源于人单性生殖胚泡的患者特异性干细胞系的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年04月07日，申请号为 200880018767. X(PCT/US2008/004529)，发明名称为"源于人单性生殖胚泡的患者特异性干 细胞系"。
技术领域
[0002] 本发明一般性地涉及胚胎干细胞，以及更具体地涉及获得HLA纯合单性生殖人干 细胞系进行基于细胞的治疗的方法。
【背景技术】
[0003] 最初的人胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC)源于获自受精卵母细胞的胚 泡内细胞团（inner cell mass，ICM)，其能够无限分裂并分化成所有组织类型的细胞。胚 胎干细胞是多能细胞的潜在的无限来源，所述多能细胞用于基于移植的细胞治疗。
[0004] 人胚胎干细胞（ES)细胞是多能细胞，其可分化成大量细胞类型。当注射到免 疫缺陷鼠中时，胚胎干细胞形成分化的肿瘤（畸胎瘤）。但是，被体外诱导以形成胚状体 (embryoid bodies, EBs)的胚胎干细胞提供了胚胎干细胞系的来源,其在某些生长条件下 被控制分化成表征几种组织的多种细胞类型。例如，在神经生长因子和视黄酸存在的情况 下，ES细胞分化成神经元。
[0005] 如果免疫排斥的问题可以解决，则人胚胎干细胞具有给予患者显著治疗益处的潜 能。与受体（recipient)遗传相关的胚胎干细胞可克服这些排斥问题。目前，人胚胎干细 胞（human embryonic stem cells，hES)源于三种来源：不育治疗后剩余的并捐赠用于研究 的胚泡，从捐赠的配子（卵母细胞和精子）产生的胚泡，以及核移植（nuclear transfer, NT)的产物。死胎组织是人胚胎生殖细胞（human embryonic germ cells, hEG)的唯一来 源。hES和hEG细胞提供显著的科学和治疗可能性，其涉及产生更专一化的细胞或组织的潜 能。但是，有关hES和hEG细胞的来源的伦理关注，以及用NT进行研究会导致用NT产生人 类的担心，已引发了大量的公众讨论和辩论。
[0006] 哺乳动物卵母细胞的单性生殖活化（parthenogeneic activation)可作为对通过 精子受精/NT的替代而应用，以便制备用于胚胎干细胞产生的卵母细胞。单性生殖活化是 在缺乏来自雄性配子的任何贡献的情况下，从雌性配子产生胚胎细胞，其最终发育为成体 或不最终发育为成体。
[0007] 与SCNT相比，卵母细胞的单性生殖活化是产生组织相容性干细胞的相对简单的 方法，原因在于它不需要显微操作卵母细胞所需的复杂设备。单性生殖干细胞从未受精的 卵母细胞产生并且含有卵母细胞供体（潜在患者）专有的遗传物质。进一步，在定向细胞 分化后，自体细胞可被移植而没有免疫排斥的威胁。单性生殖小鼠MHC-纯合干细胞系和一 种单性生殖灵长类动物杂合胚胎干细胞系（Cyno-1)已被得到并且在这些细胞系中已表明 细胞多能性。
[0008] 如上所述，同种异体组织和器官移植造成的最大风险是免疫排斥。风险的程度与 供体和受体细胞表面抗原递呈蛋白之间的差异程度成比例。在理想的移植中，在主要组织 相容性复合物（MHC)方面，供体组织与受体是组织相容的。人白细胞抗原（HLA)系统是命 名人MHC的术语，并且代表对移植重要的抗原。HLA抗原匹配的供体和受体组织降低在受体 中细胞毒性T-细胞应答的机会，以及因此大大增加移植物存活的可能性。
[0009] MHC I类和II类HLA单元型是共同遗传自亲本的特定组的HLA-A、-B、-DR基因座 等位基因。尽管存在高度HLA多态性，但是在美国高加索人群中仅存在200个共有HLA单元 型。这种HLA多样性与杂合选择系数组合，意味着发现供体-受体匹配的机率范围是一千 分之一至几百万分之一，其原因在于在杂合个体中由这些等位基因变体的组合提供的独特 的组织类型。
[0010] 基于移植的干细胞治疗面临相同的HLA匹配问题，所述问题由于免疫排斥而限制 了实体器官同种异体移植。HLA-匹配干细胞系可克服免疫排斥的风险。对于单性生殖来源 的细胞，HLA杂合细胞系通过使用A23187和6-DMAP的组合激活卵母细胞而得自HLA杂合 供体。由于这些细胞与卵母细胞供体是HLA-匹配的，它们提供组织-匹配衍生物的能力受 到限制。
[0011] 如果供体细胞是HLA纯合的，即，含有相同的每种抗原递呈蛋白的等位基因，则供 体和受体之间的MHC相容性显著增加。而且，如果纯合供体细胞具有在群体中被高频率发 现的单元型，则这些细胞在大量个体的基于移植的干细胞治疗中可具有用途。
【发明内容】
[0012] 本发明公开从HLA纯合和HLA杂合供体产生HLA纯合单性生殖人干细胞 (hpSC-Hhom)系的方法。这些hpSC-Hhom系显示人胚胎干细胞形态学，表达典型的干细胞标 记物（即，35￡六-3、55￡六-4、了狀-1-60、了狀-1-81以及0(：1'-4)并具有高水平的碱性磷酸酶和 端粒酶活性。另外，将这些细胞系注射到免疫缺陷动物中导致畸胎瘤形成。SNP数据分析表 明，源于HLA杂合卵母细胞供体的hpSC-Hhom系的整个基因组是纯合的。所公开的方案将 源自动物组分的应用减到最少，其使这些干细胞理想地适合于临床用途。
