用于治疗血液病症的富集和扩增的人脐带血干细胞的制作方法
【专利说明】用于治疗血液病症的富集和扩増的人脐带血干细胞
[00011 本申请要求2013年5月20日提交的美国临时专利申请序列No. 61/825,354和2014 年4月24日提交的美国临时专利申请序列No. 61/983，805的权益，所述临时专利申请两者特 此以全文引用的方式并入。 发明领域
[0002] 本发明涉及富集和扩增的人脐带血干细胞、其产生方法，和治疗方法。
[0003] 发明背景
[0004]脐带血（"CB"）造血干细胞（"HSC"）具有使其区别于其成人对应物的众多表型特性 和功能特性（Cairo等，"Placental and/or Umbilical Cord Blood:An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation，"Blood 90:4665-4678 (1997) ; Dah I berg等，"Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Ce11s，"Bloodll7:6083_6090(20ll);Delaney等，"Cord Blood Graft EngineeringZiBiol-Blood Marrow Transplant 19(I):S74-S78(2013);Navarrete等， "Cord Blood Banking:A Historical Perspective /iBr-J.Haematol.147:236-245 (2009);Stanevsky等，"UmbiIical Cord Blood Transplantation : Pros , Cons and Beyond/'Blood Rev. 23:199-204(2009) )XB CD34+细胞由于其广泛的增殖能力、其在体外 产生造血集落的能力增加、其产生含有胎儿血红蛋白的红系细胞的能力，和较小数目的这 些细胞重新构成清髓的同种异体接受者的能力，而被认为是更原始的（Cairo等， "Placental and/or Umbilical Cord Blood:An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation，"Blood 90:4665-4678(1997))。由于单一CB收集物中 存在有限数目的干细胞，因此使用CB细胞作为罹患血液恶性肿瘤和遗传病症的同种异体干 细胞接受者的HSC移植物已经局限于儿童或较小成人接受者(Cairo等，"Placental and/or Umbilical Cord Blood:An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for TranspIantation，"BIood90:4665-4678(1997);Navarrete等，"Cord Blood Banking:A Historical Perspective，"Br.J.HaematoI·147:236-245(2009);Stanevsky等， "Umbilical Cord Blood Transplantation:Pros，Cons and Beyondj^Blood Rev.23:199-204(2009))。这些限制导致在成人接受者中不可接受的高移植失败率和延迟的植入动力学 (Cairo等，"Placental and/ or Umbilical Cord Blood:An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation，"Blood 90:4665-4678(1997)； Dahlberg等，"Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells，"Blood 117:6083-6090(2011);Delaney等，"Cord Blood Graft Engineering，" Biol.Blood Marrow Transplant 19(1):S74_S78(2013);Navarrete等，"Cord Blood Banking:A Historical Perspective，"Br·J.Haematol·147:236-245(2009);Stanevsky 等，"Umbilical Cord Blood Transplantation:Pros,Cons and Beyondj^Blood Rev.23: 199-204(2009);Barker等，"Combined Effect of Total Nucleated Cell Dose and HLA Match on Transplantation Outcome in 1061Cord Blood Recipients with Hematologic Malignancies，"Blood 115:1843-1849(2010);Delaney等，"Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients ,''Expert Rev. Hematol.3:273-283(2010))。克服这些障碍的尝试包括几种不同的策略，例如使用能 够促进HSC循环和这些CD34+细胞(2、6-9)的后续分裂的多种细胞因子组合进行两种不同CB 移植物的输注或CB CD34+细胞的离体扩增。对于离体干细胞扩增的这些初始尝试已经导致 产生较大数目的造血祖细胞和前体细胞，但骨髓重建细胞的数目降低。