收集和使用胎盘脐血干细胞的方法

专利名称：：收集和使用胎盘脐血干细胞的方法
技术领域：
：本发明的主题涉及收集胎盘脐血干细胞的高效方法和使用收集的干细胞的方法。
背景技术：
：1.本发明的领域本发明的主题涉及从胎盘收集干细胞，其中详细设计了一种临床上可行的、方便和高效的新方法。特别是，本发明描述了一个新的发现，即通过机械搏动灌注收集的残留胎盘脐血细胞与由常规的针/注射器吸取或重力引流收集方式获得的胎盘脐血细胞相比更富含原始造血干细胞表型，因而使得脐血细胞能够用于再生的医学目的。使用所描述的方法从单个胎盘获得的干细胞数的增加也可以改善异源造血干细胞移植的结果和避免为了补偿来自单个供体移植物的干细胞的量不足而使用来自不同供体的两元或三元的脐带血移植物。2.
背景技术：
的描述炎襄才法和4'乂脐带CB细胞对于针对造血系统恶性肺瘤和骨髓衰竭综合征进行异源HSC移植是很有前途的HSC的来源(Kurtzberg等，1996;Wagner等，1996;Gluckman等，1997;Rubinstein等，1998)。其显著的优势包括快速地获取在全国范围的CB银行中储存的CB细胞，及由于与匹配6的无关供体(unrelateddonor)移植物相比很少发生严重的移植物抗宿主病(GVHD)(Barker等，2002),可以接受1-2个人类白血病抗原失配的移植物。CB细胞使得病人能够在没有另外合适的匹配供体的情况下(特别是在少数族群的病人中)选择异源移植作为造血系统恶性肿瘤的治疗方法。尽管具有以上的优势，CB在成人中的应用由于细胞(包括CD34+细胞和祖细胞)数目的不足而受到限制。采用低水平总有核细胞计数的CB移植导致嗜中性细胞和血小板的移植后植入(engraftment)显著延迟或植入失败(Wagner等，2002;Laughlin等，2004)。已知的采集CB的过程包括通过重力从分娩的胎盘排出血液和通过静脉穿刺将血液排到收集袋或注射器中。由于CB供应甚至几乎不足以进行单次的使用或者新近使用来自两个不同供体的二元CB供应，因此成人CB移植一般仅在没有合适的无关供体的时候在临床研究的基础上进行。实际上，仅20-40ml的回收量并不少见，而因此这些CB细胞甚至没有被使用或储存(Lasky等，2002;George等，2006)。在这种情况下，由于没有可以在最初采集后对CB细胞进行补充收集的标准化补充方法，大量的未收集的CB细胞仍保留在胎盘中并被丢弃了。为了扩大将来的CB银行供体库，研究改进的CB采集方法(包括如何在常规的CB采集后收集遗留的剩余CB细胞)是重要的(Harris等，1994)。更重要的是，从同一胎盘获得更大量的CB细胞可以储存足以用于多项用途的CB细胞量，包括备份或移植物工程(如，体外扩增和过继性免疫治疗)。^f//5"C^T,^f口逾织存^^乂识在过去的十年内，在人体内鉴定出了许多类型的具有复制、自我更新和分化能力的干细胞。全能干细胞能够形成每一种类型的体细胞，且这些细胞处在早期胚胎中，是所谓的人ES细胞。多能干细胞能够发育成内胚层、中胚层或外胚层。组织特异性干细胞仅用于产生特定的组织。例如，造血干细胞(HSC)负责产生所有类型的血细胞，但不负责产生其它的组织类型，且它们在成人体内的持续存在提供了修复能力。但是，研究者发现，象被认为负责产生不同类型的造血祖细胞的成体HSC那样的细胞甚至也产生不同组织或器官的细胞，如神经细胞或肌肉细胞。关于成体HSC的转分化的探索研究仍然存在争议，且还在进行着活跃的研究工作。相反，许多临床病例报告了在BM移植或心脏移植后非造血细胞发生的证据。寻找BM移植后BM向脑转分化的追溯研究显示了神经生成(neuropoiesis)的证据，在长期情况中检测到星形细胞和小胶质细胞而没有细胞融合(Cogle等，2004)。其它的报道提到了在BM移植之后在成骨细胞、肝细胞、胃肠(GI)道上皮细胞、间质中，在外周血干细胞移植之后在角质形成细胞/肝细胞/GI道/皮肤上皮细胞中，和在心脏移植之后在带或不带内皮细胞的心肌细胞中，检测到大百分范围的供体细胞(Hruban等，1993;Theise等，2000;Korbling等，2002;Muller等，2002;Okamoto等，2002;Quaini等，2002)。沐于勿/S^源勿/《虽然人ES细胞可以在体外分化和扩增以产生不同类型的祖细胞，但其在病人中的应用最近受到了多种伦理问题的阻碍。另外，必须要解决胚胎干细胞源的祖细胞的纯度问题。与此相反，源自造血组织(包括骨髓和脐带CB细胞)的成体干细胞群被发现能够在受到适当的刺激时分化成外胚层或内胚层(Eglitis和Mezey,1997;Brazelton等，2000;Mezey等，2000;Sanchez-Ramos等，2001;Chen等，2005)。特别是，由于CB源的干细胞是从通常被丢弃的胎盘中收集，因而不需要在采集细胞时对主体造成组织损伤，因此它们与其它来源相比具有更进一步的优势。与BM细胞相比，CB为带有幼稚免疫状态和相对未缩短的端粒长度的原始个体发生。在关于是否存在真正多能的体干细月包(somaticstemcell)的争论中，源自CB和胎盘的细胞由于包含用于潜在临床应用的令人感兴趣的性质而日益受到关注。最近，CB已被证明包含异质细胞群并被认为是多能干细胞源(Goodwin等，2001;Sanchez-Ramos等，2001;8Bicknese等，2002;Sanchez-Ramos,2002;Zigova等，2002)。其他人报道，在语系阳性细胞耗竭(lineagepositivecelldepletion)后从一周时间的CB细胞悬浮培养中分离的粘附细胞群被证明表现外胚层和内胚层特征的免疫组织化学证据(McGuckin等，2004)。现有一系列的对患有神经退行性疾病克拉勃脑白质营养不良的儿童成功地进行CB移植的报道(Escolar等，2005)。本发明人推测，在CB干细胞中发现的这些独特的特征可能是由于最近公开的一种新兴的概念，即，妊娠胎盘可能是胚胎发育过程中的造血生境(niche)(Gekas等，2005;Ottersbach和Dzierzak,2005)。