一种马脐血间充质干细胞的培养基及其分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生命科学领域，具体涉及一种马脐血间充质干细胞的培养基及其分离 培养方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞定义：间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC)是干细胞家 族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向 分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关 注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、 韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜 能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。目前的研宄表明， MSC细胞表面抗原为⑶73、⑶90、⑶105阳性，⑶34、⑶45阴性。
[0003] 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节 免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关 技术的日益成熟，临床研宄已经在许多国家开展。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机 体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫 排斥和自身免疫性疾病。
[0004] 目前，我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐 带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的 间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度 衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有 骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干 细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。
[0005] 目前在胎盘、脐带、脐血等组织中已成功分离出间充质干细胞，这种组织来源的间 充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①胎盘和脐带 中的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会 触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩 增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。⑥ 潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害 及损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘和脐带来源的间充质干细 胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。
[0006] 迄今的研宄表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理 想替代物，而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子 标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于 工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。目前赛马项目十分 盛行，而一匹赛马的价格惊人，而马又时常在赛马活动中受伤，厂家受伤部位为骨关节、肌 肉等。这种情况下，用马脐带间充质干细胞移植就可能治愈赛马的疾患，挽救赛马的运动生 涯。
[0007]目前人脐血MSC的分离、培养方法主要为用淋巴细胞分离液Ficoll从脐血中分离 出单个核细胞，之后再用干细胞专用培养基培养，所获得贴壁细胞即为MSC。但该方法所得 MSC增殖缓慢，数量较少。目前尚无从马脐血分离培养MSC的相关专利报道。此外由于脐 血中MSC数量稀少，根据文献报道，脐血中的MSC含量为每10 6单个核细胞含有0. 5~1个 MSC，仅为骨髓的1/10。现有的方法所得MSC增殖缓慢，数量较少，且培养成功率低，并不是 所有的脐血均能用该方法分离培养获得MSC。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是从马脐血中分离出MSC，并改良脐血MSC的培养条件，进行体外大 规模扩增培养，为应用马脐血MSC治疗马疾患创造条件。
[0009] 本发明目的通过以下技术方案来实现：
[0010] 一种马脐血间充质干细胞的培养基，在MDM培养基中添加马血清、粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM_CSF)和人 干细胞生长因子（stem cell factor，SCF)，其中马血清的体积百分数为1~50% ;GM-CSF 的质量浓度为1~l〇〇ng/ml ;SCF的质量浓度为1~100ng/ml，余量为MDM培养基。
[0011] 优选，所述马血清的体积百分数为10% ;GM-CSF的质量浓度为10ng/ml ;SCF的质 量浓度为l〇ng/ml，余量为MDM培养基。
[0012] 所述頂DM培养基为Gibco,货号：31980030。
[0013] 本发明还提供了所述的马脐血间充质干细胞的培养基在细胞培养中的应用。
[0014] 具体可以应用在马脐血间充质干细胞的分离培养方法中，包括以下步骤：
[0015] (1)单个核细胞的分离：将添加抗凝剂的脐血用生理盐水或细胞培养基稀释后， 采用密度梯度离心法得到单个核细胞；
[0016] (2)MSC的培养：将单个核细胞用所述的马脐血间充质干细胞的培养基进行培养。
[0017] 优选，所述抗凝剂为枸橼酸钠。
[0018] 优选，所述细胞培养基为RPMI1640培养基；所述稀释比例为1:1~1:5。
[0019] 优选，所述密度梯度离心法是采用Ficoll淋巴细胞分离液，100g~1000g离心 10~50min，吸取单个核细胞层，再用RPMI1640培养基重悬细胞，100g~1000g离心1~ 20min〇
[0020] 优选，将单个核细胞用马脐血间充质干细胞的培养基进行培养是将单个核细胞用 所述的马脐血间充质干细胞的培养基重悬后，以1~10X10 5/ml的细胞密度接种于马脐血 间充质干细胞的培养基中，在37°C、5% C02条件下培养。
[0021] 优选，所述培养到达第6天时，去除旧培养基，添加所述的马脐血间充质干细胞的 培养基，此后，每三天更换培养基一次。
[0022] 本发明相对于现有技术所具有的优点和有益效果：
[0023] 1.从马脐血中分离、培养MSC，目前尚无相关专利报道。
[0024] 2.培养脐血MSC时，添加GM-CSF、SCF，可有效提高脐血MSC的扩增效率。现有的 扩增培养脐血MSC方法未添加GM-CSF、SCF。
[0025] 3.本发明采