专利名称：胎盘来源间充质干细胞及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及胎盘来源间充质干细胞及其制备，属于干细胞与组织工程领域。
背景技术：
种子细胞来源是组织工程和细胞治疗的首要问题。由于自体组织细胞来源少、扩增困难，体外培养时容易丢失表型，因此近年来人们逐渐把注意力投注在干细胞上。这些细胞在体外具有一定的自我更新能力，能在特定的诱导条件下分化为一种、多种，甚至人体所有的细胞类型，因而显示了很好的临床应用前景。目前为止分离获得的干细胞包括两种，即胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有全能的分化能力和无限的增殖能力，但受伦理学和本身在分离、培养、诱导分化和免疫原性等方面人类认识和控制上的不足，短期内无法应用于临床。成体干细胞是从成体的组织中分离获得的一类干细胞，这些细胞具有一定的体外增殖能力，在一定的条件下能在体外或体内分化为一种或多种细胞类型。目前研究最多的是骨髓来源的间充质干细胞，该细胞取材相对较为容易。其他组织，包括脂肪、肌肉、神经、牙髓等成体组织中也发现有干细胞的存在，但取材和分离相对而言较为困难。并且这些细胞在取材的时候都会对患者造成创伤，因而不容易被患者接受；体外扩增条件也不容易控制、花费大。另外一个不容忽略的问题是，这些细胞都具有一定的抗原性，异体移植时会带来免疫排斥反应问题，因此在临床应用时会受到限制。基于此，寻找一种收获量大、免疫原性小、而又容易获得的干细胞来源更具有实际应用价值。
胎盘是胎儿的附属物，也是一个暂时性器官，在胎儿娩出后即完成了历史使命，通常都被遗弃处理。胎盘本身结构复杂，由血管系统、间充质成分和滋养细胞组成。除具有母儿物质交换功能外，还是一个重要的分泌器官，执行着极其复杂的生理功能。近年研究表明，胎盘组织中具有与骨髓间充质干细胞类似的贴壁细胞。国外Jaroscak等(2000年)报道从冻存的胎盘组织中分离培养出异质性贴壁细胞。国内张毅等报道采用酶消化法从胎盘组织中获得贴壁细胞作为造血干细胞的支持细胞。因此，胎盘组织有望成为间充质干细胞的潜在的丰富的来源。目前国内外仅有零星文献涉及胎盘来源贴壁细胞的小量分离，主要用于造血支持研究，而对胎盘来源间充质干细胞的规模化分离、纯化和扩增方法则缺乏的详细的技术资料。本发明的目的在于公开一种胎盘来源的间充质干细胞以及从胎盘组织中大规模获取间充质干细胞的方法，具体涉及细胞的分离、纯化、鉴定和扩增。
发明内容
本发明是一种胎盘来源的间充质干细胞及其制备方法。该细胞取自产后废弃的健康胎盘组织，该细胞群具有与骨髓来源的间充质干细胞类似的生物学特性，是细胞治疗和组织工程研究与应用潜在的细胞来源。其制备方法如下1)对新鲜娩出胎盘立即进行放血、灌注，以去除血细胞和组织碎片；2)持续灌注，或将胎盘小叶剪碎，用胶原酶消化，收集细胞成分；3)采用免疫磁珠吸附法或Percoll密度梯度离心法收集单个核细胞；4)采用流式细胞仪或体外诱导分化法鉴定所获得细胞群的表型和细胞周期特征；5)测定细胞倍增时间和生长曲线；6)采用常规的体外诱导体系，体外诱导胎盘来源的间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的能力。
7)将胎盘来源的间充质干细胞与同种异体的外周血T-淋巴细胞共同培养，检测胎盘来源的间充质干细胞是否刺激T-淋巴细胞增殖，是否抑制同种异体树突状细胞介导，不依赖于分泌因子的通过细胞机制产生的T-淋巴细胞增殖；将胎盘来源的间充质干细胞注入大鼠皮下，检测免疫反应情况，以确定该细胞的免疫原性。
8)采用生物反应器对所获得的细胞进行规模化扩增。
有益效果本发明从产后废弃的胎盘组织中提取间充质干细胞。该细胞取材容易，产量高，体外容易扩增，扩增过程中能够保持细胞表型和多向分化能力。并且，该细胞群还具有较低的免疫原性，因而是细胞治疗、基因治疗，以及骨与软骨组织工程理想的种子细胞来源，具有广阔的临床应用前景。
具体实施例方式
实施例1灌注法获得胎盘来源间充质干细胞胎盘娩出后立即置于无菌托盘或容器中，经脐动脉注入含有抗凝剂和抗生素的平衡盐溶液，放血，并开始灌注。抗凝剂可以是1~100u/mL的肝素，抗生素可以是100u/mL的青链霉素。收集灌注液，离心获得细胞成分，再将细胞成分重新悬浮，用密度为1.073g/mL的percoll，以500g离心力离心30分钟，收获界面细胞层，PBS洗涤后接种培养瓶或培养板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR标记的免疫磁珠来分离带有某种特殊标记的间充质干细胞。