可以简单地假设，足月的胎盘也可能包含粘附到血管生境的残余原始干细胞，或者可能由于与"出生(birth)"相关的应激，从胎儿BM或肝脏释放的、已经迁移到胎盘生境中的循环干细胞的数目可能增加。因此，本发明人推测，通过本发明获得的源自胎盘的CB细胞可能包含更多的自胚胎发生以来作为残余干细胞沉积在胎盘血管床生境中的原始千细胞(ES细胞样细胞)。逸括E51勿應#勿應和#始//5^的^f始C5细應的为、專和^净为使用胚胎、造血和神经干细胞的基因表达i普的比较分析鉴别共同的千细胞标志物，仅一个基因得到确认(可能是由于技术困难)(Fortimel等，2003)。因此，识别和选择干细胞可能仍需要几个标志物以将这些细胞分离开来。可以用于区别干细胞的特性之一是不存在分化标志物。这一方法已广泛地用于HSC领域以进行干细胞的富集，从而用于治疗。这一"语系阴性(Lin-)"特性是许多干细胞群的共同性质(Cai等，2004b)。为进一步从Lin-CB细胞富集干细胞群，已经有报道，CD133+标志物在生长因子刺激下显示出高增殖潜力(Forraz等,2004)。其他人报道，〔0133+/€034-细胞亚群可能代表更原始的干细胞，因为它们不在曱基纤维素中产生集落形成细胞(CFC)，而表现出最高的SCID再植细胞频率(Kuci等，2003)。如阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的胚胎干细胞标志物仅在9ES细胞上表达，ES细胞已广泛用于与FACS分析(其可从市场得到)相容的多能干细胞和抗体的鉴定。新近Kucia等人描述了携带1^-/0045-/0乂014+/^0133+^:034+表型的称为"极小胚胎样(VSEL)千细胞"的原始干细胞群(Kucia等，2006)。这些细胞对于胚胎转录因子Oct-4和Nanog也是阳性的。可选择地，利用一般代谢标志物的存在的方法也已用于识别和分离干细胞。已被描述的代谢标志物中的一种是醛脱氬酶(ALDH)(Takebe等，2001)。ALDH的荧光底物-Aldefluor(StemCell)-已被用于在神经干细胞(Cai等，2004b;Corti等，2006)和HSC(Storms等，1999)中证明ALDH活性的增加。这种非毒性的、活体标记方法也可以用于识别其它干细胞群(Cai等，2004a)。此外，若丹明摄取和Hoechst染料标记已被用于从BM、CB、间充质、肌肉和成人脑选择干细胞群(Kim等，2002;Bhattacharya等，2003;Migishima等，2003;Pa画r等，2003)。由Hoechst染料33342的低摄取证明的侧群(SP)代表了最高的自我更新能力和多能性。Hoechst染料的摄取通过膜转运体ABCG2调节，因而SP群由ABCG2蛋白的表达限定(Zhou等，2001;Scharenberg等，2002)。ABCG2蛋白也在神经干细胞中特异性地表达，且在前体细胞分化时表达下降(Cai等，2002)。乂类造i勿應浮,秀的#,^勿/《脊》化^证^自从BM间质源的祖细胞被首次报道在小鼠中分化成肌肉、神经胶质和肝细胞以来，现在有越来越多的关于这些细胞分化成神经细胞的报道(Azizi等，1998;Fe認i等，1998;Petersen等，1999)。已经报道了在用视黄酸、表皮生长因子(EGF)或脑源神经营养因子(BDNF)刺激后，在源自人和啮齿动物BM间质细胞的细胞中诱导神经元特异性蛋白质的体外证据，如巢蛋白(nestin)、神经元特异性核蛋白(NeuN)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(Sanchez-Ramos等，2000)。在非间充质造血祖细胞中，已有几个报告显示，包括分离的CD133+细胞的人CB单核细胞在暴露于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和hEGF后被诱导体外表达神经元和神经胶质标志物，如(3-微管蛋白III、GFAP，且在暴露于视黄酸和神经生长因子(NGF)后还表达Musashi-l(Sanchez-Ramos等，2001;Bicknese等，2002)。造j&惑。敏^屑^力嚴^勿/《脊为V么W证^原先，在小鼠模型中肝细胞被认为是由注入的BM细胞转化的(Lagasse等，2000),但后来在特定的肝脏再生模型中发现它是由细胞融合引起的(Wang等，2003b)。其他人也发现，BMHSC来源的骨髓单核细胞是肝细胞融合伴体的主要来源(Camargo等，2004)。通过在谱系阳性细胞耗竭过程后进行一周悬浮培养分离的CB细胞形成了粘附细胞群，其被发现在用肝细胞生长培养基进一步孵育后表达肝细胞的标志物(McGuckin等，2005)。已经报道了在CBCD34+CD38-CD7-移植后用CC14处理的免疫缺陷小鼠肝脏中肝细胞样细胞发育的体内证据(Wang等，2003a),且新近在使用胎绵羊的非损伤模型中，通过利用人HSC的胎绵羊BM重建产生了人肝细胞，人HSC包括源自BM、外周血或CB的任一种的CD34+/Lin-、CD34-/Lin-、CD34+/Lin-/CD38-、CD34-/Lin-/CD38-、CD34+/Lin-/CD133+、CD34+/Lin-/CD133-(Almeida-Pomda等，2004)。
