/。、至少15%、至35少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%的细胞来说，特征i)-v)的每一种都是有效的。基细胞也可以以无外源物形式获得。细胞种群的个体细胞类型的使用被描述在本文的前部或从实施例或所附的权利要求书中显现。在具体实施方案中，本发明涉及含有基细胞和MCP细胞的细胞种群，其中整个细胞种群(即基细胞和MCP细胞)的至少5%表现出Flk-l的基因和/或蛋白表达。赫，用于本发明的起始材料是适合的多能未分化hBS细胞，例如未分化的hBS细胞系。这样的材料可以从CellartisAB获得，也可以通过NIH干细胞登记处http:〃stemcells.nih.gov/research/registrv/获得。CellartisAB有两种hBS细胞系(SA001和SA002)，通过NIH可以获得SA002的一个亚克隆(SA002.5)。那些hBS细胞系被频繁地用于本发明。CellartishBS细胞系SAOOl、SA002、SA046、SA094、SAlll、SA121、SA181、SA191、SA196、SA202、SA218、SA240、SA348、SA352、SA399、SA461、SA502、SA506、SA521和SA540也被MRC(医学研究公会，MedicalResearchCouncil)的英国干细胞库登记处(UKStemCellBankregistry)认可。被推荐用作起始材料的hBS细胞的特征如下对碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、Oct-4阳性，对SSEA-1、端粒酶活性阴性，并且在体外和体内具有多能性(后者由免疫缺陷小鼠中畸胎瘤的形成所显示)。使用前，用作起始材料的hBS细胞系可以源自于进行过表征项目的LOT制备物。hBS细胞系的LOT制备物构成了hBS细胞在培养物中的扩增，随后按照标准化的方法(待审专利WO2004098285)在一个单一传代中冷冻超过100管(straws)，参见本文的实验部分。此外，本文使用的起始材料可以完全没有外源物而衍生，由此可以获得完全无外源物的基细胞、MCP细胞或心肌细胞样细胞，以在再生医学中有潜在的应用。为了无外源物衍生hBS细胞，所有的培养基和基质成分、饲养细胞和其它使用的材料都不可以源自任何非人类动物材料或与其相接触。用于无外源物衍生hBS细胞以及无外源物基细胞、MCP细胞或心肌细胞样细胞的适合成分是无外源物衍生的人类成纤维细胞，例如人类包皮成纤维细胞，无血清或基于人类血清的培养基，其中含有重组生长因子、分化因子和/或可能的其它添加剂，以及用于细胞的离散或繁殖的人类重组酶或者无菌机械工具。./.悬浮獰养基细胞和MCP细胞从未分化的hBS细胞衍生。获得含有基细胞的细胞种群的方法包括下列步骤i)将一个或多个未分化的hBS细胞的集落片或集落在分化培养基中以悬浮培养培养大约1天到大约IO天，例如大约1天到大约6天，ii)将由此培养的细胞转移到培养容器中继续增殖和分化，iii)任选，通过光学显微镜中的形态学标准和/或本文定义的相关标志的鉴定来鉴定基细胞，iv)任选，分离由此获得的基细胞，以及v)任选，重复步骤ii)-iv)。未分化的hBs细胞被维持和繁殖3-6天，例如4-5天。将未分化的细胞分开(例如手动地)，并放置在分化培养基中，例如下面定义的用于悬浮培养的培养基中。细胞在悬浮液中维持1-10天，例如1-8天或l-6天，并转移到例如明胶包被的培养皿中，引起细胞簇的粘附。增殖和分化继续进行大约2-6天，例如4天。从细胞簇出现单层细胞，基细胞可以通过使用例如光学显微镜鉴定(按照本文的讨论)。//微覆桌基细胞和MCP细胞从未分化的hBS细胞衍生。获得含有基细胞的细胞种群的方法包括下列步骤i)将hBS细胞分散并解离到悬浮液中，并将细胞悬浮液分配到多孔组织培养板中，ii)施加离心力强制细胞聚集，iii)将这样的增强的3D成簇细胞在分化培养基中以微孔格式培养大约1到大约20天，例如大约6到大约8天，iv)任选，将这样的3D培养细胞转移到培养器皿中继续增殖和分化，v)任选，通过光学显微镜中的形态学标准和/或本文定义的相关标志的鉴定来鉴定基细胞，vi)任选，分离由此获得的基细胞，以及vii)任选，重复步骤iii)-iv)。步骤i)一般以将多个未分化的hBS细胞集落悬浮在含有或不含血清的分化培养基中开始。适合的分化培养基(例如用于步骤i)的悬浮培养和步骤iii)的强制聚集方法)包括但不限于在实施例1中描述的含有KO-DMEM的分化培养基，其中补充有Glutamax(例如浓度为0.1到2mM,例如1mM)、卩-MeOH(例如浓度为0.01到大约ImM，例如0.1mM)、一种或多种非必需氨基酸(NEAA)(例如浓度为0.1%到大约2%，例如1%)、PeST(例如浓度为0.1到大约2%，例如大约1%)和/或血清例如胎牛血清(例如浓度为5到30%，例如大约20%)，或实施例6中描述的CGM培养基(基本培养基，由35Q/。IMDM和6538%DMEM:F12构成，补充了1%PeST和Glutamax，使终浓度为3.5%FBS、2%B-27、0.1mM卩-MeOH、10ng/mlEGF、20ng/mlbFGF、4nM心营养素-l和40nM凝血酶)，或其组合或变化。在这些情况中，当包含血清时，血清可以是FBS或人类血清。如果有的话，血清的浓度为至少2%，例如从大约2%到大约30%，从大约5%到大约25%或大约20%。在强制聚集方法中，步骤i)(即分散)由酶法处理细胞开始，例如用胶原酶例如胶原酶IV处理。酶的浓度一般在相当于50-500U/mL的范围内。然后将分散的细胞转移到培养基中(例如上述的培养基)并机械解离。在步骤ii)中，以100到1000xg特别是大约400xg进行离心，通常持续适当的时段(例如400xg5min或其对等者)。离心后，将细胞温育5-10天的时段，特别是6-8天。3D簇结构被转移到例如含有培养基的明胶包被的平皿中，并培养2-6天，特别是4天。通常每l-3天更换培养基，例如每两到三天。然后通过形态学以及使用本文描述的具体标志来鉴定基细胞。基潘扁舒生为了能够形成基细胞，本发明人已经发现，重要的是步骤i)的悬浮方法执行相对短的时段。因此，在具体实施方案中，步骤i)执行从大约1到大约6天的时段，例如从大约1到大约4天，从大约1到大约3天，或从大约1到大约2天。在步骤ii)的悬浮方法中，悬浮培养的细胞被铺在培养器皿中或细胞外基质上。可以使用任何适合的器皿，例如多孔格式、培养皿、烧瓶等。优选，细胞粘附于器皿表面，并使用培养基以便细胞继续增殖和分化。细胞可以直接粘附在塑料例如组织培养塑料上，蛋白包被物例如层粘连蛋白、poly-ornitin上，细胞外基质成分例如Matrigel上，或饲养细胞上，或优选在明胶包被的器皿上。在步骤ii)中使用的培养基可以含有或不含血清。如果有血清存在，与上面提到的相同浓度也同样适合用于步骤ii)。培养基可以转换，或同样类型的培养基可用于步骤ii)。适合的培养基包括实施例1中描述的分化培养基和CGM培养基。适合于所用培养基的添加剂是生长因子例如EGF和bFGF以及丝氨酸蛋白酶例如凝血酶。培养基还可以包含IMDM和DMEM:F12，任选补充1%PeST和Glutamax，使终浓度为3.5%FBS、2%B-27、0.1mM卩-MeOH、10ng/mlEGF、20ng/mlbFGF、4nM心营养素-1和40nM凝血酶，如实施例4)中的描述用于富集MCP细胞。一般来说，步骤ii)进行大约2到大约20天的时段，例如大约2到大约15天，大约2到大约10天，大约2到大约6天，或大约2到大约4天。然后基细胞出现，并可以按照本文前面的描述鉴定。基细胞可以通过例如使用锐利的微毛细管或另一种适合的工具进行机械分开，或通过使用例如胶原酶、胰蛋白酶、使用螯合剂例如EDTA进行酶法消化来分离。基细胞可以被重新铺板，并重复步骤ii)-iv)。基细胞或含有基细胞的细胞种群可以被储存，例如通过本文实施例中描述的冷冻或深低温保藏法，用于本文描述的目的。MC尸一银扁脏分离的或未分离的基细胞可用于制备MCP细胞。因此，本发明还涉及制备含有MCP细胞的细胞种群的方法，该方法包括获得基细胞的步骤，例如上面描述的步骤i)-iii)，或可选地，包括使用分离的或未分离的基细胞以及进一步的步骤vi)培养基细胞，直到通过光学显微镜和/或本文描述的相关标志Vii)分离由此获得的MCP细胞。用于基细胞培养以便获得MCP细胞的适合培养基是例如分化培养基或CGM培养基或其组合。培养基可以包含血清(参见上文)，或可以是无血清的。培养基可以转换，或者它可以是同样的培养基。在铺板后大约2到大约25天、例如铺板后大约2到大约20天、大约2到大约15天、大约2到大约10天、大约2到大约5天或大约2到大约4天的时段，MCP细胞簇出现。这些细胞簇可以通过例如使用锐利的微毛细管或另一种适合的工具进行机械分开，或通过使用例如胶原酶、胰蛋白酶、使用螯合剂例如EDTA进行酶法消化来分离。MCP细胞簇还可以在基细胞出现后第1天到第20天之间、例如第5天到第10天之间进行连续轮次的分离，例如1到20次、5到10次。MCP细胞可以被进一步传代培养，用于例如保存、用于心肌分化、用于表征、用于药物发现、用于毒性测试、用于再生医学和/或用于获得基细胞。MC尸潘扁分化此外，MCP细胞可以通过下述进行分化以提供心肌细胞样细胞-i)在一种或多种分化因子例如BMP和FGF家族的生长因子、B-27、5-氮杂脱氧胞苷、DMSO、视黄酸、ASA和抗坏血酸和/或培养基的存在下，将MCP细胞铺于表面上以获得分化的MCP细胞。本发明还涉及试剂盒。上述方面的细节和具体内容对试剂盒提供了必要的修改。具体的实施方案显示在所附的权利要求书中。因此，41本发明的试剂盒可以包括含有基细胞、MCP细胞或从MCP细胞衍生的心肌细胞样细胞的细胞种群，ii)一种或多种成熟因子和/或驱动心肌分化的成熟培养基，以及iii)任选的使用说明书。成熟培养基可以选自VitroHES、添加有bFGF的VitroHES、自体预先调制的VitroHESTM、CGM培养基和其它心肌特异性培养基，一种或多种成熟因子选自FGF例如bFGF、BMP、5-氮杂脱氧胞苷、DMSO、视黄酸、抗坏血酸和ASA。试剂盒还可以包含用于监测成熟的工具。适合的工具可以包括i)针对至少3个、例如至少4个或至少5个表达标志的编码基因的PCR引物，其中表达标志选自未分化hBS细胞的标志、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、短尾蛋白、巢蛋白、GFAP、Islet-l、Nkx2.5、GATA-4、cTnl、cTnT、a-MHC和连接蛋白-43，或i)针对至少3个、例如至少4个或至少5个表达标志抗原的抗体，其中表达标志抗原选自未分化hBS细胞的标志、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、短尾蛋白、巢蛋白、GFAP、Islet-l、Nkx2.5、GATA-4、cTnl、cTnT、a-MHC和连接蛋白-43。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包括i)基细胞和/或MCP细胞ii)任选，用于在体外和/或体内驱动分化的因子iii)用于将细胞施用于患者的工具，或细胞本身处于施用形式，例如即用注射器。在下面的非限制性的实施例和图中对本发明进行了进一步的说明。具体的实施方案出现在本文的条目和权利要求中。附图图1、基细胞的形态A.显示了在铺板后3天，从分化性hBS细胞的粘附簇产生的单层分化性细胞。基细胞生长在类似迷宫的特征性紧密网络中，使得在分化性hBS细胞培养物中基细胞的区域使用光学显微镜容易辨别。基细胞的形态与原始内胚层具有相似性，细胞是上皮样的。此外，单个的细胞是暗相的、分界良好的，通常为有角的形状。图显示了从维持在MEF细胞上的hBS细胞系SA002.5，LOTBE002.5，传代26代获得的细胞。标出了基细胞的典型区域。B.显示了在铺板后8天，从分化性hBS细胞的粘附簇产生的单层分化性细胞。该单层含有基细胞(标出了典型区域)。图显示从维持在MEF细胞上的hBS细胞系SA002.5，LOTBE002.5，传代42代并酶法分离4次获得的细胞。C和D.显示了在铺板后15天，从分化性hBS细胞的粘附簇产生的单层分化性细胞，MCP细胞簇在hBS细胞簇上出现。在C部分中在方形内标出了典型区域。在D部分中，方形标出了基细胞区域，而卵圆形虚线标出了覆盖基细胞的典型MCP细胞簇。图显示了从维持在MEF细胞上的hBS细胞系SA002.5，LOTBE002.5，传代26代获得的细胞。图2.覆盖基细胞的MCP细胞簇形态A-C部分显示了将分化的hBS细胞铺板15天后，MCP细胞生长成小而圆的、亮相的细胞簇，与单层基细胞松散地粘附。它们具有高的细胞核-细胞质比率。细胞簇的典型特点与"带线的气球"类似。MCP细胞簇的形状可以是圆形或细长形。卵形形指出典型的MCP细胞簇。图显示了从维持在MEF细胞上的hBS细胞系SA002.5，LOTBE002.5，传代26代获得的细胞。A部分包括具有"带线的气球"的形^的MCP簇的示意略图。图3.分离和重新铺板的非搏动MCP细胞的形态A.显示了分离后转移到新培养皿的分化培养基(含血清)中6天后，分离的MCP细胞簇的形态。图显示了从维持在MEF细胞上的hBS细胞系SA461，LOTBF461，传代22代获得的细胞。B.显示了分离后转移到新培养皿的分化培养基中7天后，分离的MCP细胞簇的形态。图显示了从维持在HFF细胞上的hBS细胞系SA121,LOTBD121，传代156代+酶法分离10次获得的细胞。C.显示了分离后转移到新培养皿的分化培养基中12天后，分离的MCP细胞簇的形态。图显示了从维持在HFF细胞上的hBS细胞系SA121，LOTBD121，传代156代+酶法分离10次获得的细胞。图4.产生新的基细胞和新的MCP簇的分离和重新铺板的MCP细胞的形态图显示了在不含FBS的分化培养基中分离后1天，分化成新的基细胞的分离的MCP细胞。可以观察到新的MCP细胞覆盖基细胞(由卵形标出)。图显示了从维持在hFF细胞上的hBS细胞系SA002，LOTAL002，传代55代+酶法分离3次获得的细胞，和从维持在MEF细胞上的细胞系SA002.5，LOTBE002.5，传代26代获得的细胞。图5.从MCP细胞衍生的自发收縮细胞的形态图5A-5F显示了从维持在MEF细胞上的hBS细胞系SA002，LOTAL002，传代34代获得的细胞。A.显示了在分化培养基中分离后8天增殖和自发收縮的MCP细胞簇的形态。B.显示了分离后11天的同样细胞簇。C.分离后13天。D.分离后15天。E.分离后18天。F.分离后26天。图6.血清不存在下MCP细胞的分化图6A-6C显示了从维持在hFF细胞上的hBS细胞系AL002传代55代+酶法分离3次获得的细胞，和从MEF细胞上的细胞系SA002.5，LOTBE002.5，传代26代获得的细胞。A.显示了分离的MCP细胞在分离后1天在不含血清的培养基中的典型形态。B.显示了分离的MCP细胞在分离后7天在不含血清的培养基中的典型的均匀的形态。C.显示了分离的MCP细胞在分离后9天在不含血清的培养基中的典型均匀形态。图7.使用Cytospin分离时MCP细胞的直接波形蛋白染色分离后，MCP细胞簇中的波形蛋白表达被立即固定。用DAPI将核染为蓝色，使用TRITC结合的抗小鼠IgGl抗体(SouthernBiotechnology)使波形蛋白(小鼠抗波形蛋白抗体V-6630,Sigma)可视化。细胞系SA002.5,LOTBE002.5，被传代26代；SA002，LOTAL002，传代48代。图8.显示了分化的MCP细胞的免疫组织化学分析获得的结果，细胞为SA002，LOTAL002，传代48代；SA002.5，LOTBE002.5，传代42代+酶法传代4代；SA121，LOTBD121，传代156代+分别酶法传代10和11代；以及SA461，LOT461，传代22代。A.分离后3天，分化的MCP细胞中波形蛋白的表达(小鼠抗波形蛋白抗体V-6630,Sigma)，使用TRITC结合的抗小鼠IgGl抗体(SouthernBiotechnology)进行可视化。用DAPI将核染为蓝色。B.分离后3天，分化的MCP细胞中结蛋白的表达(小鼠抗结蛋白抗体MAB1698,Chemicon)，使用TRITC结合的抗小鼠IgGl抗体(SouthernBiotechnology)进行可视化。用DAPI将核染为蓝色。C.分离后7天，分化的MCP细胞中a-横纹肌肌动蛋白的表达(小鼠抗a-横纹肌肌动蛋白A2172,Sigma)，使用FITC结合的IgM抗体进行可视化。用DAPI将核染为蓝色。D.分离后16天，分化的MCP细胞中Nkx2.5的表达(抗Nkx2.5抗体，SantaCruzBiotechnology)，使用Alexa柳抗兔IgG抗体进行可视化。图9显示了基细胞免疫组织化学分析获得的结果。A.显示了在分化培养基中铺板后36天，培养的基细胞中a-横纹肌肌动蛋白的表达(小鼠抗a-横纹肌肌动蛋白A2172,Sigma)。抗原标志使用FITC结合的IgM抗体进行可视化。使用的细胞系是传代26代的SA002,LOTAL002。