实施例2酶消化法获得胎盘来源间充质干细胞胎盘娩出后立即置于无菌托盘或容器中，经脐动脉注入含有抗凝剂和抗生素的平衡盐溶液，放血，并开始灌注。抗凝剂可以是1~100u/mL的肝素，抗生素可以是100u/mL的青链霉素。初步灌注后无菌剪取胎盘小叶，用胰蛋白酶或胶原酶消化胎盘组织，获得细胞悬液，再将细胞悬液过细胞筛，除去组织碎片和血细胞，获得的细胞重新悬浮，用密度为1.073g/mL的percoll，以500g离心力离心30分钟，收获界面细胞层，PBS洗涤后接种培养瓶或培养板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR标记的免疫磁珠来分离带有某种特殊标记的间充质干细胞。
实施例3胎盘来源间充质干细胞的鉴定根据文献报道体外诱导骨髓间充质干细胞分化的方法诱导胎盘来源的间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。采用流式细胞仪检测胎盘来源间充质干细胞的表型，如CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR等。同时检测细胞周期，确定处于G0-G1期细胞的比例。
结果显示，经过体外诱导后的胎盘来源的间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。流式细胞以检测表明该细胞CD29、CD44、CD105、CD166阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性。处于G0-G1期的细胞占95％以上。
权利要求
1.一种胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于应用灌注法或酶消化法从胎盘组织中分离间充质干细胞。所获得的细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的特征，如自我更新能力和多向分化潜力。
2.权利要求1中所述的胎盘可以是人自然分娩或剖腹产后废弃的胎盘，也可以是哺乳动物的胎盘。产妇或动物必须经过健康检查，无遗传病、感染性疾病，不携带病原。胎盘本身必须新鲜，或放血后4℃保存2-24小时，或冷冻保存后仍有活力，同时离体后保持清洁无污染。
3.权利要求1中所述的灌注法是指在胎儿娩出后立即放血，并经脐动脉插管进行灌注。灌注液可以是生理盐水或PBS类的平衡盐溶液，也可以是无血清的细胞培养基。灌注液中添加抗凝剂和抗生素。抗凝剂可以是肝素。抗生素可以是青霉素和链霉素，也可以是庆大霉素。
4.权利要求1中所述的酶消化法是指应用胶原酶I，浓度可以是0.5％-1.5％，或应用胰蛋白酶，浓度可以是0.1％-1％，胰蛋白酶中可以加入0.01％-0.02％的EDTA。
5.权利要求1中所述的胚胎来源的间充质干细胞表面标志CD29、CD44、CD105、CD166阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性。处于G0-G1期的细胞占95％以上。细胞经相应的诱导液处理后可以分化为成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等细胞类型。
6.权利要求1中所述的胎盘来源的间充质干细胞可以通过percoll密度梯度离心法或免疫磁珠分离法得到纯化。
7.权利要求6中所述的percoll的密度可以是1.073g/ml。
8.权利要求6中所述的免疫磁珠法可以是D7-FIB标记，也可以是NGFR标记。
9.权利要求1中所述的胎盘来源间充质干细胞可以用于细胞治疗、基因治疗，也可以作为种子细胞用于组织工程。
全文摘要
本发明涉及胎盘来源间充质干细胞及其制备，属于干细胞和组织工程领域。胎盘从子宫娩出后立即放血、灌注。然后采用持续灌注或胶原酶消化法获得单细胞悬液，后者经密度梯度离心法或免疫磁珠分离法获得间充质干细胞。所获得的间充质干细胞具有与骨髓来源的间充质干细胞类似的体外增殖潜力和多向分化潜力。该细胞群还具有免疫原性较低的特点，是组织工程和细胞治疗潜在的种子细胞来源，具有重要的临床意义。
文档编号A61K48/00GK1746297SQ20041000953
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月9日 优先权日2004年9月9日
发明者王常勇, 郭希民, 周晓东, 段翠密, 江红, 董灵芝, 李晶 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所