发明内容本发明的主题涉及从胎盘收集脐血(CB)源的干细胞的新方法。在本发明的一种实施方式中，可以通过搏动机械胎盘灌注(PMPP)方法进行胎盘灌注。PMPP可以与常规的收集方法组合，通常是静脉穿刺(用针和注射器抽吸脐带脉管系统)或重力引流，或者不进行预先的收集。PMPP可以用含抗凝血剂的器官灌注溶液进行以将脐血细胞冲出，然后收集所获得的含干细胞的灌注液。这一方法不需要在分娩后进行任何制备或将抗凝血剂注入胎盘中来防止凝结。离体的胎盘可以在灌注之前通过例如置于冰上进行冷却。如果灌注是在胎盘离体的一个小时之内进行，胎盘不需要在灌注之前进行冷却。如果胎盘在进行灌注之前经过制备或注射了抗凝血剂，当前描述的方法仍可以进行。如果脐血细胞首先使用常规j方法收集，通过PMPP获得的剩余脐血细胞可以添加到该初始收集物中。PMPP获得的脐血细胞也可以作为备份细胞储存或储存用于将来的细胞移植工程和再生性医学目的。不需要立即将脐血干细胞从胎盘中去除产生的便利性和不需要进行任何进一步的制备而将其直接置于冰上运送到中心实验室的能力使得这一方法对于在当前建立的脐血细胞银行系统中应用具有潜在的吸引力。一种实施方式包括^v离体的非放血或部分放血的哺乳动物胎盘收集脐血干细胞的方法。其它的实施方式可以包括用灌注溶液(例如，至少第一体积的灌注溶液)对哺乳动物的胎盘进行胎盘灌注以产生包含脐血干细胞的灌注液；收集包含脐血干细胞的灌注液；和从灌注液分离脐血干细胞以产生分离的脐血干细胞。灌注可以包括用一个或多个体积的灌注溶液(例如，1-3个体积的灌注溶液)进行灌注。在某些实施方式中，灌注包括用压力介导的灌注溶液的液流灌注非放血或部分放血的哺乳动物胎盘。在特定的实施方式中，压力介导的灌注溶液的液流包括灌注溶液的脉动流。在某些实施方式中，压力介导的灌注溶液的液流包括一个或多个正压介导的灌注溶液的液流或负压介导的灌注溶液的液流。在某些实施方式中，该方法包括例如通过搏动灌注用压力介导的灌注液的液流灌注非力文血或部分放血的哺乳动物胎盘，其中灌注是在足以产生基本上无脐血干细胞的哺乳动物胎盘的条件下进行的。在进一步的实施方式中，胎盘灌注是使用蠕动泵进行的。一般，该方法包括分离存在于离体胎盘的脐血中的干细胞。分离的干细胞可以包括胚胎干细胞(ES)样干细胞、造血干细胞、间充质干细胞或其组合。其它可以通过该方法获得的脐血细胞包括T-细胞、单核细胞、树突细胞和B细胞。在其它的实施方式中，该方法可以进一步包括在灌注前，从哺乳动物供体分离哺乳动物胎盘以获得离体的哺乳动物胎盘；和冷却离12体的哺乳动物胎盘以获得冷却的哺乳动物胎盘。在几种实施方式中，离体胎盘在取得后、灌注前在冰上冷却或保存。在某些实施方式中，冷却的离体胎盘在进行灌注之前保持在从大约XTC到大约6。C或者大约1"C到大约4。C范围的温度下，只要不使胎盘冻结即可。在其它实施方式中，胎盘在进行灌注之前保持在大约4。C到大约10。C之间的温度下4小时。在一种实施方式中，胎盘在进行灌注之前保持在4°C。在特定的实施方式中，离体的冷却胎盘在取得后、灌注前保持最多大约40小时的时间。在某些实施方式中，该方法不需要在灌注之前向胎盘中施用或注射抗凝血剂。在一种实施方式中，胎盘在灌注之前不施用或注射抗凝血剂。在某些实施方式中，灌注溶液包括生理相容溶液Belzer(非人类使用IMDM的RPMI)。在其它的实施方式中，灌注溶液包含抗凝血剂。在特定的实施方式中，灌注溶液包含选自肝素、肌酸磷酸葡萄糖(CPDA)或其中两种或多种的任意组合的抗凝血剂。在某些实施方式中，胎盘在进行胎盘灌注之前部分放血。一般，脐血可以使用如静脉穿刺(例如，通过针和注射器)或重力引流(例如，通过针和袋)的标准方法从胎盘排出。一般，干细胞可以从通过标准方法从胎盘排出的脐血中分离。在本发明的某些实施方式中，使用标准方法从放血胎盘分离的干细胞可以与使用本发明的灌注方法分离的干细胞合并。在某些实施方式中，合并的由两种方法获得的干细胞可以用于得到进一步的干细胞发生。在一种实施方式中，胎盘通过脐动脉和脐静脉灌注。在某些实施方式中，胎盘在分娩后最多大约40小时进行灌注，且取出的脐血包含活的干细胞。在特定的实施方式中，胎盘在分娩后大约6小时至大约40小时之间进行灌注，且取出的脐血包含活的干细胞。在某些实施方式中，粘附的胎盘的PMPP以大约15-60次搏动/分钟的脉沖设置进行。在特定的实施方式中，粘附的胎盘的PMPP以15-70mmHg范围的收缩压进行。在再进一步的实施方式中，粘附的胎盘的PMPP进行5分钟-90分钟的时间，在该时间内脐血从胎盘中移除。在某些实施方式中，粘附的胎盘的PMPP进行15分钟-35分钟的时间。在其它的实施方式中，粘附的胎盘的PMPP进行20分钟-30分钟的时间。在进一步的实施方式中，粘附的胎盘的PMPP进行选自至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟和至少60分钟的最少的时间量，其中对于所选择的最少的时间量，最长的灌注时间不超过90分钟。在特定的实施方式中，分离的原始造血干细胞表型包括CD34+/CD38-纟田胞、CD133+纟田胞、CD133+/CD34+细胞、CD133十/CD34-细胞、CD117+细胞、CD90+细胞、CD59+细胞、Thyl+细胞、Lin-细胞、CXCR4+细胞、ALDH*细胞、侧群(SP)细胞、SSEA-3+细胞、SSEA-4+细胞、TRA-1-60细胞、TRA画1画81细胞或其组合中的一种或多种。在进一步的实施方式中，分离的干细胞包括可以分化成CD34十/CD38-细胞、CD133+细胞、CD133十/CD34+细胞或CD133+ZCD34-细胞之外的细胞的原始造血千细胞表型。在一种实施方式中，收集脐血干细胞的方法描述为包括提供离体的非放血或部分放血的哺乳动物胎盘，该胎盘包含含有脐血干细胞的脐血；用压力介导的灌注溶液的液流灌注离体的非放血或部分放血的哺乳动物胎盘以获得灌注液，该灌注液包含含有脐血干细胞的脐血；收集灌注液；和从灌注液分离脐血干细胞以获得分离的脐血干细胞，或者该方法由上述步骤组成。分离的脐血干细胞可以进行冷藏。在另一实施方式中，收集脐血干细胞的方法描述为包括提供离体的非放血哺乳动物胎盘，该胎盘包含含有脐血干细胞的脐血；对离体的非放血哺乳动物胎盘进行部分放血以获得部分放血的胎盘和一定体积的含有脐血千细胞的脐血；用压力介导的灌注溶液的液流灌注部分放血的哺乳动物胎盘以获得灌注液，该灌注液包含含有脐血干细胞的脐血；收集灌注液；和从获得的所述体积的脐血和灌注液分离脐血干细胞以获得分离的脐血干细胞，或者该方法由上述步骤组成。分离的脐血干细胞可以进行冷藏。