B.所有细胞核包括基细胞进行DAPI染色。C.将图A和图B重叠在一起。D.显示了在分化培养基中铺板后15天，培养的基细胞中短尾蛋白的表达(兔抗短尾蛋白sc-20109，SantaCruzbiotechnology)。抗原标志使用Alexa488抗兔IgG抗体进行可视化。使用的细胞系是传代32代的SA002.5,LOTBE002.5。E.所有细胞核包括基细胞进行DAPI染色。F.将图9D和图9E重叠在一起。图D-F中的圆圈表明覆盖基细胞的MCP细胞簇也对短尾蛋白染色阳性。图10和11.在含有B27的培养基中培养的分离和铺板的MCP细胞的形态MCP细胞源自于hBS细胞系SA461，分离的细胞簇转移到新的IVF皿中。然后将细胞维持在含有2。/。B27补充物的无血清培养基中。图10显示了在分离和铺板后第1、2、4、7和10天(被标出)的MCP细胞簇。在第4、7和10天，基细胞的典型外观被标出，图11显示了分离和铺板后10天，MCP细胞的免疫组织化学染色。图显示了形态、DAPI染色和短尾蛋白表达染色。图12.在基细胞中特异性表达的基因的基因表达水平按照实施例3中的描述进行微阵列分析，对表II中列出的基因亚类的基因表达水平进行了作图。Y轴显示了强度单位，与基因表达水平直接成比例。A部分显示了下列的值碱性核蛋白1(BNC1)、肾连蛋白(NPNT)、纤维蛋白原a链(FGA)、膜联蛋白A8(ANXA8)、基质Gla蛋白(MGP)、透明带糖蛋白4(ZP4)。B部分显示了下列的值血栓调节蛋白(THBD)、同源异型框B7(HOXB7)、心脏和神经嵴表达衍生物1(HAND1)、桥粒芯胶蛋白3(DSC3)、白介素6信号转换因子(IL6ST)、水通道蛋白1(AQP1。C部分显示了下列的值巻曲相关蛋白(FRZB)、缓激肽受体B1(BDKRB1)、生长激素受体(GHR)、激酶插入结构域受体(F仪-7)(KDR)。UD-未分化的细胞；MC-除了基细胞或MCP细胞的混合分化细胞，BO基细胞，CMl—人hBS衍生的心肌细胞样细胞，CM2—人hBS衍生的心肌细胞样细胞。图13.在基细胞中以中等水平表达的心肌细胞标志基因的基因表达水平按照实施例3中的描述进行微阵列分析，对心肌细胞标志基因的基因表达水平进行作图。Y轴显示强度单位，与基因表达水平直接成比例。A部分显示了下列的值肌球蛋白重链多肽6(MYH6)、受磷蛋白(PLN)、肌联蛋白(TTN)、GATA结合蛋白6(GATA6)、GATA结合蛋白4(GATA4)、T框5(TBX5)、T框2(TBX2)和辅肌动蛋白a2(ACTN2)。B部分显示了下列的值心肌LIM蛋白(CSRP3)、2型肌钙蛋白T(TNNT2)、肌球蛋白重链多肽7(MHY7)、肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)、肌球蛋白轻链多肽4(MYL4)、肌球蛋白轻链多肽7(MYL7)、原肌球调节蛋白(TM0D1)和肌球蛋白轻链多肽3(MYL3)。C部分显示了下列的值LIM结构域结合3(LDB3)、myozenin2(MY0Z2)、肌酸激酶(CKM)、肌红蛋白(MB)和肌间蛋白1(MY0M1)。UD二未分化的细胞；MC,余了基细胞或MCP细胞的混合分化细胞，BC-基细胞，CM—从hBS衍生的心肌细胞样细胞，CM2-从hBS衍生的心肌细胞样细胞。图14.MCP细胞的MitoFluorTM绿色染料染色图显示了用不同浓度MitoFluorTM绿色染料以不同时间长度染色的MCP细胞。MCP细胞从hBS细胞系SA002和SA002.5衍生，并在培养9-20天后用终浓度为50-200nM的MitoFluorTM绿色染料染色。在一个实验中，将细胞温育15、30和45分钟，然后除去载荷溶液，然后在染色后不同时间点观察荧光。在另一个实验中，染色时间在45分钟到最多19小时间变化，在每个时间点后监测荧光。用200nM染料染色30-45分钟或更长的MCP细胞中的线粒体，在染色后立即或使染料积累延长的时间后特异性显示出明亮的绿色荧光。增加积累时间不能使染色更强或更特异，增加总的染色温育时间也不能。用100nMMitoFluorTM绿色染料处理的细胞需要染色比45分钟更长的时间或使染料积累，以便表现出与使用200nM染料染色相同的图案。这些实验的代表性图片显示在A-D中。A.显示了用200nM染料染色45分钟的MCP细胞的光学显微镜照片。B.显示了用200nM染料染色45分钟的MCP细胞的相应荧光照片；荧光在染色后直接观察。C.显示了用100nM染色19小时的MCP细胞的光学显微镜照片。D.显示了用lOOnM染色19小时的MCP细胞的相应荧光显微镜照片；荧光在染色后直接观察。箭头标出MCP细胞簇。图15.使用实时qPCR进行的培养在MEF上的hBS细胞衍生的MCP细胞的基因表达分析MCP细胞簇从维持在MEF细胞上的hBS细胞系SA002衍生。在将从分化性hBS细胞形成的3-D细胞簇铺板于96孔板后9-18天，通过机械分开松散粘附的细胞簇收获MCP细胞。使用实时RT-PCR测定特定基因的mRNA水平。-值被表示成相对基因表达，其中未分化的对照被设为100%。每个组进行一次观测，除了MCP，其值是三次不同观测的平均值+SE。A部分显示了Oct-4、Nanog、Notch-l、Islet-l(ISL隱1)和Flk-l(KDR)的基因表达水平。B部分显示了Nkx2.5、GATA-4、肌钙蛋白T2、CD31和ACTA2的基因表达水平。UD-未分化细胞；MC-除了基细胞或MCP细胞的混合分化细胞。图16.使用实时qPCR进行的培养在hFF上的hBS细胞衍生的MCP细胞的基因表达分析MCP细胞簇从维持在hFF细胞上的hBS细胞系E3-SA002衍生。在hFF培养系统中，只收获松散粘附的MCP细胞簇(将形成的3D细胞簇铺板于96孔板后9-18天)。使用实时RT-PCR测定特定基因的mRNA水平。值被表示成相对基因表达，其中未分化的对照被设为100%。A部分显示了Oct-4、Nanog、Notch-l、Islet-l(ISL-1)和Flk-l(KDR)的基因表达水平。图B显示了Nkx2.5、GATA-4、肌钙蛋白T2、CD31和ACTA2的基因表达水平。UD-未分化细胞；MC^^余了基细胞或MCP细胞的混合分化细胞。hFF-人类包皮成纤维细胞。图17.基细胞中hBS细胞标志基因的基因表达水平按照实施例3中的描述进行微阵列分析，对Oct-4和Nanog的基因表达水平进行作图。Y轴显示强度单位，与基因表达水平直接成比例。UD-未分化的细胞；MC^余了基细胞或MCP细胞的混合分化细胞，BC:基细胞，CM1:从hBS衍生的心肌细胞样细胞，CM2:从hBS衍生的心肌细胞样细胞。图18.覆盖基细胞的MCP细胞簇形态A部分来自图2，但是包括具有"带线的气球"形态的MCP簇的示意略图。图19.基细胞的形态与图1中的D部分相似，并显示了具有有角形状的基细胞的形态。方法与材料与实验部分中使用的材料有关的具体细节在后面的部分中给出。使用了下面的縮写DAPI是指4',6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐水合物，是用于细胞核可视化的试剂。DMEM是指细胞培养基本培养基Dulbecco改良Eagle培养基。FITC是指荧光素异硫氰酸酯，通常用作第二抗体的结合物，用于使免疫反应可视化。Glutamax或(Glutamax)是指谷氨酰胺替代物，通常用于添加到细胞培养基中。IMDM是指Iscove改良Dulbecco培养基。PEST是指青霉素和链霉素的混合物，用作抗菌细胞培养添加物。SCID小鼠是指重症联合免疫缺陷小鼠。TRITC是指四甲基若丹明异硫氰酸酯，通常用作第二抗体的结合物，用于使免疫反应可视化。TrypLESelect是指酶胰蛋白酶(通常源于猪)的重组非动物替代物，由InvitrogenCorp销售。方法起始材料用于本发明的起始材料是适合的多能未分化hBS细胞，例如未分化的hBS细胞系。这样的材料可以从CellartisAB获得，也可以通过NIH干细胞登记处http:〃stemcells.nih.gov/research/registry/以及英国干细胞库获得。CellartisAB有两种hBS细胞系(SA001和SA002)，通过NIH可以获得SA002的一个亚克隆(SA002.5)。CellartishBS细胞系SAOOl、SA002、SA046、SA094、SAlll、SA121、SA181、SA191、SA196、SA202、SA218、SA240、SA348、SA352、SA399、SA461、SA502、SA506、SA521和SA540也被MRC(医学研究公会)的英国干细胞库接受。那些hBS细胞系已经被频繁地用于本发明。被推荐用作起始材料的hBS细胞的特征如下对碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、Oct-4阳性，对SSEA-1、端粒酶活性阴性，在体外和体内具有多能性(后者由免疫缺陷小鼠中畸胎瘤的形成所显示)(方法和方案按照以前的描述，Heins等，WO03055992)。获得适合的起始材料的4种不同方式描述如下1.hBS细胞系的建立和LOT制备2.无外源物制备3.酶法传代hBS细胞4.hBS细胞转移到无饲养细胞的培养系统中当MCP细胞用于治疗目的时，无外源物的制备是特别重要的。!.￡。r劍絲表腿,hBS细胞系的LOT制备构成hBS细胞在培养物中的扩增和随后进行玻璃化冷冻，这意味着按照标准化方法(待审专利WO2004098285)在一个单一传代中将超过100个细管速冻到晶体状态。在冷冻之前和之后、以及在将细胞从LOT融化后在后续培养的连续传代中，对hBS细胞系的形态进行监测。LOT冷冻的质量通过检査融化恢复率来证实。然后对细胞和冷冻传代中的培养基进行关于微生物安全性和人类病毒的安全性测试，以确保细胞没有受到污染。进行的表征程序包括广泛的证实hBS细胞系的分化状态的方法。首先进行未分化细胞的普遍接受标志(SSEA-l、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81、Oct-4和ALP)的标志表达分析。经过传代和冻融循环的细胞的基因组稳定性通过核型分析和FISH进行研究。使用reloTAGGG端粒酶PCRPLUSELISA试剂盒测量端粒酶活性。hBS细胞的多能性以经过胚状体步骤的体外分化和通过将hBS细胞移植到免疫缺陷SCID小鼠的肾包膜下的体内分化来检测。么无颜激劍备此外，本文使用的起始材料可以完全无外源物地衍生，由此可以获得在再生医学中具有应用潜力的完全无外源物的MCP，并且非常显著地降低移植物排斥的风险和非人类病原体的潜在转移。对于hBS细胞的无外源物衍生来说，所有的培养基和基质成分、饲养细胞以及使用的其它材料都不可以源自于或与任何非人类动物材料相接触。用于hBS细胞以及无外源物的MCP的无外源物衍生的适合成分是无外源物衍生的人类成纤维细胞，例如人类包皮成纤维细胞，含有人类重组生长因子、分化因子和/或其它可能的添加物的无血清或基于人类血清的培养基，以及用于解离和繁殖细胞的人类重组酶或无菌机械工具。下面描述了适合的程序。无外源物的hBS细胞的获得和培养在得到知情同意书以及GSteborg大学的当地伦理委员会批准之后，受捐来自临床体外受精(IVF)治疗的多余人类胚胎。将捐献的胚胎在传统用于IVF治疗的培养基中培养成胚泡，直到5日龄。胚泡按照Gardner被分级为4AA，按照WO2003055992分级为A等胚泡(增殖的胚泡，具有许多不同的紧密堆积的ICM细胞和有许多细胞的粘结的滋养外胚层)。胚泡用酸性台氏液(Medicult)溶液(即用浓度)在室温处理15-30秒，以除去透明带和部分滋养外胚层，然后将内部细胞簇的细胞放置在无外源物血清中丝裂霉素C失活的无外源物人类包皮成纤维细胞饲养细胞上，无外源物血清含有DMEM，渗透压为大约270mOsm/kg，补充有20%(v/v)人类血清、4ng/mL人类重组bFGF、P/o青霉素-链霉素、1%Glutamax、0.5mmo1/1p-巯基乙醇和1%非必需氨基酸(GibcolnvitrogenCorporation)。然后将胚泡在37。C、5%C02的空气中温育。每2-3天更换50%的培养基，10天后，将细胞机械传代到新鲜的hFF饲养细胞中。从第二次传代开始，hBS细胞(细胞系SA611)已经使用玻璃毛细管作为切割和转移工具进行机械传代。它们大约每星期传代一次，已经培养了超过11次传代。hBS细胞系SA611使用上面描述的程序获得，并已经经历超过30次的传代。乂类包皮成,遂翁應銜养潘逾系f银浙潘應系A/^FWW游蘑J将从8周龄男孩包皮环切术获得的人类包皮样品无菌收集在含有2X庆大霉素的无菌IMDM(Invitrogen)中。皮肤外植体放置在25cm2primada组织培养瓶(BectonDickinson)中，瓶中含有IMDM培养基(Invitrogen)、1%青霉素-链霉素(GibcoInvitrogenCorporation)禾口10%人类血清。在大约10天后，建立起汇合的单层。使用TrypLESelect(Invitrogen)将细胞连续传代。增殖后，对它们进行针对人类病原体标准组的测试(支原体、1和2型HIV、B和C型肝炎、巨细胞病毒、l和2型单纯性疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、人类乳头瘤病毒)。喊智層腳吝在将无外源物的人类成纤维细胞词养细胞铺板之前，将组织培养孔用0.1。/。重组人类明胶(Fibrogen)在室温包被至少1小时。然后将在IMDM、I0。/。人类血清和1。/。青霉素-链霉素中生长的无外源物hFF003(传代5到8次)细胞的汇合单层用丝裂霉素C(Sigma)处理2.5小时。将丝裂霉素C处理过的饲养细胞铺在IVF孔上(BectonDickinson),培养基中每2.89cm2200000个细胞，培养基基于DMEM(如上)，补充有10%(v/v)人类血清、1%青霉素-链霉素、1%Glutamax、0.5mmo1/1卩-巯基乙醇和1%非必需氨基酸(GibcoInvitrogenCorporation)。在放置带有内层细胞簇细胞以及从其衍生的细胞或hBS细胞的胚泡之前，将培养基更换成DMEM(如上)，现在替代补充有20。/。(v/v)人类血清、10ng/mL人类重组bFGF、1%青霉素-链霉素、1%Glutamax、0.5mmo1/1卩-巯基乙醇和1%非必需氨基酸(GibcoInvitrogenCorporation)。(与上述的无外源物hBS细胞的获得和培养中的培养基相同)。基于血清的培养基的制备人类血清从至少15个健康个体(Blodcentralen,Sahlgrenska大学医院)的血样获得，血液收集在无肝素涂层的塑料袋中，在大约8°C过夜，由此使得血清可以与凝固的物质分开。将血清进一步无菌过滤、合并，分成适当的部分冷冻。(在使用前，血液在瑞典Blodcentralen针对标准的病原体组进行了测试，包括B和C型肝炎、HIV、HTLV和梅毒。)进一步通过将20。/。(v/v)融化的血清与上面在无,/蕭激/^S一银媳游莸淳浙潜养中描述的其它成分一起加入到DMEM(如上)中，制备培养基。通过无外源物hBS细胞的玻璃化进行冷冻和融化hBS细胞系SA611按照WO2004098285中描述的方法进行冷冻。制备了两种溶液A和B(溶液A:无菌过滤的10%乙二醇、10。/。DMSO在Cryo-PBS中；溶液B:无菌过滤的0.3M海藻糖、20%乙二醇、10%DMSO在Cryo-PBS中)。按照与常规传代时切割细胞相同的方式使用干细胞切割工具(StemCellCuttingTool)(SwemedLabsInternational,Billdal,瑞典)切割选定的hBS细胞系SA611的集落。将细胞块首先在500ml预热(37°C)的溶液A中温育1分钟，然后转移到25ml溶液B中并温育30秒，然后再转移到新鲜的溶液B液滴中温育30秒。体积为大约40-50^1。将细胞块吸取到为玻璃化而制备的细管中，然后将细管用粘结剂(bond)封闭。然后将细管投入到液氮中。几天后，按照描述将含有冷冻SA611的细管融化制备两种溶液C和D(溶液C:无菌过滤的0.2M海藻糖在Cryo-PBS中；溶液D:无菌过滤的O.IM海藻糖在Cryo-PBS中)。将溶液C和D以及hBS培养基在37。C预热。将含有玻璃化的SA611的封闭细管从液氮罐中取出。将细管在室温保持10秒，然后在40。C水浴中快速融化(在几秒内)。使用一把热压处理过的剪刀在塞住的一端将细管切开，使用注射器将内含物从细管中推出到溶液C中。将hBS细胞在500pl溶液C中温育1分钟，转移到500pl溶液D中并温育5分钟。的血清的培养基中快速漂洗，然后接种于培养皿中基于血清的培养基中无外源物人类成纤维细胞饲养细胞的上面。然后培养细胞(在37。C温育)，对建立的新集落数量进行计数和传代，以证实玻璃化后hBS细胞的生存力。无外源物hBS细胞系的表征到目前为止，无外源物的SA611细胞系还没有经历过任何LOT制备以及相关的表征(如上所述)，但是在下面的段落中描述了到目前为止进行的仍然是相当完全的表征。将hBS细胞集落培养物固定在4%低聚甲醛中，然后进行通透化。