HSC在很大程度上是 在体内缓慢循环的休眠细胞^(Giebel等，"Primitive Human Hematopoietic Cells Give Rise to Differentially Specified Daughter Cells Upon their Initial Cell Divisi on，"Blood 107(5):2146-2152(2006);Ho等，"The Beauty of Asymmetry : Asymmetric Divisions and Self-Renewal in the Haematopoietic System，'， Curr·Opin·Hematol·14(4):330-336(2007);Huang等，"Symmetry of Initial Cell Divisions Among Primitive Hematopoietic Progenitors Is Independent of Ontogenic Age and Regulatory Molecules，"Blood 94(8):2595-2604(1999);Srour等， "Modulation of In vitro Proliferation Kinetics and Primitive Hematopoietic Potential of Individual Human CD34+CD38_/lo Cells in G0，"Blood 105(8):3109-3116(2005))。在这些细胞因子组合存在下发生的CB CD34+细胞的快速离体循环和分裂导 致HSC定型，其中残余骨髓重建潜能归因于已保持静止或已经历有限数目的细胞分裂的一 小部分的干细胞（10-13)。最近，由于希望扩增可移植的CB HSC的数目，已经将间充质细胞 饲养层或许多分子如固定化notch配体、铜螯合剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)、全反式 视黄酸、芳基烃受体拮抗剂、前列腺素 E2(PGE2)或c-MPL激动剂添加至这些细胞因子组合 (Dahlberg等，"Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells，"Blood 117:6083-6090(2011);Delaney等，"Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients ,Expert Rev.Hemato1.3:273-283(2010);Boitano等，"Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem CellsScience329:1345-1348(2010)；De Felice等，"Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid Enhances the Cytokine-Induced Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells，'，Cancer Res.65:1505-1513 (2005);Himburg等，"Pleiotrophin Regulates the Expansion and Regeneration of Hematopoietic Stem Cells，"Nat.Med.16:475-482(2010);Milhem等，"Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A，'， Blood 103:4102-4110(2004);Nishino等，"Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells by a Small-Molecule Agonist of c-MPL /iExp.Hematol.37:1364-1377el364.(2009);North等，"Prostaglandin E2Regulates Vertebrate Haematopoietic Stem Cell Homeostasis/'Nature 447:1007-1011 (2007))。这些方法中的几种已经在临床 试验中进行了评估，但导致产生较大数目的短期而非长期骨髓重建细胞(Dahlberg等，"Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells，'，Blood 117: 6083-6090(2011);de Lima等，"Transplantation of Ex vivo Expanded Cord Blood Cells Using the Copper Chelator Tetraethylenepentamine:A Phase I/II Clinical Trial，'，Bone Marrow Transplant 41:771 _7 78(2008);de Lima等，"Cord-Blood Engraftment with Ex Vivo Mesenchymal-Ce11 Coculture /iN-Engl.J.Med.367(24): 2305-2315(2012);Delaney等，"Notch-Mediated Expansion of Human Cord Blood Progenitor Cells Capable of Rapid Myeloid Reconstitution，"Nat.Med.16(2):232-236(2010)) 可选地，也在寻求促进CB CD34+细胞的归巢和植入的效率的策略以增加同种 异体CB移植的功效（Goessling等，"Prostaglandin E2Enhances Human Cord Blood Stem Cell Xenotransplants and Shows Long-Term Safety in Preclinical Nonhuman Primate Transplant Models，"Cell Stem Cell 8(4):445-458(2011);Hoggatt等， "Differential Stem and Progenitor-Cell Trafficking by Prostaglandin E2，'， Nature 495(7441):365-369(2013);0'Leary等，"The Role of Dipeptidyl Peptidase 4in Hematopoiesis and Transplantation Curr . Opin . Hematol. 20(4): 314-319 (2013))〇