在一些实施方式中，PMPP灌注液加上用常规放血方法(如使用针和注射器)从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致从一个胎盘中获得的总单核细胞计数大约1.5倍的增加。如果在进行本发明的灌注方法之前胎盘不放血，得到相当的总细胞回收率是可能的。在一种实施方式中，PMPP灌注液加上用常身见放血方法(如使用针和注射器)从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获得的CD34+细胞百分数大约5.5倍的增加。如果在进行本发明的灌注方法之前胎盘不放血，得到相当的总细胞回收率是可能的。在另一实施方式中，PMPP灌注液加上用常规j放血方法(如使用针和注射器)从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获得的总CD34+细胞大约4.9倍的增加。如果在进行本发明的灌注方法之前胎盘不放血，得到相当的总细胞回收率是可能的。在再另一种实施方式中，PMPP灌注液加上用常^L放血方法(如使用针和注射器)从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获得的0034+038-细胞群百分数大约14.8倍的增加。如果在进行本发明的灌注方法之前胎盘不放血，得到相当的总细胞回收率是可能的。在再另一种实施方式中，PMPP灌注液加上用常失见放血方法(如使用针和注射器)从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致收集到大约11倍多的CD34+ZCD38-细胞。如果在进行本发明的灌注方法之前胎盘不放血，得到相当的总细胞回收率是可能的。在进一步的实施方式中，PMPP灌注液加上用常^见放血方法(如使用针和注射器)从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致获得CD133+细胞百分数大约5倍的富集。如果在进行本发明的灌注方法之前胎盘不放血，得到相当的总细胞回收率是可能的。在再另一种实施方式中，PMPP灌注液加上用常规放血方法(如使用针和注射器)从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致获得大约7倍高的CD133+细胞群。如果在进行本发明的灌注方法之前胎盘不放血，得到相当的总细胞回收率是可能的。在其它的实施方式中，脐血干细胞可以进行冷藏。在某些实施方式中，描述的主题包括处理需要造血重建的哺乳动物的方法，该方法包括(a)按照这里描述的方法分离源自胎盘脐血的造血干细胞，和(b)体外培养按照这里描述的方法分离的造血干细胞，从而产生后代千细胞。在特定的实施方式中，这些后代干细胞可以立即使用或为了将来使用而以例如用于递送到病人体内的单位进行储存(例如通过冷藏)。在进一步的实施方式中，该方法可以进一步包括(c)向哺乳动物体内引入包含治疗有效量的后代干细胞的组合物，从而实现造血重建。在某些实施方式中，哺乳动物选自人类或灵长类，例如，狒狒或其它灵长类。在其它的实施方式中，描述的主题包括处理需要造血重建的哺乳动物的方法，该方法包括(a)按照这里描述的方法分离源自胎盘脐血的造血干细胞，和(b)向哺乳动物体内引入包含治疗有效量的分离的造血干细胞的组合物，从而实现造血重建。在某些实施方式中，哺乳动物选自人类或灵长类，例如，狒狒或其它灵长类。在另外的实施方式中，处理需要造血重建的哺乳动物的方法可以进一步包括在分离的干细胞或它们的后代细胞引入需要的哺乳动物体内之前对它们进行冷藏。在进一步的实施方式中，引入到需要的哺乳动物体内的分离的干细胞或它们的后代细胞可以是与接受该细胞16的哺乳动物异源的、自体同源的或其组合。在特定的实施方式中，来自一个以上胎盘的分离干细胞可以合并到一起以用于处理需要的哺乳动物。在进一步的实施方式中，源自一个离体胎盘的分离干细胞的后代可以与源自一个或多个另外的离体胎盘的后代合并到一起以用于处理需要的哺乳动物。在某些实施方式中，处理需要造血重建的哺乳动物的方法涉及患有再生障碍性贫血、造血系统恶性肿瘤、自身免疫性疾病、遗传障碍、免疫缺陷、恶性实体瘤或其组合的哺乳动物。在特定的实施方式中，需要造血重建的哺乳动物患有选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓发育异常综合征的造血系统恶性肿瘤。在进一步的实施方式中，需要造血重建的哺乳动物具有由放射、化疗、病原微生物感染或其组合导致的免疫缺陷。在一实施方式中，描述的主题包括在需要的哺乳动物中再生受损组织的方法，包括(a)体外培养按照权利要求1的方法分离的脐血千细胞，从而产生分化的细胞和/或扩增的干细胞；和(b)向哺乳动物静脉内引入或向目标器官直接注入包含治疗有效量的分化细胞或扩增干细胞的组合物，从而实现组织再生。在进一步的实施方式中，描述了在需要的哺乳动物中再生受损组织的方法，包括向哺乳动物静脉内引入或向目标器官直接注入包含治疗有效量的按照权利要求1的方法分离的脐血干细胞的组合物，从而实现组织再生。在其它的实施方式中，描述了在需要的哺乳动物中再生受损组织的方法，其中所述组织包括心脏组织、肌肉组织、肝脏组织、皮肤、神经组织、骨组织、上皮、间质或内皮中的一种或多种。附图简要说明下面参照附图对本发明进行详细的说明，附图中图1.搏动机械胎盘灌注(PMPP)与单独静脉穿刺相比能使每个胎盘的总单核细胞计数(静脉穿刺部分加上PMPP部分)增加为1.5倍。图形表现了通过静脉穿刺方法(实心黑色部分)及随后的机17械胎盘灌注方法(条紋图案部分)荻得的8个源自胎盘的CB样品的分析结果。各棒下方的阿拉伯数字表示表1中显示的样品号(图1)。原始数据在表3中给出。图2.通过PMPP方法获得的CD34+细胞部分的百分数与静脉穿刺部分的百分数相比具有4.9倍的增加。图3.静脉穿刺部分和PMPP部分的CD34+细胞计凄t分别为7.4xl()6士5.9xl06(平均值±S.D.)