经过连续的清洗和阻断步骤后，将细胞与第一抗体在4°C温育过夜。使用的第一抗体是对Oct-4、TRA-l-60、TRA-l-81、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4特异性的(SantaCmzBiotechnology;SantaCruz,CA;http:〃www.southernbiotech.com)。使用FITC-或Cy3-结合的第二抗体进行检观!J。细胞核用DAPI(Vectashield;VectorLaboratories,Burlingame，CA;h加:〃www.vectorlabs.com)复染。碱性磷酸酶(ALP)的活性按照制造商的方案测定(Sigma-AldrichStockholm,瑞典；http:〃www.sigmaaldrich.com)。为了鉴定来自三种不同胚层的细胞，使用下列抗体按照上面的概述进行免疫组织化学分析对于内胚层细胞使用了HNF3p(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz;http:〃www.southernbiotech.com)。中胚层细胞通过ASMA(公司)检测，外胚层细胞通过P-微管蛋白-IIImAb(Sigma-Aldrich)鉴定。碱性磷酸酶(ALP)反应使用商业试剂盒并按照制造商的方案检湖ij(Sigma-Aldrich)。在未分化的集落中检测到了针对ALP、Oct-4、Tml-60、Tra1-8155和SSEA-4的阳性反应，而SSEA-1是阴性的。将指定进行遗传表征的hBS细胞重新转移到小鼠胚胎成纤维细胞上传代2次，或转移到Matrigel板(BectonDickinson)上并继续培养大约10天。然后将细胞在存在花萼海绵诱癌素A(CalyculinA)下温育，离心收集，通过低渗处理裂解，并使用乙醇和冰醋酸固定。使用胰蛋白酶-Giemsa或DAPI染色使染色体可视化。对于荧光原位杂交(FISH)分析来说，使用了可商购的含有针对12、13、17、18、20、21号染色体和性染色体(X和Y)的探针的试剂盒，按照制造商的说明书并进行了少量改动。载玻片在装备有适合的滤光片和软件的倒置显微镜(CytoVision;AppliedImaging;SantaClaraCA;http:〃www.叩pliedimagingcorp.com)下分析。在第9-10次传代时X寸hBS细胞系SA611进行遗传表征。通过核型分析证实了hBS细胞系SA611具有二倍体正常核型。核型为46XY。对于选定染色体的FISH分析证实了这个发现。SA611的核型被证实是正常的。SA611的多能性首先通过令hBS细胞集落在饲养细胞上自发分化、或将未分化的hBS细胞集落转移到Matrigel包被的板(BectonDickinson)上使它们自发分化来测试。在这两种情况下，当将要诱导分化时，将培养基转换成VitroHES(Vitrolife,Kungsbacka,瑞典)。培养3-4周后，通过免疫组织化学分析集落，以便从三种不同胚层中鉴定细胞。鉴定到了针对早期内胚层标志HN3(3(有时也被称为Foxal)、外胚层标志P-微管蛋白和ASMA(a-平滑肌肌动蛋白)的阳性反应。丄蘼法传/e游/^s欲應在本程序中，人类成纤维细胞饲养细胞不必需是无外源物的。因此，可以使用不同的程序获得饲养细胞。下面描述了两种不同的方法，实际选择的方法可以与培养条件的要求相关，即无外源物培养条件是否是希望的或甚至是必需的。乂类包皮成纤楚漱應銜养潘應游潜荞可商购的hFF从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(CRL-2429ATCC,Manassas,VA)获得，被培养在Iscove，sDMEM(GibcoInvitrogenCorporation,Paisley,苏格兰；http:〃www,invitrogen.com)中，其中补充了10%FBS(Invitrogen)禾口1°/。青霉素-链霉素。使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将细胞按1:2至U1:8分拆，进行定期(每周)传代。将HFF的汇合单层用丝裂霉素C(Sigma)处理(10|ig/ml，2.5小时)，以70000-80000个细胞/cm2的密度铺在0.1。/。明胶(Sigma)包被的IVF皿上的VitroHES培养基中，培养基补充有4ng/ml人类重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF,Invitrogen)。在第4次和12次传代之间的hFF细胞被用作词养细胞。hFF细胞系及其随后的饲养细胞层的制备可以按照上面无外源物制备下的描述进行。y孕磁雄存移娜兹微荐歸按照以前[Heins,Noakssson]和WO03055992的的描述，建立了hBS细胞系SA001和SA121(CellartisAB，G。teborg,瑞典，http:〃www.cellartis.com)并进行了表征。在实验之前，细胞系在IVF皿中被维持补充了4ng/mlhrbFGF的VitroHES培养基(VitrolifeAB,Kungsbacka,瑞典，http:〃www.vitrolife.com)中用丝裂霉素C失活的mEF饲养细胞层上，通过使用微型毛细管作为切割和转移工具进行手工切割。为了将hBS细胞从传统培养转移到酶法解离，将用过的培养基除去，用PBS(Invitrogen)将培养皿清洗一次。然后在每个IVF皿中加入体积为0.5mL的TrypLESelect(Invitrogen)或胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)。将培养皿在37°C温育，直到hBS细胞集落的外部区域开始从饲养细胞层集拢。然后通过用移液管反复碾碎将细胞层打散成单细胞悬浮液，转移到离心管中，以400g离心5分钟。弃去上清液，将hBS细胞沉淀重新悬浮在新鲜的VitroHES培养基中，将单细胞悬浮液接种到含有失活的hFF的致密饲养细胞层的IVF皿中。嚴屑卓潘應,着浮i传/e游A朋漱應蘑兹繁遭对于酶法繁殖来说，将hBS细胞维持在由高密度hFF饲养细胞和补充有4ng/mlhrbFGF的VitroHES培养基组成的培养系统中。通过除去培养基并用PBS(Invitrogen)清洗培养皿开始进行酶法解离。然后在每个培养皿中加入体积为0.5mL的TrypLETMSelect(Invitrogen)或胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)。将培养皿在37°C温育，直到hBS细胞集落的外部区域开始从词养细胞层集拢。然后通过用移液管反复碾碎将细胞层打散成单细胞悬浮液。然后将细胞悬浮液转移到离心管中，以400g离心5分钟。弃去上清液，将hBS细胞沉淀重新悬浮在新鲜的VitroHES培养基中。然后以1:5到1:500的分拆比例将细胞接种到含有失活的hFF的致密饲养细胞层的新鲜IVF皿中。在所谓的调整过程中，在新系统中第一次传代期间，使用较低的分拆比例。在不超过5次传代后，将hBS细胞系以1:20到1:500的分拆比例分拆。培养物被维持在37°C和95%湿度的培养箱中。每2-3天将用过的培养基用新鲜的VitroHES+4ng/mlhrbFGF替换。根据个体hBS细胞系的生长速度，将细胞每6-12天进行传代。细胞系SA001和SA121都已经被培养了超过20次传代，并维持了正常的核型，并进一步在它们补充有10%DMSO的正常培养基中按照常规的缓慢冷冻方法进行冷冻和融化。蘼法传/f游/^S潘應游表,hBS细胞培养物在4%低聚甲醛中固定15分钟，在0.5%trition溶液(Sigma-Aldrich)中通透化5分钟，然后用含有5%FBS的PBS(Invitrogen)阻断。将细胞与第一抗体溶液在4°C温育过夜。使用的第一抗体是对Oct-4、TRA-l-60、TRA-l-81、SSEA-l、SSEA-3和SSEA-4特异性的(SantaCruzBiotechnology;SantaCmz，CA;htt。:〃www,southernbiotech.com)。与FITC-或Cy3-结合的第二抗体(JacksonImmunoreserachLaboratories)在室温温育60分钟。细胞核用DAPI(Sigma)复染。碱性磷酸酶(ALP)的活性使用碱性磷酸酶58活性检测试剂盒按照制造商的说明书测定(Sigma-Aldrich)。染色使用NikonEclipseTE-2000U荧光显微镜进行评估和记录。SA001和SA121在超过20次传代后都显示出所有上述的hBS细胞特征。对于核型分析来说，将hBS细胞在秋水仙酰胺的存在下温育，胰蛋白酶化，固定并安装在玻璃载玻片上。通过DAPI染色使染色体可视化，使用装备有适合的滤光片和软件的倒置显微镜(CytoVision;AppliedImaging;SantaClaraCA;http:〃www.a.ppliedimagingcorp.com)进行安排和记录。对于荧光原位杂交(FISH)分析来说，使用了可商购的含有针对12、13、17、18、21号、X和Y染色体的探针的试剂盒，按照制造商的说明书并进行少量改动。载玻片在装备有适合的滤光片和软件的倒置显微镜(CytoVision)下分析。SA001和SA121在本系统中培养传代超过20次后，都显示出正常的核型。在甚至更多次传代后，FISH证实是正常的。多能性按照以前的描述[Heins等]通过SCID小鼠中畸胎瘤的形成来评估。简单来说，将未分化的hBS细胞集落机械切割成200x200卞m的片，通过外科手术放置在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(C.B-17/lcrCrl-scidBR;CharlesRiverLaboratories)的肾包膜下。8周后将小鼠处死，切出肿瘤并固定在4%低聚甲醛中。对苏木精和曙红染色的石蜡切片进行组织学评估，评估从所有三种胚胎胚层衍生的分化的人类组织，例如神经外胚层、软骨和内脏样上皮的存在。在从本系统中培养传代超过20次的SA001和SA121产生的畸胎瘤中，所有三种胚层都得到了证实。无外源物细胞系，例如SA611,当然能够以与本节上面描述的相同方式被转移到酶法传代系统中并进行传代培养。A议欽趁存椤教无銜泰潘蘼游荐养f资^游/^S潘應其它可以用于本发明的hBS细胞的例子是以前已经被转移到无饲养细胞的培养系统中的hBS细胞(『02卯4卯93W浙》》gre^厶wwow五等J。然后可以将hBS细胞的集落解离成片，这可以使用适合的酶例如胶原酶诸如胶原酶IV，或使用例如玻璃毛细管作为切割和转移工具的机械分离，然后进行在下面的实施例部分中描述的方法。实施例实施例l从未分化hBS细胞衍生基细胞,最浮潜泰将未分化的hBS细胞在体外维持和繁殖。在传代后第4-5天，使用干细胞切割工具将未分化的hBS细胞集落进行手工分幵，并放置在分化培养基(KO-DMEM，补充有1mMGlutamax、O.lmM卩-MeOH、1%NEAA、P/。PeST和20%FBS)中悬浮培养。将细胞在悬浮液中维持l-6天，然后转移到明胶包被的组织培养皿中，导致分化的细胞簇粘附以及细胞的持续增殖和分化。铺板后4天，分化的hBS细胞的粘附簇出现了单层细胞。这些细胞生长在外观类似迷宫的特征性紧密网络中，使得使用光学显微镜时基细胞的区域易于辨别。基细胞的形态与原始内胚层具有相似性，细胞是上皮样的。此外，每个细胞是暗相的、分界良好的，通常是多角的形状。(屋示在愿/,覆桌基细胞还可以使用另一种本文描述的方法从未分化的hBS细胞获得。将未分化的hBS细胞在体外维持和繁殖。在传代后第4-5天，通过用胶原酶IV(200U/ml)在37。C温育10-15分钟，将未分化的hBS细胞集落与词养细胞层分离。将细胞悬浮液转移到15ml试管中，在细胞沉淀后，除去上清液。将集落重新悬浮在补充有20。/。FBS、1%青霉素-链霉素、1%Glutamax、0.5mmo1/1(3-巯基乙醇和1%非必需氨基酸(都来自Invitrogen,Carlsbad,California)的KnockOutDMEM中，使用移液管机械解离成小细胞簇(0.2-0.4mm)。将该细胞悬浮液分配(200jil/孑L)到96孔v型底的板中(Corningincorporated,NY，USA)，浓度为每孔大约4-6个集落，并以400xg离心5分钟。然后将板在37°C温育6-8天。然后将形成的3D结构转移到明胶包被的含有培养基(与上述相同)的培养皿中。在铺板后4天，从分化的hBS细胞的粘附细胞簇出现了基细胞。每2到3天更换培养基。实施例2基细胞的表征基细胞按照上面的描述从未分化的hBS细胞衍生。将它们培养在分化培养基中(KO-DMEM，补充有1mMGlutamax、0.1mM卩-MeOH、1%NEAA、1。/。PeST和20%FBS)，最多达37天。在不同时间点将细胞固定在PFA中，通过免疫组织化学进行评估(A^"^yo"寧S/ew。使用的抗原标志是波形蛋白、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白和短尾蛋白。基细胞表达a-横纹肌肌动蛋白和短尾蛋白f凰W但是不表达波形蛋白和结蛋白。使用的细胞系是SA002,LOTAL002(传代26次);SA002.5,LOTBE002.5(传代32次)禾。SA461,LOTBF461(传代33次)。表I概述了基细胞的IHC分析获得的结果。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>*表示将分化性hBS细胞簇或片在明胶包被的培养皿中铺板后分化的天数。根据形态的目测特征，基细胞类似内皮细胞。为了研究可能的内皮细胞相关性，将基细胞暴露于1,1'-双十八烷基-3,3，3',3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸酯(Dil)-标记的乙酰化LDL(Dil-AcLDL)。该染料标记血管内皮细胞和巨噬细胞，并可以用于在混合的细胞种群中特异性鉴定这些细胞。基细胞和MCP细胞按照上面的描述从未分化的hBS细胞衍生。用于衍生的细胞系是SA002,LOTAL002(传代27次)。在培养3-27天后，将含有混合细胞包括基细胞和MCP细胞的细胞皿用含有10g/mlDil-AcLDL(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的分化培养基(KO-DMEM，补充有1mMGlutamax、0.1mM卩國MeOH、1%NEAA、1%PeST和20%FBS)在37°C处理4个时。将细胞用温热(37°C)的PBS清洗3次，在荧光显微镜中检查掺入的染色。在这些条件下对基细胞和MCP细胞都没有观察到特异性染色。这表明这些细胞不是分化的内皮细胞。但是，这些细胞仍然构成不能被Dil-AcLDL染色的更早期和更不成熟形式的内皮细胞。实施例3.基细胞的微阵列分析潘應潜^,分化按照上面实施例1强制聚集中的描述，将hBS系SA002(CellartisAB，GSteborg，瑞典，http:〃www.cellartis.com)繁殖，并将细胞分化成基细胞。使用光学显微镜鉴定基细胞簇，并使用干细胞工具进行机械分离。出于比较的目的，在微阵列实验中，收集未分化的hBS细胞样品、来自分化的hBS细胞的混合种群的样品(即没有基细胞存在)和来自从hBS细胞衍生的自发收縮性心肌细胞样细胞的样品(Norstr6m等，2006，Kehat等，2001)，并将它们包含在分析中。样品1.未分化的hBS细胞(传代33、36、37、39和40次)2.基细胞(传代22、23、26-28、32、33、36和37次)3.分化的hBS的混合种群(传代22、28和32次)4.心肌细胞样细胞l(传代23-25、29和35次)5.心肌细胞样细胞2(传代39-41次)扁微微,实毅使用RneasyMini试剂盒(Qiagen)从细胞提取总RNA，然后将它用于微阵列实验，该微阵列使用了靶向54,675个转录物的GeneChip⑧人类基因组U133Plus2.0(AffymetrixInc,SantaClara,CA,USA)。RNA样品使用双循环体外转录(IVT)进行扩增。分别使用Agilent2100生物分析仪和NanodropND-1000测量RNA的质量和浓度。按照GeneChip⑧表达3'-扩增试剂双循环cDNA合成试剂盒"的说明书(AffymetrixInc,SantaClara,CA，USA)处理总RNA,以产生双链cDNA。将它用作模板，按照制造商的说明书产生生物素耙向的cRNA。15微克生物素标记的cRNA被片段化，成为长度在35到200碱基之间的链，其中10微克使用标准程序在GeneChip⑧杂交炉6400中在GeneChip人类基因组U133Plus2.0(AffymetrixInc,SantaClara,CA,USA)上杂交过夜。清洗阵列，然后在GeneChipFluidicsStation450中染色。使用GeneChip扫描仪3000进行扫描，使用GeneChip⑧操作软件进行图像分析。