[0005]已经提出了一种扩增功能性CB HSC的数目的可选方法。这种方法基于如下假设： 使用含血清（SC)培养基和细胞因子组合离体扩增HSC的先前尝试实际上导致HSC遗传程序 的沉默（DahIberg等，"Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells，"Blood 117:6083-6090(2011);Delaney等，"Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients ,''Expert Rev·Hematol.3:273-283(2010);Rao等，"Conei se Review : Cord Blood Banking， Transplantation and Induced Pluripotent Stem Cell:Success and Opportunities，'， Stem Cells 30:55-60(2012);Milhem等，"Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza2Jdeoxycytidine and Trichostatin Aj^Blood 103:4102-4110(2004)； Araki等，"Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-RepopuIating Cells Using Chromatin-Modifying Agents，"Exp·Hematol·34:140-149(2006); Araki等， "Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential，" Bloodl09:3570-3578(2007);Azuara等，"Chromatin Signatures of Pluripotent Cell Lines，"Nat·Cell Biol·8:532-538(2006);Chaurasia等，"Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells，"Blood 117:4632_4641(2011);Delcuve等，"Roles of Histone Deacetylases in Epigenetic Regulation: Emerging Paradigms from Studies with Inhibitors，'， Clin.Epigenetics 4(I):5(2012);Gul等，"Valproic Acid Increases CXCR4Expression in Hematopoietic Stem/Progenitor Cells by Chromatin Remodeling，'，Stem Cells Dev. 18:831-838(2009))。这种可选策略与越来越多的证据相一致，所述证据表明，表观遗 传机制在确定HSC是经历对称分裂并产生另外的干细胞，还是经历充其量维持HSC数目而同 时产生造血祖细胞(HPC)的不对称分裂，或是经历减少HSC数目并产生更大数目的HPC的对 称定向分裂中起到重要作用（Araki等，"Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-Repopulating Cells Using Chromatin-Modifying Agents，'，Exp.Hematol .34:140-149(2006);Araki等，"Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential，"Blood 109:3570_3578(2007);Asai等，"Necdin，a p53Target Gene， Regulates the Quiescence and Response to Genotoxic Stress of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells，"Blood 120(8):1601-1612(2012);Li，"Quiescence Regulators for Hematopoietic Stem Cell，"Exp.Hematol.39(5):511_520(2011);Will等， aSatblRegulates the Self-Renewal of Hematopoietic Stem Cells by Promoting Quiescence and Repressing Differentiation Commitment,''Nat·Immunol·14(5):437-445(2013);Wilson等，"Hematopoietic Stem Cells Reversibly Switch from Dormancy to Self-Renewal During Homeostasis and Repair,''Cell 135(6):1118_1129(2008))〇
[0006] 本发明涉及克服本领域中的这些和其他缺点。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明的一个方面涉及分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体。所述扩增的干 细胞表达CD34+、CD90+、CD 184+、CD 117+、CD49f +、ALDH+、CD45RA-和多能性基因 S0X2、0CT4、 NANOG和ZIC3〇