(8个病人的范围1.1-18.2乂106)和28.8xl06士37xl()6(平均值土S.D.)(范围1.6-116><106),表明PMPP部分的总CD34+细胞具有3.9倍的增加。图4.静脉穿刺和PMPP部分中的CD34十/CD38-细胞的平均百分数分别为0.32±0.17%(平均值土S.D.)(范围0.04-0.66)和4.4土4.P/o(平均值土S.D.)(范围1.3-14),表明PMPP部分与静脉穿刺部分相比CD34十/CD38-细胞群百分数具有13-14倍的增加。图5.静脉穿刺和PMPP部分中的0034+^038-细胞的绝对数分别为1.7土1.5xl06(平均值士S.D.)(范围0.12-5.2)和17±22xl()6(平均值土S.D.)(范围0.86-65)(图5),表明PMPP部分包含10倍多的CD34+ZCD38-细胞。图6.静脉穿刺和PMPP部分中的CD133+细胞百分数分别为0.55±0.8%(平均值士S.D.)(范围0-2.5)和2.4±2.0%(平均值士S.D.)(范围0.5-6.8)，表明在PMPP部分中CD133+细胞百分数的4倍的富集。图7.静脉穿刺和PMPP部分中的CD133+细胞数分别为0.98±0.8x106(平均值±S.D.)(范围:0-2.3)和6.3±0.8><106(平均值±S.D.)(范围0.55-11.2)。PMPP部分中的CD133+细胞群以6.3倍高的水平显著富集。图8A和8B.静脉穿刺和PMPP部分中的CD34+ZCD38+细胞的平均百分数和绝对数分别为1.34±0,6%(平均值±S.D.)(范围0.26-2),6.1±5.1x106(平均值±S.D.)(范围1.0-16.2)和3.5±1.6%(平均值土S.D.)(范围0.82-6)，11.9±15x106(平均值±S.D.)(范围0.78-50),表明PMPP产生CD34+ZCD38+百分数和绝对数分别有2.6倍和1.95倍的增加。图9A和9B.静脉穿刺和搏动^L械胎盘灌注部分中的CD133+ZCD34-细胞的平均百分数和绝对数分别为0.37±0.7%(平均值土S.D.)(范围0-2)，0.36土0.7xl06(平均值土S.D.)(范围0-1.9)和1.16土1.5o/o(平均值土S.D.)(范围0-5)，2.4±3.3x106(平均值土S.D.)(范围0-9.9),表明PMPP部分具有3倍的CD133屮/CD34-富集和6倍多的CD133+ZCD34-细胞数。图10A和10B.静脉穿刺和搏动机械胎盘灌注部分中的CD133+ZCD34+细胞的平均百分数和绝对数分别为0.62±0.5%(平均值士S.D.)(范围0-0.6),0.68土0.6xl06(平均值士S,D.)(范围0-1.89)和1.26±0.8%(平均值土S,D.)(范围:0.35-2.9),4.0±5.6xl()6(平均值土S.D.)(范围0.35-16.5),表明PMPP部分具有2倍的CD133+ZCD34+细胞富集和CD133+ZCD34+绝对细胞数5.9倍的增力D。具体实施例方式在下面的详细说明中，本发明的方法可以以多种不同的变型形式进行，可以理解，在不脱离本发明的范围的情况下可以采用其它的实施方式和进行合理的变化。因此下面的详细说明并不是限制性的，且本发明的范围由所附的权利要求限定。虽然下面描述了多个不连续的实施方式，但可以理解，这些仅是非限制性的实施例，任一给定的本发明的实施方式可以包括一个给出的实施方式的某些特征和/或另一给出的实施方式的某些特征。收集脐血干细胞的方法描述为可以包括用灌注溶液灌注(例如，搏动灌注)离体的非放血或部分放血的哺乳动物胎盘以产生包含脐血干细胞的灌注液；收集包含脐血干细胞的灌注液；和从灌注液分离脐血干细胞以产生分离的脐血干细胞，或者该方法由以上步骤组成。另外，一种方法描述为其中灌注液(例如，由搏动灌注获得)加上用常规放血方法从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用4十和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致从一个胎盘获得的总单核细胞计数1.5倍的增加。进一步的方法描述为其中灌注液(例如，由搏动灌注获得)加上用常规放血方法从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获得的CD34+细胞百分数至少2倍的增加、>2倍的增加至10倍的增加、4倍的增加至6倍的增力口或5.54咅的增力口。一种方法描述为其中灌注液(例如，由搏动灌注获得)加上用常规放血方法从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获得的总CD34+细胞4.9倍的增加。并且，一种方法描述为其中灌注液(例如，由搏动灌注获得)加上用常规放血方法从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获得的CD34+ZCD38-细胞群百分数至少5倍的增加、〉5倍的增加至20倍的增加、12倍的增加至18倍的增加或14.8倍的增加。一种方法描述为其中灌注液(例如，由搏动灌注获得)加上用常规放血方法从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致收集到至少5倍多、5倍至20倍多、10倍至15倍多或11倍多的CD34+/CD384i^&。进一步的方法描述为其中灌注液(例如，由搏动灌注获得)加上用常规放血方法从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获得的CD133+细胞百分数至少2倍、2倍至10倍、4倍至8倍或5倍的富集。一种方法描述为其中灌注液(例如，由搏动灌注获得)加上用常规放血方法从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸^l的脐血相比导致获得至少3倍、3倍至15倍、5倍至19倍或7倍的CD133+细胞群。