SwegeneMARC(http:〃www.swegene.org/microarray/index.html)进行质量控制、RNA处理和阵列的杂交。将代表未分化hBS细胞、基细胞和分化的hBS细胞的混合种群的样品与阵列杂交。阵列被重复运行两次。出于其它的比较目的，代表源自于未分化hBS细胞的自发收縮性心肌细胞样细胞的两个样品也通过微阵列进行分析。这些样品分别被命名为CM1和CM2。为了定义在基细胞中上调的基因家族，计算了未分化的hBS细胞和基细胞之间基因表达的倍数变化(FC)。在所有样品中被MAS软件称为不存在的基因被过滤掉，不包含在进一步的分析中。在样品中有17，436个探针被称为不存在。首先，计算基细胞的FC值。将平均FC值<2的基因从数据组中过滤掉，只有剩下的基因被考虑用于进一步分析。为了鉴定在基细胞中而不在混合的分化hBS细胞种群或CM1和CM2样品中特异性上调的基因，计算了下面的参数1)基细胞与非分化的hBS细胞之间基因表达的倍数变化(FC)(FCBC)2)混合的分化hBS细胞和未分化hBS细胞之间基因表达的FC(FCMC)3)心肌细胞样细胞和未分化hBS细胞之间基因表达的FC(FCCM)。计算中使用了两种心肌细胞样细胞制备物的平均值。然后使用了下面的策略来分拣出仅仅在基细胞中特异性上调的基因1)在基细胞中表达值<100的基因被除去。2)FCBC<3的基因被除去。3)FCBC/FCMC比率<5的基因被除去。4)FCBC/FCCM比率<3的基因被除去。剩余的125个基因列于表II中，它们代表了基细胞的适合的标志基因。为了进一步强调和说明这组基因的特征性基因表达模式，在图12中也对基因的亚组进行了作图。与上述的标准相似，图12中基因是基于绝对的基因表达水平以及与参比细胞种群(即非分化hBS细胞、混合的分化hBS细胞和从hBS细胞衍生的心肌细胞样细胞)相比的倍数变化(FC)选择的。除了一个基因(ZP4)之外，所有的基因都显示出超过500的基因表达水平。ZP4是由于其特异性(即在参比细胞种群中惊人低的表达)而包括在内的。此外，图12中的基因显示出FCBC>20和FCBC/FCMC比率>7，这代表了比编撰表II所使用的标准更严格的入选标准。此外，某些基因以前也已经与胚胎发育相关联(例如DSC3、AQP1、ZP4、FRZB、HAND1)。值得注意的是，与在未分化hBS细胞相比，Oct-4和Nanog的基因表达水平在混合的分化细胞、基细胞和心肌细胞样细胞(CM1和CM2)中被显著下调(图17)，进一步证实了细胞制备物的分化表现型。表II.在基细胞中被特异性上调的基因汇总。表中所有的FC值如上所述是相对于未分化hBS细胞计算的。基因是根据FCBc值的递减顺序分类的。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>(FGA)、膜联蛋白A8(ANXA8)、基质Gla蛋白(MGP)、透明带糖蛋白4(ZP4)、血栓调节蛋白(THBD)、同源异型框B7(HOXB7)、心脏和神经嵴表达衍生物1(HAND1)、桥粒芯胶蛋白3(DSC3)、白介素6信号转换因子(IL6ST)、水通道蛋白1(AQP)、巻曲相关蛋白(FRZB)、缓激肽受体B1(BDKRB1)、生长激素受体(GHR)和激酶插入结构域受体(F仪-7)(KDR)。此外，在基细胞中鉴定了表明早期心肌发生程序启动的基因，这些基因的表达水平显示在图13中。出现的基因是肌球蛋白重链多肽6(MYH6)、受磷蛋白(PLN)、肌联蛋白(TTN)、GATA结合蛋白6(GATA6)、GATA结合蛋白4(GATA4)、T框5(TBX5)、T框2(TBX2)、辅肌动蛋白a2(ACTN2)、心脏LIM蛋白(CSRP3)、2型肌钙蛋白T(TNNT2)、肌球蛋白重链多肽7(MHY7)、肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)、肌球蛋白轻链多肽4(MYL4)、肌球蛋白轻链多肽7(MYL7)、原肌球调节蛋白(TMOD1)、肌球蛋白轻链多肽3(MYL3)、LIM结构域结合3(LDB3)、myozenin2(MYOZ2)、肌酸激酶(CKM)、肌红蛋白(MB)和肌间蛋白1。值得注意的是，这些基因在未分化的hBS细胞和在分化的hBS细胞的混合种群中以低水平表达。但是，它们在基细胞中以中等水平表达，在心肌细胞样细胞制备物(CM1和CM2)中高表达。归结到一起，这些数据证明，基细胞尽管具有不成熟的表现型，但具有起始的分子过程，表明了朝向心肌细胞谱系分化的能力。实施例4.在基细胞中上调的基因的启动子分析为了鉴定表II中列出的基因的共同调控元件，研究了这些基因的启动子区域。汇集对应于这些基因的RefSeqID(mRNA转录物标识符)，并用作输入值输入到使用缺省设置(Halees等NucleicAddsRes2003，31:3554-3559)的工具PromoSer(http:〃cagt.bu.edu/page/Promoserabout)中。从140个转录本中可以提取出满足具体质量标准的在编码序列上游1000bp和下游50bp之间的启动子序列。使用设计用于在来自共调控基因的成组序列中发现转录结合位点的Weeder算法(http:〃159.149.109.16:8080/weederWeb/)(Pavesi等，NucleicAcidsRes2004,32:W199-203)，扫描这些启动子序列的共同基序。为了进一步研究通过该算法鉴定的共同基序是否与人类基因组中实验验证的结合位点相匹配，使用工具PatchTM(http:〃www.gene-regulation.com/cg;i-bm/pub/programs/patch/bin/patch.cgi)，将"分值"阈值设定为80，"允许的误配"设置为1，将通过Weeder鉴定的基序对Transfac⑧数据库进行搜索。只考虑来自人类基因组的匹配基序，并报告在表III中。我们也研究了通过Transfac⑧鉴定的结合位点是否具有已知相关的蛋白，它们显示在表III的"结合因子列"中。TableIII.基序分析结果的汇总。对应于表II中列出的基因，提取出140个启动子区域。使用Weeder算法鉴定了5个基序，分别针对85%匹配和90%匹配计算每个基序在这些140个启动子中出现的数量。针对Transfac搜索这些基序，匹配的人类基序标识符列于"基序标识符"列中。也研究了这些基序在Transfac中报告的己知结合因子，它们列于"结合因子"列中。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>基细胞的深低温保藏从未分化的hBS细胞衍生并通过目测观察下机械分幵而分离的基细胞，可以用酶例如胶原酶、分散酶或胰蛋白酶解离成较小的细胞簇，并使用标准的缓慢冷冻技术或在封闭的细管中玻璃化(WO2004098285)进行深低温保藏。实施例6从未分化的hBS细胞衍生MCP细胞未分化的hBS细胞在体外维持和繁殖。在传代后第4-5天，使用干细胞切割工具将未分化的hBS细胞集落进行手工分开，并放置在分化培养基(KO-DMEM，补充有1mMGlutamax、0.1mM卩-MeOH、1%NEAA、"/。PeST和20%FBS)中进行悬浮培养。将细胞在悬浮液中维持l-6天，然后转移到明胶包被的组织培养皿中，导致分化的细胞簇粘附以及细胞的持续增殖和分化。铺板后4天，从分化的hBS细胞的粘附簇出现了单层细胞。这些细胞生长在外观类似迷宫的特征性紧密网络中，使得使用光学显微镜时基细胞的区域易于辨别。基细胞的形态与原始内胚层具有相似性，细胞是上皮样的。此外，单个细胞是暗相、分界良好的，通常为有角的形状。从这些基细胞上出现了MCP细胞簇。MCP细胞可以用光学显微镜看到，它们生长为小而圆的和亮相的细胞簇，外观为覆盖在单层基细胞上的松散粘附的细胞团块0W2J。它们具有高的细胞核与细胞质比率。细胞簇的典型特点是类似于"带线的气球"。MCP细胞簇的形状可以是圆形或细长形。使用的细胞系是SA002，LOTAL002(传代34、42、48、55+ED3、65次);SA002.5，LOTBE002.5(传代26、42+ED10次)；SA121,LOTBD121(传代146+ED10、146+ED11、146+ED18次)；SA461,LOTBF461(传代22、33次)和传代32次的SA167。MCP细胞也可以使用另一种本文描述的方法从未分化的hBS细胞获得。将未分化的hBS细胞在体外维持和繁殖。在传代后第4-5天，通过用胶原酶IV(200U/ml)在37。C温育10-15分钟，将未分化的hBS细胞集落与饲养细胞层分开。按照实施例1中描述的强制聚集，将细胞悬浮液转移到15ml试管中，在细胞沉淀后，除去上清液。将集落重新悬浮在补充有20%FBS、1%青霉素-链霉素、l%Glutamax、0.5mmol/1p-巯基乙醇和1%非必需氨基酸(都来自Invitrogen,Carlsbad,California)的KnockOutDMEM中，使用移液管机械解离成小细胞簇(0.2-0.4mm)。将该细胞悬浮液分配(200(il/孔)到96孔v型底板中(Corningincorporated,NY,USA)，浓度为每个孔大约4-6个集落，以400xg离心5分钟。然后将板在37。C温育6-8天。然后将形成的3D结构转移到明胶包被的含有培养基(与上述相同)的培养皿中。在铺板后4天，从分化的hBS细胞的粘附簇出现了基细胞，从那些基细胞上出现了MCP细胞簇。每2到3天更换培养基。MCP细胞可以从不同的hBS细胞系(例如SA002、SA002.5、SA461、SA121)产生，也可以从维持在各种不同培养条件中的hBS细胞(例如培养在MEF或hFF上)产生。MCP细胞的富集可以通过将分化培养基改变成CGM培养基(基本培养基，由35%IMDM和65%DMEM:F12构成，补充有1%PeST和Glutamax，使终浓度为3.5%FBS、2%B-27、0.1mM(3-MeOH、10ng/mlEGF、20ng/mlbFGF、4nM心营养素-1和40nM凝血酶)来进行。通过将单层基细胞维持在该培养基中，与标准分化培养基相比，增加了MCP细胞的数量。实施例7从分化的hBS细胞衍生的MCP细胞的分离MCP细胞外观为覆盖基细胞类型的松散粘附的细胞簇，具有独特的形态。MCP细胞簇可以使用干细胞切割工具通过机械分开进行分离。此外，在各种不同的时间点，某些较大的MCP细胞簇也可以自发与下面的细胞层分开，当它们漂浮在培养基中时被回收。也可以使用温和的酶法处理回收MCP细胞。MCP细胞通过将在目测控制下于室温进行的两次PBS清洗、一次0.5mMEDTA清洗(1-2分钟)和一次胰蛋白酶-EDTA清洗(2-3分钟)合并，收集MCP细胞。使用的细胞系是SA002，LOTAL002(传代34、42、48次)；SA002.5，LOTBE002.5(传代26、42+ED10次);SA121、LOTBD121(传代156+ED10、156+ED11次)和SA461，LOTBF461(传代22、33次)。实施例8MCP细胞在饲养细胞上的繁殖按照上面的描述(强制聚集)衍生和分离MCP细胞，然后培养在心脏间质细胞或END2细胞上以产生用于繁殖和/或分化分离的祖细胞的共培养系统。为了获得心脏间质，源自于人类心脏组织活检外植体的生长物(dxauriculus)的细胞以10000个细胞/cm2的密度培养在含有DMEM/F12、1%PeST、1mMGlutamax禾卩10%FBS的培养基中。这些细胞被称为心脏间质细胞。当细胞大约80%汇合时通过0.25%胰蛋白酶/EDTA处理进行传代。将END2细胞培养在含有DMEM/F12、1%PeST、1°/。NEAA、1mMglutamax和7.5%FBS的培养基中。细胞当达到100%汇合时用0.25G/。胰蛋白酶/EDTA解离，一般每3到4天分拆为1:6-1:8。为了停止细胞分裂，用含有终浓度为IOg/ml的丝裂霉素C的培养基对心脏间质细胞和END2细胞处理大约3小时。细胞用PBS清洗三次，然后用0.250/。胰蛋白酶/EDTA解离。离心后，将沉淀溶解在相应的培养基中，以50000-70000个细胞/0112的密度接种在塑料上，对于END2细胞来说塑料用0.1%明胶包被。MCP细胞按照上面的描述从未分化的hBS细胞衍生，并使用干细胞切割工具通过机械分开进行分离。用于衍生祖细胞的细胞系是SA002,LOTAL002(传代58和61次)。分离的MCP细胞簇被铺于以丝裂霉素C处理的心脏间质细胞或END2细胞作为饲养细胞的培养皿中。祖细胞与两种伺养细胞层粘附，保持粘附几天。与不含饲养细胞的明胶包被的对照相比，与饲养细胞接触的MCP细胞在更长时间内保持粘附而不展平。一个转移到心脏间质细胞的搏动的细胞簇在重新铺板后还是搏动的。这些观察结果合在一起，表明祖细胞需要与其它细胞类型(或它们的分泌产物)紧密关联地生长，这些细胞类型(或分泌产物)给它们以支持或信号，使得祖细胞保持在它们原始的状态而不分化。但是，改变条件可以使祖细胞增殖或开始朝向心脏或其它谱系分化。实施例9通过线粒体染色鉴定和/或分离MCP细胞MitoFluorTM绿色染料(Invitrogen，Carlsbad，CA,USA)可以选择性染色活细胞的线粒体，它们扩散通过质膜并积累在活动的线粒体中，在那里变成荧光。将MCP细胞暴露于该染料以便研究它们的染色图案。MCP细胞按照上面实施例1中描述的强制聚集从未分化的hBS细胞衍生。用于衍生的细胞系是SA002,LOTAL002(传代21、23和31次)禾卩SA002.5，LOTBE002.5(传代44次)。在培养9-20天后，除去培养皿中的培养基，加入预温热(37°C)的含有总浓度为50-200nM的MitoFluorTM探针的生长培养基(DMEM/Glutamax、0.1mM卩-MeOH、1%NEAA、1%PeST和20%FBS)。在一个实验中，细胞在正常生长条件下被温育15、30或45分钟，然后用不含染色染料的新鲜预温热培养基替换荷载培养基。使用荧光显微镜在染色后的不同时间点观察荧光，使染料积累不同的时段。在另一个实验中，染色时间从45分钟变化到最多19小时，在每个时间点后监测荧光。在用200nM染料染色30-45分钟的MCP细胞的线粒体中，在染色后直接特异性地表现出亮绿色的荧光(图14)。增加积累时间染色不会更强或更特异，增加总的染色孵育时间也不能。用100nMMitoFluorTM绿色染料处理的细胞需要染色超过45分钟或使染料积累的时间，以表现出与使用200nM染料染色时相同的图案。使用50nM的染色染料，细胞只能被弱染色，除非暴露/积累时间最长。这些结果表明，可以通过使用MitoFluorTM绿色染料，将MCP细胞与其它细胞类型区分开。因此，该染料可用于从混合的细胞种群中鉴定和/或分离MCP细胞。具体来说，FACS可用于富集用MitoFluorTM绿色染料染色的MCP细胞的细胞种群。实施例10分离的MCP细胞的重新铺板将吸取或手工分开的分离的MCP细胞转移到新的组织培养皿中。MCP细胞簇粘附并铺展到细胞单层中。从不同的细胞簇可以观察到具有不同形态的细胞(图3)。某些细胞簇产生具有心肌细胞样形态的自发收縮性生长物。值得注意的是，某些细胞簇也分化成被描述为基细胞(参见实施例1)的细胞类型，MCP细胞最初是从它们分离的。在培养几天内，可以观察到新的MCP细胞覆盖基细胞(图4)。这表明，至少MCP细胞的子部分可以分化成随后产生新的MCP细胞的基细胞类型。使用的细胞系是SA002,LOTAL002(传代34、48、55+ED3次)；SA002.5，LOTBE002.5(传代26、42+ED4次)；SA121，LOTBD121(传代156+ED10，156+EDll次)禾卩SA461，LOTBF461(传代22、33次)。实施例11MCP细胞的分化在新的培养皿中分离、转移和重新铺板MCP细胞的可能性，使得这些细胞非常适合用于建立模型，以测试各种不同物质、生长因子和化合物对细胞分化的影响。MCP细胞可以在各种不同培养基中重新铺板。如上所述，MCP细胞可以在含有20。/。FBS的分化培养基中重新铺板。也可以将细胞在不含血清的分化培养基中重新铺板。在含有血清的培养基中，MCP细胞分化成具有各种不同形态的单层，但是在不存在血清时，表现出发生了更均质的分化，大多数MCP细胞簇将获得在图6中描述的形态。使用的细胞系是SA002，LOTAL002(传代55+ED3次)；SA002.5，LOTBE002.5(传代26次)和SA461，LOTBF461(传代33次)。为了刺激MCP细胞分化成特定的细胞类型，例如收縮性心肌细胞，可以测试和评估各种不同的培养条件。例如，接种MCP细胞簇的表面可以是未修饰的组织培养皿，或者培养皿也可以用各种细胞外基质成分包被(例如Matrigel、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白等)。此外，培养基中的成分也可以单独或组合测试(例如血清浓度，培养基补充物的存在例如K-SR、ITS和B-27,生长因子例如FGF和BMP家族的成员，5-氮杂脱氧胞苷，DMSO，视黄酸，抗坏血酸和ASA)。实施例12MCP细胞在含有B27的培养基中的培养将未分化的hBS细胞集落(细胞系SA461LotBF461)机械转移到在含有KnochoutDMEM、1mMGlutamax、0.1mM(3-MeOH、1%非必需氨基酸、1%PEST、20。