[0009] 本发明的另一个方面涉及产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的方法。 这种方法涉及提供人脐带血干细胞的分离群体并且在有效产生分离和扩增的人脐带血干 细胞的富集群体的条件下在组蛋白脱乙酰酶抑制剂（"HDACI"）存在下在不含血清（"SF"）培 养体系中处理所述人脐带血干细胞的分离群体。所述扩增的干细胞表达CD34+、CD90 +、 CD 184+、CD 117+、CD49f+、ALDH+、CD45RA-和多能性基因 S0X2、0CT4、NANOG和ZIC3。
[0010] 本发明的另一个方面涉及治疗受试者的血液病症的方法。这种方法涉及向所述受 试者施用本发明的分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体以治疗所述受试者中的所述 血液病症。
[0011]在本发明中，在不含血清的培养条件下经过HDACI处理的⑶34+细胞显示能够产生 另外的CD34+细胞，其具有许多与原始干细胞相关的特征，包括增加的醛脱氢酶(ALDH)活 性，增加的 CD90、c-Ki t (CD 117)、整合素 a6 (CD49f)和CXCR4 (CD 184)的表达，但缺乏CD45RA表 达（Notta等，"Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment/'Science 333(6039) :218_221(2011))。另外，包 括S0X2、0CT4(也称为P0U5FI)、NAN0G和小脑锌指蛋白家族成员3 (ZIC3，也称为HTX)、但不包 括hTERT(端粒酶反转录酶)的多种多能性基因的上调与丙戊酸(VPA)处理相关(Azuara等， "Chromatin Signatures of Pluripotent Cell Lines /'Nat. Cell Biol.8:532-538 (2006))。在HDACI处理的CD34+细胞中的S0X2、0CT4和NANOG的基因敲低导致CD34+和CD34+ CD90+细胞数目急剧降低。已发现，在SF培养条件下用HDACI处理能够将CB⑶34+细胞分裂 程序化以产生更大数目的原始细胞，所述原始细胞能够重建受辐照和二代免疫缺陷接受者 小鼠而不形成血液恶性肿瘤或畸胎瘤。有限稀释分析表明，在VPA处理细胞中的SCID重建细 胞(SRC)数目是原代CB CD34+细胞(PC)中的36倍。这些数据表明，上调干细胞特异性转录因 子的表观遗传策略导致分裂的CB HSC的自我更新和多谱系分化能力的保存。
[0012] 附图简述
[0013] 图IA-D示出HDACI对CB CD34+、CD34+CD90+和CD34+CD90+CD184+细胞的离体扩增 的影响。图IA是原代脐带血(CB)CD34+细胞(PC)的离体扩增策略的示意图。在不含血清(SF) 或含血清(SC)培养基中用细胞因子激活新鲜分离的PC持续16小时。然后在所述培养条件下 在具有或不具有其他细胞因子的情况下在存在/不存在组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)的 情况下进一步处理细胞7天。将扩增的细胞/再次分离的CD34+细胞用于进一步分析。在含细 胞因子的SF培养基中在不存在（对照）或存在丙戊酸（VPA)、Scriptaid(SCR)SCAY10433 (C433)的情况下将单独的CB PC处理7天。VPA相比于其他HDACI导致每个CB收集物产生显著 更大绝对数目的CD34+细胞(*p〈0 · 05和#p〈0 ·005)(图 IB)、CD34+CD90+细胞(*p〈0 · 05和**p 〈0.005)(图 1C)和CD34+CD90+CD184+细胞（*#ρ = 0·0005)(图ID)(平均值土SE;图 1B、图 IC (ANOVA，p< 0.0007)和图lD(AN0VA，p<0.0001))，（n = 6-7)。
[0014] 图2A-B示出VPA对CB CD34+和CD34+CD90+细胞的离体扩增的影响。在图2A中，在不 含血清(SF)的培养物中发生在细胞因子存在下的CB CD34+和CD34+CD90+细胞的产生比于 含血清(SC)的培养物中发生的程度更大。在含VPA的SF培养物中，相比于SC培养物，观察到 CD34+和CD34+CD90+细胞的增加倍数的显著差异。叶〈0.05，*邙〈0.005，#吨〈0.0005(平均 值土 SE; ANOVA，p〈0.0001)，（η = 5-7)。图2B示出在SF培养基中在对照条件下或在VPA存在下 处理的PC和CD34+细胞的表型分析。对于每个细胞群体分析CD34、CD90、CXCR4(CD184)、 ⑶49f和⑶45RA的表达。描绘了⑶34+⑶90+细胞(方框）的⑶184、⑶49f和⑶45RA的共表达(η =4)〇
[0015] 图3Α-Β示出VPA对⑶34+细胞迀移和归巢的影响。图3Α示出在不存在(对照)或存在 VPA(7天）的情况下产生的再次分离的CD34+细胞的SDFl(100ng/mL)诱导迀移的结果。在16 小时和48小时后显著更大数目的VPA处理的⑶34+细胞向SDFl迀移（平均值土 SE，*p〈0.05， 单尾t检验），（n = 4)。图3B示出在输注后16小时和48小时在不存在(对照）或存在VPA(7天） 的情况下产生的再次分离的CD34+细胞在NSG小鼠中的归巢(平均值土 SE，##p〈0.0001，*p 〈0.05 KNSG 接受者小鼠 （η = 35)。
[0016] 图4Α-Β示出VPA对CD34+CD90+细胞的细胞周期的不同阶段的影响。图4Α示出在对 照(上图：26.4% )条件下SF培养或含有VPA的培养物(下图：82.9% )处理7天后的⑶34+⑶90 +细胞的流式细胞术细胞周期分析，其中相应的点图通过BrdU脉冲标记(2.5小时)并用7AAD 染色示出细胞周期的不同阶段的细胞(G0/G1、S和G2/M)。示出了 3个代表性实验之一。图4B 示出在细胞周期的不同阶段中的CD34+CD90+细胞的百分比。在含VPA的培养物中在G0/G1 (* p〈0.05)、S(*P〈0.05)和G2/M(##p〈0.0001)阶段中观察到CD34+CD90+细胞的数目显著增 加（平均值土SD;AN0VAp〈0.002)，（n = 3)。
[0017] 图5A-B示出VP