20I，定义下面的定义用于提供对说明书和权利要求的清晰和一致的理解，包括给出的这些术语的范围。灌注。术语"灌注(动词)"或"灌注(名词)"指的是诱导流体流横越或通过非放血或部分放血的胎盘的行为，优选流体以足够的力或压力通过非放血或部分放血的胎盘从而从器官或组织移除任何残留的细胞(例如，非粘附细胞)。这里所用的术语"灌注液"指的是在通过器官或组织后收集的流体。在优选的实施方式中，灌注液包含一种或多种抗凝血剂。灌注溶液的液流可以包括压力介导的灌注溶液的液流。压力介导的溶液的液流可以包括正或负压力介导的i容液的液流。压力介导的溶液的液流可以包括「溶液的脉动流。灌注可以包括以至少第一体积的灌注溶液灌注约10分钟至约1小时、约15分钟至约45分钟或约20分钟至约30分钟的时间灌注可以包括在开放或封闭的刚性或可变形容器中灌注非放血或部分放血的胎盘。容器可以包含一定体积的灌注溶液以使得非放血或部分放血的离体胎盘在灌注过程中浸没在容器中包含的灌注溶液中，从而所述体积的灌注溶液和容器中包含的灌注溶液在分离脐血干细胞之前合并在一起。浸没的离体胎盘和周围的灌注溶液可以处于大气压力下或者可以施加正和/或负压力。灌注可以包括使用脉动泵或蠕动泵以例如，大约15次搏动/分钟至大约90次搏动/分钟和大约15mmHg至大约90mmHg的收缩压、或者大约60次搏动/分钟和大约30mmHg至大约70mmHg的收缩压使非放血或部分放血的胎盘承受灌注溶液的脉动流。用于推动或拉动灌注溶液通过哺乳动物胎盘的压力源足以由加压系统(例如，蠕动或脉动泵或装置)产生溶液的液流。蠕动泵送系统的使用有助于在被诱导流过胎盘的溶液中保持无菌状态。对实际的压力水平或泵送速率进行调整以使脐血从部分放血或非放血的胎盘的移除最优化。灌注溶液。术语"灌注溶液"意指包含足以维持脐血细胞(包含21千细胞)的生存力的抗凝血剂的任何生理相容的溶液或介质。合适的灌注溶液可以包括RPMI(RoswdlParkMemorialInstitute)培养基，任选包含葡糖酸盐和/或肝素，例如对于1升的总体积包含1000U的肝素；和BelzerMPS，任选包含肝素，例如对于600-750ml的总体积包含2000U的肝素，或者合适的灌注溶液可以由上述物质组成。其它的合适的灌注溶液是本领域普通技术人员已知的且可以很容易地选择和使用。灌注可以包括用至少第一体积的灌注溶液灌注。灌注可以在约4。C-约27。C的温度下(例如，在室温下)进行。第一体积。术语"第一体积"意指用于灌注非放血或部分放血的离体哺乳动物胎盘的灌注溶液的体积。灌注溶液的第一体积可以包括约250ml灌注溶液至约2升、约400ml至约1.5升、约500ml至约1.2升、约600ml至约1升和约600ml至约750ml灌注溶液，或者灌注溶液的第一体积可以由以上体积的灌注溶液组成。压力介导的液流。术语"压力介导的液流"意指由正或负压力诱导的灌注溶液的液流。负压力。术语"负压力"意指低于大气压力的压力，即低于一个大气压的压力。正压力。术语"正压力"意指处于或高于一个大气压的压力，即大于或等于一个大气压的压力。放血的胎盘。术语"放血的胎盘，，意指所有循环血已被移除或抽取(即，使变得无血)的离体胎盘。非放血的。术语"非放血的胎盘"意指未移除或抽取循环血的离体胎盘。部分放血的。术语"部分放血的胎盘"意指一部分循环血已被移除或抽取的离体胎盘。干细胞。这里所用的术语"干细胞，，指的是可以无限复制以形成组织和器官的特化细胞(specializedcell)的种细胞(mastercell)。干细胞是发育上多能的(pluripotent)或多能性(multipotent)细胞。干细胞可以分裂产生两个子千细胞，或者一个子干细胞和一个祖("过渡")细胞，然后祖细胞增殖成为组织的成熟的、完全成形的细胞。这里所用的"干细胞"，除非另外说明，包括"祖细胞"。造血干细胞是稀少的原始血细胞祖先，其具有自身复制能力，从而维持连续的再生细胞源和进行分化，以产生各种形态学上可识另'J的血细胞系的前体。这些前体是不成熟的血细胞，其不能自身复制且必定分化成成熟的血细胞，包括红细月包系纟田胞、淋巴样细胞和髓样细胞。在骨髓微环境中，干细胞自我增殖并在一生中活跃地保持持续产生所有成熟血细胞系。CD34+细胞确定为可在骨髓、外周血或新生儿脐带血中识别的最早的造血干细胞。本发明的补充剂和培养基特别适合于支持CD34+细胞和骨髓系细胞的扩增，包括BFU-E细胞、红细胞、CFU-MEG细胞、巨核细胞、CFU-GM细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞。在发育的较早阶段，骨髓系细胞表达CD34+标志物蛋白。在发育的较晚阶段，骨髓系细胞不表达可检测水平的CD34+标志物蛋白。脐血干细胞是否表达CD34+标志物蛋白可以由本领域普通技术人员使用公知的技术(如荧光活化细胞分选)进行确定。"CD34+造血细胞"或"CD34+细胞，，是表达CD34+表面标志物蛋白的造血细胞。这些细胞包括，但不限于造血干细胞、骨髓祖细胞或前体细胞、红系祖细胞或前体细胞和淋巴样祖细胞或前体细胞。CD34+细胞可以使用本领域普通技术人员公知的方法从收集的脐血和/或灌注液中分离以产生分离的脐血干细胞。本领域普通技术人员可以获得各种系统。例如，MicroCELLectorSystemRTM(AppliedImmuneSciences)、MiniMacsSystem(MiltenviBiotec)、StemSepsystem(StemCellTechnologies)可以用于分离CD34+。为大规模制备富含CD34+细胞的细胞制剂，本领域普通技术人员可以获得由BaxterHealthcare和CellPro在市场上销售的系统。术语"造血干细胞"和"多能造血干细胞"指的是可以产生任何类型的造血祖细胞或前体细胞(包括骨髓祖细胞或前体细胞、红系祖23细胞或前体细胞和淋巴样祖细胞或前体细胞)的细胞。