/。FBS的分化培养基中悬浮培养。两天后，将分化性hBS细胞簇铺板并维持在IVF皿的分化培养基中。每两天更换培养基，其中一半体积的培养基用新鲜培养基代替。在铺板后第9天，观察到基细胞的区域，在第12天MCP变得明显，并覆盖在基细胞上。在第19天MCP簇被机械分离并转移到新IVF皿的补充有B27的无血清培养基中(KnochoutDMEM、1mMGlutamax、0.1mM卩-MeOH、1%非必需氨基酸、1%PEST、2%B27)。将细胞在该培养基中维持10天，每两天通过用新鲜培养基替换一半体积来更换培养基。图10显示了在MCP细胞转移后第1、2、4、7和10天时细胞的形态。在第10天，细胞用PFA固定并使用针对短尾蛋白的抗体染色。根据在B27培养基中维持的细胞形态，显然MCP细胞在适合的培养条件下，可以产生最初分离出它们的基细胞类型。该结论被图II中显示的对短尾蛋白的阳性免疫染色所进一步加强。实施例13MCP细胞的心脏分化原则上，可以通过三种不同的方法从MCP细胞获得自发收縮性细胞。i)一种是一旦目测鉴定到松散粘附的MCP细胞的自发收縮性细胞簇，就通过机械分开来简单分离。ii)其次，也可以通过吸取来分离自由漂浮的MCP细胞(即分开的MCP细胞)的收缩性细胞簇。通过任何这些程序分离的收缩性细胞簇可以被转移并铺板在新的组织培养皿中。它们粘附并继续增殖和分化，并可以在体外维持至少20天，同时仍然维持收縮能力。图5显示了增殖的和自发收縮性细胞簇的形态。iii)最后，非搏动的MCP细胞可以被分离并转移到新的培养皿中，它们在其中粘附和铺展。几天后，一小部分分离的和重新铺板的MCP细胞簇开始自发收縮。使用的细胞系是SA002，LOTAL002(传代34、42、55+ED3次)；SA121,L0TBD121(传代156+ED10,156+ED11次)禾nSA461，LOTBF461(传代33次)。实施例14MCP细胞的活培养物的延时(Time-laps)分析从未分化的hBS细胞衍生的基细胞和MCP细胞(在上面描述)随后进行延时摄影。将细胞在分化培养基中培养15天，在延时研究开始之前，替换为CGM培养基。在本实施例中使用了传代26次的细胞系BE002.5。将培养物放置在培养箱中(37°C，5%C02禾P95%湿度)，每5分钟照相，共进行72小时。延时技术能够对MCP细胞簇的起源进行研究，并随时间对它们进行跟踪。MCP细胞簇从基细胞上自发分开，然后粘附并铺在同样的细胞上，并形成它们的形态。MCP细胞可以粘附在其它细胞上，或直接粘附在塑料上。实施例15MCP细胞的表征MCP细胞按照上面的描述从分化的hBS细胞衍生。收获分离的MCP细胞簇并立即收集，并使用PFA固定，用于随后使用Cytospin按照制造商的说明书在玻璃载玻片上进行免疫组织化学评估。在每个玻璃载玻片上收集3-4个MCP细胞簇，每种抗体染色用至少三块独立的玻璃载玻片(参见下文)。使用的细胞系是SA002,LOTAL002(传代55+ED3次)和SA002.5,LOTBE002.5(传代26次)。为了确定MCP细胞以何种方式与未分化的hBS细胞相区别，用针对hBS细胞标志(SSEA-3、SSEA-4、TRAl-60、TRA-1-81禾卩Oct-4)以及早期分化标志SSEA-1的抗体，对固定的MCP细胞进行免疫组织化学染色。免疫组织化学按照以前的描述进行(Noaksson等，StemCells2005)。这些标志无一由MCP细胞表达，而未分化的hBS细胞表达SSEA-4、TRA-1-81和Oct-4。SSEA-1被早期分化的hBS细胞表达，而不是由MCP细胞表达。合在一起，这些数据证明MCP细胞是表现型独特的，并且不同于hBS细胞。还测试了分化细胞的其它标志。评估了针对下列抗原的抗体波形蛋白、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、巢蛋白和islet-l。在这些中，只有波形蛋白在MCP细胞中表达(图7)。值得注意的是，缺少巢蛋白表达将这些细胞与以前描述的神经球(neurosphere)区分开。表IV总结了分离的MCP细胞的IHC分析结果。表IV<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>实施例16.通过实时RTPCR进行的MCP细胞的表征MCP细胞按照上面实施例1描述的强制聚集从未分化的hBS细胞衍生。铺板后9-18天，通过使用干细胞切割工具将松散粘附的细胞簇机械分开或通过吸取自由漂浮的细胞簇来收获MCP细胞簇。这两种类型的细胞簇理论上代表了MCP细胞的不同发育阶段。将MCP细胞转移到试管中，每个试管大约50-200个细胞，并用冰冷的PBS清洗。将细胞以400xg离心10分钟。除去上清液，将细胞沉淀冷冻在液氮中。将细胞储存在-80。C直至分析。用于衍生袓细胞的细胞系是培养在小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)上的SA002,LOTAL002(传代24、27和28次)；SA348(传代27次)；以及在人类包皮成纤维细胞(hFF)上培养的E3-SA002(传代10次)。按照上面的描述收获并处理未分化的细胞(传代74次的SA002和传代10次的E3-SA002)、在mEF(传代75次的SA002，在铺板后20天)和hFF细胞上培养的混合分化细胞，以将这些样品中的基因表达水平与MCP细胞相比较。按照制造商的说明书(Qiagen)，使用Rneasy微量和小量试剂盒从细胞中制备总RNA，然后用DNase处理。使用高容量cDNA反转录试剂盒(AppliedBiosystems)进行cDNA的合成。在进行TaqMan分析之前，按照制造商的说明书(AppliedBiosystems)将从含有少量细胞的样品制备的cDNA进行预扩增。为了得到MCP细胞的mRNA指纹，使用TaqMan实时RTPCR对一组不同类型细胞特异性的基因进行了分析干细胞/祖细胞(Oct-4、Nanog、Flk-l(KDR)、Notch-1和Islet-l)，早期心脏细胞(Nkx2.5和GATA4)，心肌细胞(肌钙蛋白T2)，内皮细胞(CD31)和平滑肌细胞(ACTA2)。CREBBP被用作内源对照。将MCP细胞样品与参比样品的每种基因的表达水平进行比较。Oct-4和Nanog的mRNA表达水平在未分化细胞中高，但是在MCP细胞以及混合的分化细胞或hFF中非常低(图15A和16A)。这两种基因在MCP细胞中缺少可检测的RNA水平，表明来自mEF和hFF培养系统的MCP细胞与未分化的hBS细胞明显有别。与未分化细胞和混合的分化细胞或hFF相比，Flk-lmRNA在MCP细胞中特异性高表达(图15B禾B16B)。这表明Flk-l(KDR)可以用作特异性标志，以选择性鉴定和/或分离MCP细胞。与未分化细胞、hFF和混合的分化细胞相比，Notch-l基因表达水平在MCP细胞中也较高，但是差别没有Flk-l那样显著(图15A和16A)。Notch-l参与许多不同的信号传导途径，因此预计在各种不同类型的分化细胞中有该基因的普遍表达。与未分化细胞相比，Islet-l的基因表达水平在MCP细胞中较高。但是在混合的分化细胞和hFF中islet-l的mRNA水平比未分化细胞和MCP细胞中更高(图15A和16A)。这不是意料之外的，因为Islet-l牵涉许多不同细胞的发育途径。代表早期心脏阶段的Nkx2.5和GATA4以及代表特化的心肌细胞的肌钙蛋白T2的基因表达水平，与未分化的hBS细胞、hFF饲养细胞和混合的分化细胞相比，在hFF和mEF上培养的MCP细胞中增加了。在这些细胞中对于通常用作内皮细胞标志的CD31，观察到了同样的情况(图15B和16B)。对于平滑肌细胞标志-平滑肌肌动蛋白来说，在MCP细胞中的基因表达高于未分化的hBS细胞，但低于hFF和混合的分化细胞(图15B和16B)。这不是意料之外的，因为hFF和混合的分化细胞含有相当比例的成纤维细胞样细胞，它们也表达-平滑肌肌动蛋白。值得注意的是，与MCP细胞中心脏基因的表达相似，MCP细胞中CD31和-平滑肌肌动蛋白的mRNA水平比未分化细胞增加。这表明MCP细胞的心脏/内皮/平滑肌祖细胞表现型。总之，MCP细胞不表达未分化的hBS细胞的标志基因，它们已经开始呈现出不同的发育途径，这支持了它们的多能性特点。实施例17从MCP细胞分化的细胞的表征MCP细胞按照上面的描述从未分化的hBS细胞衍生。将MCP细胞簇分离并转移到新的培养皿中。然后，将MCP细胞在分化培养基中维持培养最多达到16天。细胞在不同时间点固定，并使用免疫组织化学进行评估(Noaksson等，StemCells2005)。使用的细胞系是SA002，LOTAL002(传代48次)；SA002.5,LOTBE002.5(传代42+ED4次);SA121，LOTBD121(传代156+EDIO，156+ED11次)和SA461，LOTBF461(传代22次)。表V总结实验和获得的结果。表V<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>*表示在将MCP细胞簇分离并转移到新的培养皿后的天数。中胚层谱系的标志(例如结蛋白、波形蛋白、a-横纹肌肌动蛋白)的早期出现表明MCP细胞倾向于朝向该胚层的细胞类型分化。此外，缺少神经标志(巢蛋白和GFAP)的表达，表明MCP细胞不同于由Reynolds和Weiss最初描述的神经球细胞(ReynoldsBA,WeissS(1992)Generationofneuronsandastrocytesfromisolatedcellsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.(从成年哺乳动物中枢神经系统的分离细胞产生神经元和星形细胞)Science255:1707-1710)。神经球主要由混合有分化的星形细胞和神经元的定向祖细胞组成。最后，Nkx2.5的表达说明MCP细胞分化成早期心肌细胞的能力。图8描述了对分化的MCP细胞进行免疫组织化学分析获得的结果。实施例18MCP细胞的深低温保藏按照上面的描述衍生和分离的MCP细胞可以按照以前的描述(WO2004098285)使用密封的细管和玻璃化进行深低温保藏。此外，常规的缓慢冷冻也可以作为一种选择。实施例19生物反应器培养MCP细胞和基细胞可以生长在由例如人造中空纤维毛细管膜分区的三维空间中。该系统能够使细胞在毛细管之间生长为较大的细胞簇，并通过灌注培养基和气体例如氧气提供最适化的、自然的环境。可以开发出封闭的生物反应器系统，以生产较大量的细胞(多达IO"个细胞)，并支持对细胞的功能性性质的维持潜力。然后通过酶灌注进行细胞分离将允许在封闭的GMP系统中放大规模。然后使用例如FACsorting根据例如膜抗原表达或使用密度梯度介质和离心来进行细胞纯化。实施例20分离技术MCP细胞和基细胞可以通过使用抗原检测表面表达的标志、然后进行FACsorting来纯化。基于抗原的分拣的其它可选方法是用特异性抗体包被培养皿，并将培养基中的细胞加入到培养皿中，使带有正确抗原的细胞并合，弃去剩余的细胞，收获并合的细胞以进一步应用。这种方法有时被称为免疫淘选，也可以通过阴性选择来进行，即，使不想要的细胞类型与包被的抗原并合，而将带有想要的MCP细胞或基细胞的培养基保留在悬浮液中。该方法也可以在磁性珠子上进行、即所谓的MAC分拣，或使用柱层析来进行。另一种纯化细胞、例如具有特定特征的MCP细胞或基细胞的方法，包括根据离心下的浮力密度或大小，使用密度梯度介质进行细胞分离。实施例21MCP和基细胞在再生医学中的应用得益于它们的多性能和分化成自发收缩性心肌细胞样细胞的能力，MCP细胞和基细胞均可以被证明在再生医学中是极其有用的。具体来说，可以设想使用MCP细胞治疗心脏相关疾病。为了使患有心肌梗塞的心脏恢复功能，需要更新心肌细胞以及新的血管。当临床适用的hBS细胞系可以使用时，可能使用这些细胞衍生MCP细胞或基细胞，随后可以移植并评估在人类中的潜在应用。同时，论证原理的实验可以在动物模型中进行。可以使用在SCID小鼠中诱导心肌梗塞的标准模型(例如低温损伤或LAD连接)，并将MCP细胞或基细胞注射到受伤位点。然后对小鼠进行或短(最多2-3周)或长(>3周)时段的监测，使用标准技术测量心脏的改善。在实验结束时，将小鼠处死，收集心脏用于随后的组织学评估。人类细胞在小鼠心脏中的移植可以使用针对人类特异性抗原或DNA的抗体或探针来测量。MCP细胞和基细胞在再生医学、细胞治疗中的应用MCP细胞和基细胞还可用于治疗与例如坏死、凋亡、损伤、功能障碍或形态异常的心肌相关的疾病。这些疾病包括但不限于缺血性心脏病、心肌梗塞、风湿性心脏病、心内膜炎、自体免疫心脏病、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、心肌节律紊乱和心功能不全。MCP细胞和基细胞正如标志分析所显示的，不再是未分化的hBS细胞，因此在体内不导致肿瘤形成，能够增殖并具有分化成心脏细胞类型(包括心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)的潜力，因此，通过逆转、抑制或阻止由心肌梗塞产生的缺血导致的心脏损伤，可能适合治疗大多数的心脏病患和疾病。另一方面，MCP细胞和基细胞可用于治疗特征为心脏节律异常的心脏疾病，例如心律失常。治疗优选通过给对象的心脏施用治疗有效剂量的细胞来进行，优选注射到心脏中。治疗有效剂量是足以产生有益的或所需的临床结果的量，该剂量可以在一次或多次给药中施用。注射可以根据需要修复的心脏组织的类型，在心脏的不同区域中给药。给药可以在打开胸腔或通过任何适合的血管进入后，使用基于导管的方法来进行。细胞的有效辨量可能基于例如体重、年龄、生理状态、医疗史、梗塞大小和缺血发生后经过的时间的因素。MCP细胞和/或基细胞的施用优选包括以免疫抑制方案处理对象，优选在施用之前，以便抑制排斥。实施例23MCP细胞和基细胞在药物发现中的应用根据细胞的特点可以扩展MCP细胞或基细胞在药物发现应用中的用途。这里描述了应用于发现对心脏再生具有潜在影响的化合物。MCP细胞和基细胞从hBS细胞衍生和分离，并可以转移到多孔格式的培养皿中(例如96孔或384孔板)。然后将来自文库的化合物在确定的培养基(优选不含血清)的存在下加入到细胞中。细胞可以在化合物存在下维持不同的时间点和保持不同的浓度。化合物的潜在影响可以通过测量细胞的分化、增殖和功能来监测。具体来说，可以使用基因表达分析，可以测量与心肌发生典型相关的基因的表达。此外，可以产生报告基因构建物，以便容易地监测例如荧光标记的报告蛋白。实施例24MCP细胞和基细胞在毒性测试中的应用MCP细胞和基细胞按照上面的描述从hBS细胞衍生，并在将细胞铺于MEA(MultichannelSystems,Germany)之前或之后，进一步分化成自发收縮性心肌细胞样细胞。不同化合物或化学物质的影响可以通过在MEA中直接加入物质并将细胞温育不同时间点来测定。细胞外场电位(Extracellularfieldpotential)可以使用MEA系统和在培养物中非侵入性测量到的有害效应来确定。这打开了研究物质的急性和长期效应的可能性。对平台的进一步改进将是把细胞直接接种到QT筛选系统(MultichannelSystems,德国)的96孔板中，其主要优点是能够同时运行多个样品。可以设想，使用MCP细胞评估各种不同化学物质或化合物对发育的影响的其他应用。例如，在MCP细胞朝向自发收縮细胞(例如心肌细胞样细胞)分化的过程中，可以将待测化合物加入到培养物中。化合物的效应可以使用多种不同的读出值来测定，例如基因和蛋白表达的变化以及丧失分化成收缩性细胞的能力。实施例25MCP细胞和基细胞在研究调控心脏发生的分子机制中的应用MCP细胞和基细胞在基础研究中的应用可以被扩展，并且是基于细胞的多能性以及它们形成类似心肌细胞的自发收縮细胞的天生能力。例如，MCP细胞从hBS细胞衍生并分离，并可以转移到多孔格式的培养皿中。细胞可以在不同培养条件下维持不同的时间点。对心脏发生的潜在影响可以通过测量MCP细胞和/或基细胞的分化、增殖和功能来监测。具体来说，可以使用基因表达分析，并可以测量与心肌发生典型相关的基因的表达。此外，可以产生报告基因构建物，以便容易监测例如荧光标记的报告蛋白。此外，可以使用siRNA构建物以及相关的转染技术，来研究某些基因对心肌发生程序的影响。参考文献HeinsN,EnglundMCO,Sj。blomC等，Derivation,characterization,anddifferentiationofhumanembryonicstemcells.