造血干细胞显示〔034+/0033-/€038-表型或CD34+/HLD-DR-ZCD38-表型(Daley,J.P.等，Focus18:62-67(1996);Pimentel,E.编辑，HandbookofGrowthFactorsVol.Ill:HematopoieticGrowthFactorsandCytokines,pp.1-2,CRCPress,BocaRaton,Fla.,1994)。/.迷/&戈不^/f#龙CS4袭W炎桌應iCS细應^才法采用广泛用于肾维持的WatersRM3搏动灌注装置(WatersMedicalSystems,Rochester,MN)利用搏动灌注技术进行CB采集的方法的概念验证小型试验获得了成功。所述装置最初设计用于提高在移植之前进行储存的肾的即时功能(immediatefunction)。灌注溶液由具有葡糖酸盐和对于1升的总体积具有1000U肝素的RPMI(RoswellParkMemorialInstitute)培养基或者BelzerMPS加上1000-2000U肝素(具有2000U肝素钠的600-750mlBelzerMPS)组成。目前，已利用狒狒胎盘证明了该方法的可行性及成功地灌注和移除全部的残留胎盘CB。当常规静脉穿刺加上机械灌注时，与单独的静脉穿刺方法相比，收集的绝对总单核细胞计数、集落形成细胞(CFC)计数、CD34+和CD34+ZCD38-百分数及计数为大约2倍高。在通过搏动机械灌注进行的有利的狒狒CB收集的基础上，该方法在人类胎盘上进行测试。按照马里兰大学伦理审查委员会(InstitutionalReviewBoard)批准的临床方案，对来自7个正常阴道分娩和一个剖腹产的36-41周胎盘进行8例CB收集。首先在脐带被夹住和婴儿生出而胎盘仍在子宫中时，就利用针/注射器通过静脉穿刺进行部分CB收集以吸取最大可能的量。这一方法用于经阴道生产和剖腹产两种情况以使CB收集的收率最大化，且它是广泛用于常规CB收集的几种方法中的一种。将18号针头装到30或60ml的注射器上且吸取的CB材料立即转移到包含5000U肝素溶液的50ml锥形管中。收集的CB立即与肝素混合以防止凝结，并储存在冰拒中。通过这一过程收集的平均CB体积为59±18ml(平均值±S.D.)(范围40-90ml)。接着，胎盘例行地娩出并直接置于无菌隔离袋(3MHealthCareSt.Paul，MN)中。如果胎盘需要表观检验，则将胎盘置于无菌托盘上并在完成检查时转移到无菌隔离袋中。胎盘也在无菌袋中称重。无菌袋紧密封闭并置于三重袋隔离(triplebagisolation)中，并且不进行任何操作而保持在冰拒中直到开始胎盘灌注。胎盘在分娩后6.25-39小时之间进行灌注。胎盘可以在离体后在约-3。C至约15°C、约-8。C至约10。C、约-2。C至约6。C或约0。C至约6。C的温度下冷却，只要不使得胎盘被冻结即可。冷却的胎盘可以在灌注之前在发生冻结之上的温度下(例如，从约xrc至约i5°c、约xrc至约ior或约2。c至约6。c)维持约30分钟至约60小时、约1小时至约50小时、约6小时至约40小时、约10小时至约40小时、约15小时至约40小时或约20小时至约40小时的时间。为进行搏动机械胎盘灌注(PMPP)，将胎盘置于无菌场上并进行检查以确定胎盘中是否存在任何破口或裂缝。然后，检查脐带以寻找2条脐动脉和1条脐静脉。两条脐动脉中的一条或多条和脐静脉被插管以利于灌注。首先，将6mm的直管插入脐静脉中并用o-形丝带绑扎定位，然后，两条动脉各插入2mm直管并用o-形丝带绑扎定位。将胎盘置于灌注回路(WatersRM3肾灌注泵)上，其在rC至27。C的温度下用BelzerMPS加上1000-2000U肝素(具有2000U肝素钠的600-750mlBelzerMPS)进行起动前灌注。BelzerMPS是FDA批准的用于维持死者捐献的移植器官的器官灌注液(Gage等，1997)。搏动机械灌注以60次搏动/分钟进行且收缩压在30-70mmHg之间。完成灌注的平均时间为26分钟(范围20-30分钟)。为确定胎盘灌注的完成，我们将胎盘组织颜色从暗蓝色变成纯白色作为胎盘中的血管内容物全部排空的标志。八个CB样品使用静脉穿刺和机械胎盘灌注方法从相同的对象进行收集，且其定量描述总结于表1中。通过静脉穿刺收集的平均CB体积如上所述。由搏动机械胎盘灌注方法获得的平均CB体积不能进行测量，因为灌注液和CB最后混在一起。采集的胎盘的平均孕期为38.6周(范围36-41周)且平均胎盘直径和厚度大小为20xlcm(17-22xlcm)。胎盘从一例剖腹产(样品l)和7例阴道分娩(样品2-8)获得。从胎盘分娩到开始灌注的平均时间为17小时(平均值)(6.25-39小时)，且胎盘灌注的持续时间小于每胎盘30分钟(平均26分钟，范围20-30分钟)(表1)。在3个胎盘(样品3、5和6)中发现存在血栓形成，且其占总胎盘面积的大约5%、10%和7%,而在其它对象中未见到血栓形成。这些胎盘在4。C温度的热绝缘拒中包裹于水中19-39小时直到灌注开始。总的说来，对于每一个测试的胎盘(包括具有血栓形成的胎盘)进行机械灌注都没有困难，且没有观察到由于搏动机械灌注导致的气压性损伤。表1.从8个胎盘收集的脐血的特征样孕期胎盘尺寸灌注前灌注注射器得分娩胎盘中口口(周)(直径x时间时间到的CB方法厚度cm)(hr)(hr)体积(ml)凝结(％)13918x19.50.550剖腹023919x170.580阴道033922x1270.4265阴道544021x1150.3762阴道03618x1390.3340阴道1064025x1190.4290阴道773617x16.250.3346阴道084021x112.50.640阴道02力仅襄溶濕力,魂,i^襄才法^^較为VvfCB单核细胞分离由胎盘脉管系统的静脉穿刺获得的CB细胞首先用Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)进行1:5的稀释，且单核细胞通过以前4苗述(Takebe等，2002)的Ficoll-Hypaque(SigmaDiagnostic,St26Louis，MO)密度梯度离心进行分离。包含单核细胞的层被轻轻地吸出，细胞用PBS溶液清洗两次并通过血细胞计数器计it。细胞存活率通过台盼蓝排除法确定。通过PMPP获得的CB细胞与由静脉穿刺获得的细胞类似地进行处理。但是，这些细胞混在大量的灌注液中(650-800ml总体积)。这一灌注液等分到大约几打(severaldozen)50ml锥形管中，该锥形管一起以1800rpm离心20分钟以获得血沉棕黄层。然后，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心从细胞中进一步分离单核细胞。CB细胞如上所述进行清洗和计数。流式细胞4义分析单核细胞用包括抗人CD38-FITC、CD34-APC(BDPharmingen,SanJose,CA)、AC133-PE(MiltenyiBiotech,Auburn,CA)的单克隆抗体染色并按照制造商的说明用Facstar-plus(BectonDickinson)进行分析。对于各样品采用合适的抗体平行地进行同型对照。CD34+细胞选择由Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得的等分CB单核细胞按照制造商的说明用CD34祖细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)通过磁性细胞分离方法进一步分离以富集CD34+细胞群。纯化细胞数和存活率通过血细胞计数器和台盼蓝排除试验确定。CD34+细胞的富集通过流式细胞分析确定，且各批次的分离显示了高于90%的CD34+细胞纯度和通过台盼蓝排除法确定的高于95%的存活率。曱基纤维素集落形成单位分析纯化的CBCD34+细胞(3x103每板)如以前描述的方法(Takebe等，2002)接种到35-mm培养皿中。细胞按照制造商的说27明在包括lmlIMDM、1%甲基纤维素、BSA、2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、SCF、GM-CSF、IL-3、IL-6、G-CSF和红细胞生成素的商购培养基MethoCult(StemCellTechnology,Vancouver,Canada)中进行培养。在第14天，集落(大于50个细胞)由重复的培养皿进行计数。表2.由静脉穿刺方法和机械胎盘灌注方法获得的包含配对样品的3个CB样品的集落形成单位的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>CFU-GM:集落形成单位-粒细胞巨噬细胞CFU-GEMM:集落形成单位-粒细胞，红细胞，单核细胞BFU-E:爆发集落形成单位-红系a和b:配对T-检验显示在静脉穿刺和机械胎盘灌注之间有统计学显著差异(pO，05)*VP:静脉穿刺方法**PL:PMPP方法<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表4.通过静脉穿刺或PMPP方法收集的CB干细胞的表型特征<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>参考文献下面的参考文献通过引用全文引入。ALMEIDA-PORADA,G.，PORADA,C.D.,CHAMBERLAIN,J.，TORABI,A.和ZANJANI,E.D.(2004).Formationofhumanhepatocytesbyhumanhematopoieticstemcellsinsheep.Blood104，2582-2590.AZIZI,S.A.,STOKES,D.,AUGEIXI,B丄，DIGIROLAMO，C.和PROCKOP,D丄(1998).Engmftmentandmigrationofhumanbonemarrowstromalcellsimplantedinthebrainsofalbinorats—similaritiestoastrocytegrafts.ProcNatlAcadSciUSA95，3908-3913.BARKER,J.N.,KREPSKI,T.P.,DEFOR,T.E.,DAVIES,S.M.，WAGNER，J.E.和WEISDORF，D丄(2002).Searchingforunrelateddonorhematopoieticstemcells:availabilityandspeedofumbilicalcordbloodversusbonemarrow.BiolBloodMarrowTransplant8,257-260.BELVEDERE,O.,FERUGLIO，C.,MALANGONE，W.,BONORA,M丄.，MINISINI，A.M.,SPIZZO，R.，DONINI,A.，SALA,P.，DEANNA,D.，HILBERT,D.M.和DEGRASSI,A.(2000).IncreasedbloodvolumeandCD34(+)CD38(-)progenitorcellrecoveryusinganovelumbilicalcordbloodcollectionsystem.StemCells18，245-251.BERTOLINI，F.，LAZZARI,L,LAURI，E.,CORS腿，C.,CASTELLI,C.，GORINI,F.和SIRCHIA,G.(1995).Comparativestudyofdifferentproceduresforthecollectionandbankingofumbilicalcordblood.JHematother4，29-36.BHATTACHARYA,S.,JACKSON,J.D.,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