(人类胚胎干细胞的衍生、表征和分化)STEMCELLS2004;22:367-76.Huber禾口Zon1998,10(2):103-109,SeminarsinImmunologyWO03055992,Amethodfortheestablishmentofapluripotenthumanblastocyst-derivedstemcellline,(建立多能人类胚泡来源的干细胞系的方法)CellartisABWO2004098285,Cryopreservationofhumanblastocyststemcellsbyuseofaclosedstrawsvitrificationmethod(使用密封细管玻璃4七方法深低温保藏人类胚泡干细胞)WO2004099394,Amethodfortheefficienttransferofhumanblastocyst-derivedstemcellsfromafeeder-supportedtoafeeder-freeculturesystem(将人类胚泡来源干细胞从饲养细胞支持的培养系统有效转移到无饲养细胞的培养系统的方法)NoakssonK,ZoricN,ZengX，RaoMS，HyllnerJ，SembH，KubistaM,SartipyP,Monitoringdifferentiationofhumanembryonicstemcellsusingreal-timePCR.(使用实时PCR监测人类胚胎干细胞的分化)StemCells.2005Nov-Dec;23(10):1460-7.Epub2005Aug4.Norstr6mA,AkessonK,HardarsonT,HambergerL,Bj。rquistPSartipyP."Molecularandpharmacologicalpropertiesofhumanembryonicstemcell-derivedcardiomyocytes."(人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞的分子和药理学性质)ExpBiolMed(Maywood).2006Dec;231(ll):1753隱62.Sjogren-JanssonE，Zetterstr她M，MoyaK，LindqvistJ，StrehlR,ErikssonPS.Large-scalepropagationoffourundifferentiatedhumanembryonicstemcelllinesinafeeder-freeculturesystem,(四禾中未分化的人类胚胎干细胞系在无饲养细胞的培养系统中的大规模繁殖)DevDyn.2005Aug;233(4):1304-14.ReynoldsBA，WeissS(1992)Generationofneuronsandastrocytesfromisolatedcellsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.(从成年哺乳动物中枢神经系统的分离细胞产生神经元和星形细胞)Science255:1707—1710.Urbanek，等，Intensemyocyteformationfromcardiacstemcellsinhumancardiachypertrophy(在人类心脏肥大病中从心脏干细胞强烈形成肌细胞)PNAS2003,100(18),10440-45Laugwitz等，Postnatalisll+cardioblastsenterfullydifferentiatedcardiomyocytelineages.(出生后isll+成心细胞进入完全分化的心肌细胞谱系)Nature,2005,433，647-653Messina等，Isolationandexpansionofadultcardiacstemcellsfromhumanandmurineheart(从人类和鼠类心脏分离和增殖成年心脏干细胞)CircRes2004，95,911-921Beltrami等，Adultcardiacstemcellsaremultipotentandsupportmyocardialregeneration(成年心脏干细胞是多能性的并支持心肌再生)Cell，2003，114，763-776Cai等，Isllidentifiesacardiacprogenitorpopulationthatproliferatespriortodifferentiationandcontributesamajorityofcellstotheheart(Isll鉴定在分化前增殖并为心脏贡献了大部分细胞的心脏祖细胞种群)DevCell2003，5,877-889Kehat等，Humanembryonicstemcellscandifferentiateinto类胚胎干细胞可以分化成具有心肌细胞的结构和功能性质的肌细胞)JClinInvest,108:407-414，2001Xu等Characterizationandenrichmentofcardiomyocytesderivedfromhumanembryonicstemcells(源自于人类胚月台干细胞的心肌细胞的表征和富集)CircRes,91:501-508,2002He等，Humanembryonicstemcellsdevelopintomultipletypesofcardiacmyocytes:actionpotentialcharacterization.(人类胚月台干细胞发育成多种类型的心肌细胞动作电位表征)CircRes,93:32-39，2003Mummery等，Differentiationofhumanembryonicstemcellstocardiomyocytes:roleofcoculturewithvisceralendoderm-likecells.(人类胚胎干细胞分化成心肌细胞与内脏内胚层样细胞共培养的作用)Circulation,107:2733-2740,2003WO2005/012510,METHODFORTHEISOLATIONANDEXPANSIONOFCARDIACSTEMCELLSFROMBIOPSY(从活体组织分离和增殖心脏干细胞的方法)WO2006/052925，CARDIACSTEMCELLS(心脏干细胞)条目MCP细胞1.人类胚泡来源的干(hBS)细胞衍生的细胞种群，含有多能心脏前体(MCP)细胞。2.条目l的细胞种群，其中所述细胞种群具有至少一种下列的特征v)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4，vi)至少1%的细胞没有表现出一种或多种神经标志例如巢蛋白或GFAP的蛋白表达，vii)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，viii)至少1%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达。ix)3.条目l或2的细胞种群，其中所述细胞种群含有生长为小而圆的且亮相的细胞簇的MCP细胞。4.条目3的细胞种群，其中MCP细胞簇的形状是圆形或细长形的。5.条目3或4的细胞种群，其中MCP细胞簇表现为松散粘附的细胞团块，如果生长在基细胞上，则覆盖单层的基细胞。6.前述条目任一项的细胞种群，其中MCP细胞具有相对高的细胞核与细胞质比率。7.前述条目任一项的细胞种群，其中MCP细胞外观象带线的气球。8.前述条目任一项的细胞种群，其中至少50。/。的MCP细胞1.生长为小而圆的和亮相的细胞簇，2.形成圆形或细长形的簇，表现为松散粘附的细胞块，如果生长在基细胞上，则覆盖单层的基细胞，3.具有相对高的细胞核与细胞质比率，禾口/或4.外观象带线的气球具有至少一种下面的特征i)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4，ii)至少1%的细胞没有表现出一种或多种神经标志例如巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，以及iv)至少1%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白和/或基因表达。9.条目8的细胞种群，其中至少50%的MCP细胞具有四种特征中的至少两种。10.条目8或9的细胞种群，其中至少50%的MCP细胞具有四种特征中的至少三种。11.条目8-10任一项的细胞种群，其中至少50%的MCP细胞具有所有四种特征。12.条目8-11任一项的细胞种群，其中对于至少55%、例如至少60%、至少65%、至少70。/。、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征i)、ii)、iii)和/或iv)是有效的。13.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有至少特征i)。14.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有至少特征i)的至少两个、例如至少3个或至少4个i)中提到的标志。15.条目14的细胞种群，其中细胞种群具有至少特征i)的所有i)中提到的标志。16.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有至少特征ii)的ii)中提到的那两个标志。17.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有至少特征iii)的iii)中提到的两个或三个标志。18.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有至少特征iv)的至少2个、例如2、3、4、5或6个iv)中提到的标志。19.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有四种特征中的至少两种。20.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有四种特征中的至少三种。21.前述条目任一项的细胞种群，其中细胞种群具有所有四种特征。22.前述条目任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征i)是有效的。23.前述条目任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70°/。、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征ii)是有效的。24.前述条目任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70°/。、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征iii)是有效的。25.前述条_目任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征iv)是有效的。26.前述条目任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征i)、ii)、iii)和/或iv)是有效的。27.前述条目任一项的细胞种群，细胞种群是无外源物的。分化的MCP细胞28.前述条目任一项的细胞种群，在通过铺板和使用分化培养基进行时期至少5天的分化后，具有至少一种下面的特征i)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出一种或多种心脏标志例如islet-l、GATA-4、Nkx2.5、cTNI、cTNT或连接蛋白43的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出未分化的干细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81禾卩Oct-4。29.条目28的细胞种群，其中细胞种群经过分化后具有至少特征i)。30.条目28或29的细胞种群，其中细胞种群经过分化后具有至少特征i)的在i)中提到的两个或三个标志。31.条目28-30任一项的细胞种群，其中细胞种群经过分化后具有至少特征ii)的至少2个、例如2、3、4、5或6个ii)中提到的标志。32.条目28-31任一项的细胞种群，其中细胞种群经过分化后具有至少特征iii)的至少2个、例如2、3、4或5个iii)中提到的标志。33.条目28-32任一项的细胞种群，其中细胞种群经过分化后具有三种特征中的至少两种。34.条目28-33任一项的细胞种群，其中细胞种群经过分化后具有所有三种特征。35.条目28-34任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85°/。、至少卯°/0或至少95%的细胞来说，特征i)是有效的。36.条目28-35任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85°/。、至少90%或至少95%的细胞来说，特征ii)是有效的。37.条目28-36任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征iii)是有效的。38.条目28-37任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15°/。、至少20%、至少25%、至少30°/。、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征i)、ii)和/或iii)是有效的。基细胞39.人类胚泡来源的干(hBS)细胞衍生的细胞种群，所述细胞种群含有基细胞。40.条目39的细胞种群，其中细胞种群具有至少一种下列特征i)至少1%的细胞表现出短尾蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出a-横纹肌肌动蛋白的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出波形蛋白的蛋白表达，以及iv)至少1%的细胞没有表现出结蛋白的蛋白表达，v)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4。41.条目39或40的细胞种群，其中基细胞具有与原始内胚层相似的形态，并且细胞是上皮样的。42.条目39-41任一项的细胞种群，其中基细胞通过光学显微镜证明是暗相的和分界良好的。43.条目39-42任一项的细胞种群，其中基细胞通过光学显微镜证明具有有角的形状。44.条目39-43任一项的细胞种群，其中至少5%的基细胞L具有与原始内胚层相似的形态，2.是上皮样的，3.通过光学显微镜证明是暗相的和分界良好的，和/或4.通过光学显微镜证明具有有角的形状。具有至少一种下面的特征i)至少1%的细胞表现出短尾蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出a-横纹肌肌动蛋白的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出波形蛋白的蛋白表达，以及iv)至少1%的细胞没有表现出结蛋白的蛋白表达，力至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA隱3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA國l-81禾POct-4。45.条目44的细胞种群，其中至少5%的基细胞具有五种特征中的至少两种。46.条目45的细胞种群，其中两种特征是i)和iv)。47.条目44-46任一项的细胞种群，其中至少5%的基细胞具有五种特征中的至少三种。48.条目44-47任一项的细胞种群，其中至少5%的基细胞具有五种特征中的至少四种。49.条目44-48任一项的细胞种群，其中至少5%的基细胞具有所有五种特征。50.条目44-49任一项的细胞种群，其中对于至少10%、例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征是有效的。51.条目39-50任一项的细胞种群，其中细胞种群具有至少特征i)。52.条目39-51任一项的细胞种群，其中细胞种群具有五种特征中的至少两种。53.条目52的细胞种群，其中两种特征是i)和iv)。54.条目39-53任一项的细胞种群，其中细胞种群具有五种特征中的至少三种。55.条目39-54任一项的细胞种群，其中细胞种群具有五种特征中的至少四种。56.条目39-55任一项的细胞种群，其中细胞种群具有所有五种特征。57.条目39-56任一项的细胞种群，其中对于至少5%、例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%的细胞来说，特征i)是有效的。58.条目39-57任一项的细胞种群，10%、至少15%、至少20%、至少25%50%的细胞来说，特征ii)是有效的。59.条目39-58任一项的细胞种群，10%、至少15%、至少20%、至少25%50%的细胞来说，特征iii)是有效的。60.条目39-59任一项的细胞种群，10%、至少15%、至少20%、至少25%50%的细胞来说，特征iv)是有效的。61.条目39-60任一项的细胞种群，10%、至少15%、至少20%、至少25%50%的细胞来说，特征v是有效的。62.条目39-61任一项的细胞种群，10%、至少15%、至少20%、至少25%50%的细胞来说，特征i)、ii)、iii)、iv)和/或v)是有效的。63.条目39-62任一项的细胞种群，所述细胞种群是无外源物的。64.条目39-63任一项中限定的细胞种群在提供MCP细胞中的应用。65.前述条目任一项中限定的细胞种群在药物发现方法中的应用。66.条目1-63任一项中限定的细胞种群在研究对心脏细胞类型具有潜在影响的药物的体外模型中的应用。67.条目1-63任一项中限定的细胞种群在研究心脏发生、例如早期心脏发生的体外模型中的应用。68.条目1-63任一项中限定的细胞种群在研究人类心脏退变性疾其中对于至少5%、例如至少至少30%、至少40%或至少其中对于至少5%、例如至少至少30%、至少40%或至少其中对于至少5%、例如至少至少30%、至少40%或至少其中对于至少5%、例如至少至少30%、至少40%或至少其中对于至少5%、例如至少至少30%、至少40%或至少病的体外模型中的应用。69.条目1-63任一项中限定的细胞种群在体外心脏毒性测试中的应用。70.条目l-63任一项中限定的细胞种群在再生医学中的应用。71.条目l-63任一项中限定的细胞种群在医学中的应用。72.条目l-63任一项中限定的细胞种群在制造预防和/或治疗由组织退变、例如心脏组织退变引起的病理和/或疾病的医药产品中的应用。73.条目1-63任一项中限定的细胞种群在制造治疗心脏病的医药产品中的应用。74.条目l-63任一项中限定的细胞种群在制造预防禾口/或治疗心脏病例如与坏死、凋亡、损伤、功能障碍和/或形态异常的心肌相关的疾病的医药产品中的应用。75.条目l-63任一项中限定的细胞种群在制造治疗和/或预防疾病例如缺血性心脏病、心肌梗塞、风湿性心脏病、心内膜炎、自体免疫心脏病、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、心脏节律紊乱和/或心功能不全的医药产品中的应用。76.条目1-63任一项中限定的细胞种群的一种或多种细胞在获得心肌细胞样细胞中的应用。77.条目1-63任一项中限定的细胞种群的一种或多种细胞在研究朝向心肌细胞样细胞成熟中的应用。78.筛选化合物的心脏细胞毒性的方法，包括将条目1-63任一项中限定的细胞种群中的细胞暴露于化合物，确定所述化合物是否对细胞有毒性。79.筛选化合物调节心脏细胞功能的能力的方法，包括将条目1-63任一项中限定的细胞种群中的细胞暴露于化合物，确定细胞中任何由于与化合物接触而产生的表现型或代谢改变，并将改变与调节心肌细胞功能的能力相关联。基细胞和MCP细胞方法80.条目39-63任一项中限定的细胞种群的制备方法，包括下列步骤i)将一个或多个未分化的hBS细胞的集落片或集落培养在分化培养基中悬浮培养大约1天到大约10天，例如大约1天到大约6天，ii)将这样培养的细胞转移到培养器皿中继续增殖和分化，iii)通过光学显微镜中的形态标准和/或本文定义的相关标志的鉴定来鉴定基细胞，iv)任选，分离由此获得的基细胞，以及v)任选，重复步骤ii)-iv)。81.条目l-39任一项中限定的细胞种群的制备方法，包括条目80中限定的步骤i)-iii)以及下列的进一步步骤vi)培养基细胞，直到通过光学显微镜和/或本文定义的相关标志鉴定证实MCP细胞出现，vii)分离由此获得的MCP细胞。82.条目81的方法，还包括将MCP细胞传代培养，例如用于保存、用于心分化、用于表征、用于药物发现、用于毒性测试、用于再生医学和/或用于获得基细胞。83.条目81的方法，还包括再次分离MCP细胞。84.条目80-83任一项的方法，其中步骤i)使用hBS细胞的未分化集落片进行。85.条目80-84任一项的方法，其中步骤i)中的悬浮培养在血清例如FBS或人类血清中进行。_86.条目85的方法，其中血清的浓度为至少2%，例如大约2%到大约30%，大约5%到大约25%或大约20%。87.条目80-86任一项的方法，其中步骤i)进行大约l天到大约6天的时期，例如大约1天到大约4天，大约1天到大约3天，或大约1天到大约2天。88.条目80-86任一项的方法，其中步骤ii)在同样的或不同的培养基中进行。89.条目88的方法，其中培养基含有血清例如FBS或人类血清，或者它是无血清培养基。190.条目89的方法，其中血清的浓度，如果有的话，为至少2%，例如大约2%到大约30%，大约5%到大约25%或大约20%。91.条目80-90任一项的方法，其中步骤ii)通过将细胞直接铺于培养器皿的表面上或细胞外基质成分上来进行。92.条目80-91任一项的方法，其中步骤ii)进行大约2到大约20天的时期，例如大约2到大约15天，大约2到大约10天，大约2到大约6天或大约2到大约4天。93.条目80-92任一项的方法，其中步骤iv)进行大约2到大约25天的时期，例如大约2到大约20天，大约2到大约15天，大约2到大约10天，大约2到大约5天或大约2到大约4天。94.方法，包括i)在分化因子和/或培养基的存在下，将MCP细胞铺于表面上以获得分化的MCP细胞。试剂盒95.试剂盒，包含i)条目1-63任一项中限定的细胞种群，ii)一种或多种成熟因子和/或成熟培养基，以及iii)任选的使用说明书。96.条目95的试剂盒，其中成熟培养基选自VitroHESTM、补充有bFGF的VitroHESTM、自体预调制的VitroHES、CGM培养基和其它心脏特异性培养基。97.条目95或96的试剂盒，其中一种或多种成熟因子选自FGF例如bFGF、BMP、5-氮杂脱氧胞苷、DMSO、视黄酸、抗坏血酸和ASA。98.条目95-97任一项的试剂盒，还包括监测成熟的工具。99.条目98的试剂盒，其中监测成熟的工具包括i)针对至少3个、例如至少4个或至少5个表达标志的编码基因的PCR引物，所述表达标志选自未分化hBS细胞的标志、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、短尾蛋白、巢蛋白、GFAP、Islet-l、Nkx2.5、GATA-4、cTnl、cTnT、a-MHC和连接蛋白-43，以及ii)用户手册。100.条目98或99的试剂盒，其中监测成熟的工具包括i)针对至少3个、例如至少4个或至少5个表达标志抗原的抗体，所述表达标志抗原选自未分化hBS细胞的标志、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、短尾蛋白、巢蛋白、GFAP、Islet-l、Nkx2.5、GATA-4、cTnl、cTnT、a-MHC和连接蛋白-43，以及ii)用户手朋、101.用于再生医学的试剂盒，包括i)基细胞和/或MCP细胞ii)任选，在体外和/或体内驱动分化的因子iii)给患者施用细胞的工具或处于施用形式的细胞，例如即用注射器。权利要求MCP细胞1.由人类胚泡来源的干(hBS)细胞衍生的细胞种群，其含有多能心脏前体(MCP)细胞。1.由人类胚泡来源的干(hBS)细胞衍生的细胞种群，其含有多能心脏前体(MCP)细胞。2.权利要求l的细胞种群，其中所述细胞种群具有下列特征i)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4，ii)至少1%的细胞没有表现出一种或多种神经标志包括巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志包括短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，iv)至少1%的细胞表现出Flk-l(KDR)的蛋白和/或基因表达。3.权利要求1或2任一项的细胞种群，其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志包括islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达。4.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少50%、例如至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或所有的细胞是非收缩性细胞。5.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15°/。、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出肌钙蛋白T2的蛋白和/或基因表达。6.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40°/。、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少卯％或至少95%的细胞表现出CD31的蛋白和/或基因表达。7.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出Nkx2.5禾P/或GATA-4的蛋白和/或基因表达。8.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少1%、例如至少2%、至少5。/。、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95°/。的细胞表现出Flk-l(KDR)、肌钙蛋白T2、CD31、Nkx2.5和GATA-4的蛋白和/或基因表达。9.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出一种或多种祖细胞标志Flk-l(KDR)和ISL-1的蛋白和/或基因表达。—10.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少1%、例如至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表现出两种或多种祖细胞标志Flk-l(KDR)、Notch-l或ISL-1的蛋白和/或基因表达。11.前述权利要求任一项的细胞种群，其中所述细胞种群具有下列特征中的至少两种i)至少25%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4，ii)至少25%的细胞没有表现出一种或多种神经标志例如巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少25%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，iv)至少25。/。的细胞表现出Flk-l(KDR)的蛋白和/或基因表达。12.权利要求ll的细胞种群，其中至少25%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达。13.前述权利要求任一项的细胞种群，其中MCP细胞表现为小而圆且亮相的细胞簇；个体细胞直径为5-20^m，并且每个簇由2-500个细胞构成。14.权利要求13的细胞种群，其中MCP细胞簇的形状是圆形或细长形的，如图2的a、b和c部分所示。15.权利要求13或14的细胞种群，其中MCP细胞簇表现为松散粘附的细胞团，如图2的a、b和c部分所示。16.前述权利要求任一项的细胞种群，其中MCP细胞在细胞总体积中具有相对高的细胞核与细胞质比率，例如1:2-1:64。17.前述权利要求任一项的细胞种群，其中MCP细胞外观象带线的气球，如图18的示意略图所描述。18.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少25%的细胞表现出肌钙蛋白T2的基因表达。19.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少25%的细胞表现出CD31的基因表达。20.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少25%的细胞表现出Nkx2.5禾口/或GATA-4的基因表达。21.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少25%的细胞表现出Flk-l(KDR)、肌纟丐蛋白T2、CD31、Nkx2.5和GATA-4的基因表达。22.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少25%的细胞表现出一种或多种祖细胞标志Flk-l(KDR)和ISL-1的基因表达。23.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少25%的细胞表现出两种或多种祖细胞标志Flk-l(KDR)、Notch-l或ISL-1的基因表达。24.前述权利要求任一项的细胞种群，其中至少50y。的MCP细胞1.生长为小而圆且亮相的细胞簇；个体细胞直径为5-20pm，且每个簇由2-500个细胞构成，2.形成圆形或细长形的簇，其表现为松散粘附的细胞团，如图2的a、b和c部分所示，3.在细胞总体积中具有相对高的细胞核与细胞质比率，例如1:2-1:64，禾口/或4.外观象带线的气球，如图18中的示意略图所示，5.是非收縮性的具有下面的特征i)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4，ii)至少1%的细胞没有表现出一种或多种神经标志例如巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，iv)至少1%的细胞表现出Flk-l(KDR)的蛋白和/或基因表达。25.权利要求24的细胞种群，其中至少1%的细胞没有表现出一种或多种早期心脏标志例如islet-l、cTNI、cTNT、Nkx2.5、a-MHC或连接蛋白43的蛋白表达。26.权利要求24的细胞种群，其中对于至少55%、例如至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95。/。的细胞来说，特征i)、ii)、iii)和/或iv)是有效的。27.权利要求24-26任一项的细胞种群，其中所述细胞种群具有至少特征i)的至少两个、例如至少3个或至少4个i)中提到的标志。28.权利要求27的细胞种群，其中所述细胞种群具有至少特征i)的所有i)中提到的标志。29.权利要求24-28任一项的细胞种群，其中所述细胞种群具有至少特征ii)的ii)中提到的那两个标志。30.权利要求24-29任一项的细胞种群，其中所述细胞种群具有至少特征iii)的iii)中提到的两个或三个标志。31.权利要求25的细胞种群，其中所述细胞种群具有至少特征的至少2个、例如2、3、4、5或6个iv)中提到的标志。32.前述权利要求任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征i)是有效的。33.前述权利要求任一项的细胞种群，其中对于至少2。/。、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征ii)是有效的。34.前述权利要求任一项的细胞种群，其中对于至少2。/。、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20°/。、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征iii)是有效的。35.前述权利要求任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征iv)是有效的。36.前述权利要求任一项的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征i)、ii)、iii)和/或iv)是有效的。37.权利要求24-36任一项的细胞种群，其中所述细胞种群具有四种特征中的至少两种。38.权利要求24-37任一项的细胞种群，其中所述细胞种群具有四种特征中的至少三种。39.权利要求24-38任一项的细胞种群，其中所述细胞种群具有所有四种特征。40.前述权利要求任一项的细胞种群，所述细胞种群是无外源物的。分化的MCP细胞41.分化的细胞种群，其是使含有前述权利要求任一项中限定的MCP细胞的细胞种群在通过铺板和使用分化培养基经过时期为至少5天的分化而获得的，其中分化的细胞种群具有下面的特征i)至少1%的细胞表现出一种或多种中胚层标志例如短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出一种或多种心脏标志例如islet-l、GATA-4、Nkx2.5、cTNI、cTNT或连接蛋白43的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出未分化干细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81禾口Oct-4。42.权利要求41的分化的细胞种群，其含有收縮性细胞。43.权利要求42的分化的细胞种群，其中所述收縮性细胞具有权利要求41中限定的特征。44.权利要求41-43任一项的分化的细胞种群，其中所述分化的细胞种群具有至少特征i)的在i)中提到的两个或三个标志。45.权利要求41-44任一项的分化的细胞种群，其中所述分化的细胞种群具有至少特征ii)的至少2个、例如2、3、4、5或6个ii)中提到的标志。46.权利要求41-45任一项的分化的细胞种群，其中所述分化的细胞种群经过分化后具有至少特征iii)的至少2个、例如2、3、4或5个iii)中提到的标志。47.权利要求41-46任一项的分化的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15°/。、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95°/。的细胞来说，特征i)是有效的。48.权利要求41-47任一项的分化的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15°/。、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征ii)是有效的。49.权利要求41-48任一项的分化的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15°/。、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征iii)是有效的。50.权利要求41-49任一项的分化的细胞种群，其中对于至少2%、例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征i)、ii)和/或iii)是有效的。基细胞51.由人类胚泡来源的干(hBS)细胞衍生的细胞种群，所述细胞种群含有基细胞。52.权利要求47的细胞种群，其中所述细胞种群至少具有下列特征i)至少1%的细胞表现出短尾蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1。/。的细胞表现出Ct-横纹肌肌动蛋白的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出波形蛋白的蛋白表达，以及iv)至少1%的细胞没有表现出结蛋白的蛋白表达，V)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4。53.权利要求51或52的细胞种群，其中所述细胞种群还具有下列特征vi)至少1%的细胞表现出实施例3表11中列出的至少一种或多种基因的基因表达，例如碱性核蛋白1(BNCl).、肾连蛋白(NPNT)、纤维蛋白原a链(FGA)、膜联蛋白A8(ANXA8)、基质Gla蛋白(MGP)、透明带糖蛋白4(ZP4)、血栓调节蛋白(THBD)、同源异型框B7(HOXB7)、心脏和神经嵴表达衍生物1(HAND1)、桥粒芯胶蛋白3(DSC3)、白介素6信号转换因子(IL6ST)、水通道蛋白l(AQPl)、巻曲相关蛋白(FRZB)、缓激肽受体B1(BDKRB1)、生长激素受体(GHR)和激酶插入结构域受体(尸仪-/)(KDR)，vi)与未分化的hBS细胞相比，至少1。/。的细胞具有oct-4和nanog的基因表达下调。54.权利要求51-53任一项的细胞种群，其中对于至少5%、例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50。/。的细胞来说，特征i)是有效的。55.权利要求51-54任一项的细胞种群，其中基细胞具有内皮细胞样形状。56.权利要求51-55任一项的细胞种群，其中基细胞通过光学显微镜证实是暗相的和分界良好的。57.权利要求51-56任一项的细胞种群，其中基细胞通过光学显微镜证实具有有角的形状，如图19所示。58.权利要求51-57任一项的细胞种群，其中至少5%的基细胞1.具有与原始内胚层相似的形态，2.具有内皮细胞样的形状，3.通过光学显微镜证明是暗相的和分界良好的，和/或4.通过光学显微镜证明具有有角的形状，如图19所示，具有下面的特征i)至少1%的细胞表现出短尾蛋白的蛋白和/或基因表达，ii)至少1%的细胞表现出a-横纹肌肌动蛋白的蛋白和/或基因表达，iii)至少1%的细胞没有表现出波形蛋白的蛋白表达，以及iv)至少1%的细胞没有表现出结蛋白的蛋白表达，v)至少1%的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81和Oct-4。59.权利要求58的细胞种群，其中所述基细胞还具有下列特征vi)至少1%的细胞表现出实施例3表II中列出的至少一种或多种基因的基因表达，例如碱性核蛋白1(BNC1)、肾连蛋白(NPNT)、纤维蛋白原a链(FGA)、膜联蛋白A8(ANXA8)、基质Gla蛋白(MGP)、透明带糖蛋白4(ZP4)、血栓调节蛋白(THBD)、同源异型框B7(HOXB7)、心脏和神经嵴表达衍生物1(HAND1)、桥粒芯胶蛋白3(DSC3)、白介素6信号转换因子(IL6ST)、水通道蛋白l(AQPl)、巻曲相关蛋白(FRZB)、血管缓激肽受体B1(BDKRB1)、生长激素受体(GHR)和激酶插入结构域受体(F"-7)(KDR)，vii)与未分化的hBS细胞相比，至少1。/。的细胞具有oct-4和nanog的基因表达下调。60.权利要求51-59任一项的细胞种群，其中对于至少10%、例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞来说，特征是有效的。61.权利要求51-60任一项的细胞种群，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%至少50%的细胞来说，特征i)是有效的。62.权利要求51-61任一项的细胞种群，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%至少50%的细胞来说，特征ii)是有效的。63.权利要求51-62任一项的细胞种群，至少10%、至少15%、至少20°/。、至少25%至少50%的细胞来说，特征iii)是有效的。64.权利要求51-63任一项的细胞种群，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%至少50%的细胞来说，特征iv)是有效的。65.权利要求51-64任一项的细胞种群，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%至少50。/。的细胞来说，特征v)是有效的。66.权利要求53-65任一项的细胞种群，其中对于至少5%、例如、至少30°/。、至少40%或其中对于至少5%、例如、至少30%、至少40%或其中对于至少5%、例如、至少30%、至少40%或其中对于至少5%、例如、至少30%、至少40°/。或其中对于至少5%、例如、至少30%、至少40%或其中对于至少5%、例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%的细胞来说，特征vi)是有效的。67.权利要求53-66任一项的细胞种群，其中对于至少5%、例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%的细胞来说，特征vii)是有效的。68.权利要求53-67任一项的细胞种群，其中对于至少5%、例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%的细胞来说，特征i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和/或vii)是有效的。69.权利要求51-68任一项的细胞种群，所述细胞种群是无外源物的。70.权利要求51-69任一项限定的细胞种群在提供MCP细胞中的应用。71.前述权利要求任一项限定的细胞种群在药物发现过程中的应用。72.权利要求l-69任一项限定的细胞种群在研究对心脏细胞类型具有潜在影响的药物的体外模型中的应用。73.权利要求1-69任一项限定的细胞种群在研究心脏发生、例如早期心脏发生的体外模型中的应用。74.权利要求1-69任一项限定的细胞种群在硏究人类心脏退变性疾病的体外模型中的应用。75.权利要求1-69任一项限定的细胞种群在体外心脏毒性测试中的应用。76.权利要求l-69任一项限定的细胞种群在再生医学中的应用。77.权利要求l-69任一项限定的细胞种群在医学中的应用。78.权利要求l-69任一项限定的细胞种群在制造预防和/或治疗由组织退变、例如心脏组织退变引起的病理和/或疾病的医药产品中的应用。79.权利要求l-69任一项限定的细胞种群在制造治疗心脏病的医药产品中的应用。80.权利要求l-69任一项限定的细胞种群在制造预防和/或治疗心脏病例如与坏死、凋亡、损伤、功能障碍和/或形态异常的心肌相关的疾病的医药产品中的应用。81.权利要求l-69任一项限定的细胞种群在制造治疗和/或预防疾病例如缺血性心脏病、心肌梗塞、风湿性心脏病、心内膜炎、自体免疫心脏病、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、心脏节律紊乱和/或心功能不全的医药产品中的应用。82.权利要求l-69任一项限定的细胞种群的一种或多种细胞在获得心肌细胞样细胞中的应用。.83.权利要求1-69任一项限定的细胞种群的一种或多种细胞在研究朝向心肌细胞样细胞的成熟中的应用。84.筛选化合物的心脏细胞毒性的方法，包括将来自权利要求1-69任一项限定的细胞种群的细胞暴露于化合物，并确定化合物是否对细胞有毒。85.筛选化合物调节心脏细胞功能的能力的方法，包括将来自权利要求l-69任一项限定的细胞种群的细胞暴露于化合物，确定细胞中任何由于与化合物接触而导致的表现型或代谢改变，并将所述改变与调节心脏细胞功能的能力相关联。基细胞和MCP细胞方法86.权利要求1-40或51-69任一项限定的细胞种群的制备方法，包括下列步骤i)将一个或多个未分化的hBS细胞的集落片或集落培养在分化培养基中悬浮培养大约1天到大约10天，例如大约1天到大约6天，ii)将这样培养的细胞转移到培养器皿中继续增殖和分化，iii)任选，通过光学显微镜中的形态标准和/或本文定义的相关标志的鉴定来鉴定基细胞，iv)任选，分离由此获得的基细胞，以及v)任选，重复步骤ii)-iv)。87.权利要求l-40任一项限定的细胞种群的制备方法，包括权利要求86限定的步骤i)-iii)以及下列步骤vi)培养基细胞，直到通过光学显微镜和/或本文定义的相关标志鉴定证实MCP细胞的出现，vii)分离由此获得的MCP细胞。88.权利要求51-69任一项限定的细胞种群的制备方法，包括下列步骤i)将hBS细胞分开并解离到悬浮液中，并将细胞悬浮液分配到多孔组织培养板中，ii)施加离心力强制细胞聚集，iii)将这样增强的3D成簇细胞以微孔板格式在分化培养基中培养大约1到大约20天，例如大约6到大约8天，iv)任选，将这样的3D培养细胞转移到培养器皿中继续增殖和分化，v)任选，通过光学显微镜中的形态标准和/或本文定义的相关标志的鉴定来鉴定基细胞，vi)任选，分离由此获得的基细胞，以及vii)任选，重复步骤iii)-iv)。89.权利要求l-40任一项限定的细胞种群的制备方法，包括权利要求88限定的步骤i)-vi)以及下列步骤viii)培养基细胞，直到通过光学显微镜和/或本文定义的相关标志的鉴定证实MCP细胞出现，ix)任选，分离由此获得的MCP细胞。90.权利要求89限定的方法，步骤ix)是通过将获得的MCP细胞用MitoFluor绿色染料进行染色，以及然后通过适合的分拣方法例如FACS进行分离。91.权利要求86-卯的方法，还包括将MCP细胞传代培养，例如用于保存、用于心脏分化、用于表征、用于药物发现、用于毒性测试、用于再生医学和/或用于获得基细胞。92.权利要求91的方法，还包括再次分离MCP细胞。93.权利要求86-92任一项的方法，其中步骤i)使用hBS细胞的未分化集落片进行。94.权利要求86-93任一项的方法，其中步骤i)中的悬浮培养在血清例如FBS或人类血清中进行。95.权利要求94的方法，其中血清的浓度为至少2%，例如大约2%到大约30%，大约5%到大约25%或大约20%。96.权利要求86-95任一项的方法，其中步骤i)进行大约1到大约6天的时期，例如大约1到大约4天，大约1到大约3天，或大约l到大约2天。97.权利要求86-96任一项的方法，其中步骤ii)在同样的或不同的培养基中进行。98.权利要求97的方法，其中培养基含有血清例如FBS或人类血清，或者它是无血清培养基。99.权利要求98的方法，其中血清的浓度，如果有的话，为至少2%，例如大约2%到大约30%,大约5%到大约25°/。或大约20%。100.权利要求86-99任一项的方法，其中步骤ii)通过将细胞直接铺于培养器皿的表面上或细胞外基质成分上来进行。101.权利要求86-100任一项的方法，其中步骤ii)迸行大约2到大约20天的时期，例如大约2到大约15天，大约2到大约10天，大约2到大约6天或大约2到大约4天。102.权利要求86-101任一项的方法，其中步骤iv)进行大约2到大约25天的时期，例如大约2到大约20天，大约2到大约15天，大约2到大约10天，大约2到大约5天或大约2到大约4天。103.权利要求41-50任一项限定的分化的MCP细胞的制备方法，该方法包括i)在分化因子和/或培养基的存在下，将MCP细胞铺于表面上以获得分化的MCP细胞。104.权利要求l-40任一项限定的MCP细胞的繁殖方法，该方法包括将MCP细胞与心脏间质细胞例如END2细胞共培养。试齐!J盒105.试剂盒，包含i)权利要求l-69任一项限定的细胞种群，ii)一种或多种成熟因子和/或成熟培养基，以及iii)任选，使用说明书。106.权利要求105的试剂盒，其中成熟培养基选自VitroHESTM、补充有bFGF的VitroHESTM、自体预调制的VitroHES、CGM培养基和其它心脏特异性培养基。107.权利要求105或106的试剂盒，其中一种或多种成熟因子选自FGF例如bFGF、BMP、5-氮杂脱氧胞苷、DMSO、视黄酸、抗坏血酸和ASA。108.权利要求105-107任一项的试剂盒，还包括监测成熟的工具。109.权利要求108的试剂盒，其中监测成熟的工具包括i)针对至少3个、例如至少4个或至少5个表达标志的编码基因的PCR引物，其中所述表达标志选自未分化hBS细胞的标志、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、短尾蛋白、巢蛋白、GFAP、Islet-1、Nkx2.5、GATA-4、cTnl、cTnT、a-MHC和连接蛋白-43，以及ii)用户手册。110.权利要求108或109任一项的试剂盒，其中监测成熟的工具包括i)针对至少3个、例如至少4个或至少5个表达标志抗原的抗体，其中所述表达标志抗原选自未分化hBS细胞的标志、结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、短尾蛋白、巢蛋白、GFAP、Islet-l、Nkx2.5、GATA-4、cTnl、cTnT、a-MHC和连接蛋白-43，以及ii)用户手册。111.用于再生医学的试剂盒，包括i)权利要求51-69任一项限定的基细胞和/或权利要求1-40任一项限定的MCP细胞，ii)任选，用于在体外和/或体内驱动分化的因子，iii)给患者施用细胞的工具或处于施用形式的细胞，例如即用注射器。全文摘要本发明公开了从人类胚泡来源的干细胞衍生的多能心脏前体(MCP)细胞的新种群，其制备方法以及所述细胞在体外测试中的应用。还公开了从hBS细胞衍生的基细胞以及从基细胞制备MCP细胞的方法。MCP细胞具有下列特征i)至少1％的细胞没有表现出未分化细胞的一种或多种标志的抗原表达，所述标志选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和Oct-4，ii)至少1％的细胞没有表现出一种或多种神经标志包括巢蛋白或GFAP的蛋白表达，iii)至少1％的细胞表现出一种或多种中胚层标志包括短尾蛋白、波形蛋白或结蛋白的蛋白和/或基因表达，iv)至少1％的细胞表现出Flk-1(KDR)的蛋白和/或基因表达。此外，MCP细胞具有特征性的形态。它们生长成小而圆的、且在亮相的细胞簇；个体细胞的直径为5-20μm，每簇由2-500个细胞构成。它们形成形状为圆形或细长形的簇，表现为图2的a、b和c部分显示的松散粘附的细胞团。此外，它们在细胞总体积中具有相对高的细胞核-细胞质比率，例如1∶2-1∶64，和/或显得象带线的气球，如图18中的示意略图所示。此外，MCP细胞是非收缩性的。文档编号C12N5/077GK101517069SQ200780026558公开日2009年8月26日申请日期2007年7月13日优先权日2006年7月13日发明者卡罗利妮·阿克松,卡罗琳·阿梅,彼得·萨蒂皮申请人:塞拉帝思股份公司