[0013] 在一个实施方式中，公开了源于单性生殖胚泡的分离的人干细胞系，其中构成该 细胞系的至少一个细胞对于一个或更多个单核苷酸多态性（SNPs)而言是杂合的，对于一 个或更多个HLA等位基因而言是纯合的，或包括纯合和杂合SNPs的组合。
[0014] -方面，至少一个细胞对于HLA等位基因而言是纯合的。另一方面，至少一个细胞 在被移植到无免疫应答小鼠中时形成畸胎瘤。在进一步的方面，至少一个细胞与胚泡供体 是MHC相容的。
[0015] 在一个相关方面，至少一个细胞与胚泡供体的一级血亲是MHC相容的，其包括至 少一个细胞按照供体来源被实质上遗传印记。
[0016] 一方面，至少一个细胞（i)将在体外培养中增殖一年以上，（ii)在整个培养中保 持分化为内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，以及（iii)当在成纤维细胞饲养层 上培养时被抑制分化。
[0017] 另一方面，至少一个细胞分化成下列细胞，包括：神经元细胞、心脏细胞、平滑肌细 胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、以及少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细胞、基质细胞、 软骨细胞、星形胶质细胞、角化细胞、胰岛细胞、淋巴前体细胞、肥大细胞、中胚层细胞以及 内胚层细胞。在一个相关方面，至少一个细胞不具有形成存活生物体的能力。
[0018] 在另一个实施方式中，公开了治疗需要该治疗的对象的方法，其包括施用包括分 化细胞的细胞组合物，其中所述分化的细胞得自源于单性生殖胚泡的干细胞系，其中构成 所述细胞系的至少一个细胞对于一个或更多个单核苷酸多态性（SNPs)而言是杂合的，对 于一个或更多个HLA等位基因而言是纯合的，或包括纯合和杂合SNPs的组合。
[0019] 一方面，对象患有疾病，所述疾病包括：帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏 症、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化症、肌肉萎缩症、囊性纤维化、肝病、糖尿病、心脏病、 黄斑变性、软骨缺陷或损伤、烧伤、足部溃疡、血管疾病、尿路疾病、AIDS以及癌症。
[0020] 在一个实施方式中，公开了干细胞库，其包括自体或同种异体（allogenic)干细 胞，其中所述干细胞源于来自一个或更多个人供体的单性生殖活化的卵母细胞，以及其中 所述干细胞是HLA纯合干细胞。一方面，根据单核苷酸多态性（SNP)标记物，每个库成员被 鉴定为全同胞、半同胞或不相关。另一方面，每个库成员根据HLA-型进行表征，并且所述库 成员与用于治疗用途的潜在受体是HLA-匹配的。
[0021] 另一方面，卵母细胞供体与库成员是组织相容的。在一个相关方面，库成员根据 卵母细胞供体来源被基因组印记，其包括库的干细胞可源于HLA杂合卵母细胞供体。在进 一步的方面，库中的每个成员对于不同于其它库成员的MHC/HLA等位基因组合而言是纯合 的。
[0022] -方面，库中的每个成员是至少一个或更多个HLA I类基因和HLA II类基因纯合 的。在一个相关方面，HLA I类基因包括HLA A*、HLA B*、HLA以及Cw*单元型组合。在另 一个相关方面，HLA II 类基因包括 HLA DRB1*、DRB3*、DRB4*、DRB5*、DQA1* 以及 DQB1* 单 元型组合。
[0023] 在另一个实施方式中，公开了产生HLA纯合干细胞的方法，其包括：筛选卵母细胞 供体，寻找在给定群体中常见的HLA-单元型；在体外受精（IVF)培养基中温育人中期II卵 母细胞；在包括离子载体的IVF培养基中温育细胞；在包括嘌呤霉素的IVF培养基中温育 细胞；以及在新鲜的IVF培养基中温育细胞，其中一个或更多个温育在不同0 2张力下进行， 并且其中获自细胞的内细胞团（ICM)产生可培养的干细胞。
[0024] 根据本发明的示例性方法和组合物在下文更详细地描述。
【附图说明】
[0025] 图1显示phESC系的特征性特异性标记物。在人饲养层细胞上phESC的未分化集 落（A-F)，SSEA-1阴性染色（G-L)，细胞表面标记物SSEA-3(M-R)、SSEA-4(S-X)的表达。放 大倍数：(A)至（E) 100倍，（F) 200倍，（G)至（X) 400倍。在饲养细胞上phESC集落的碱性 磷酸酶阳性染色（A-F)、OCT-4 (G-L)、TRA-1-60 (K-R)和 TRA-1-81 (S-X)。放大倍数：(A、B、 0、R) 100 倍，（C-F、M、S、X) 200 倍，（G-L、N、P、Q、T-W) 400 倍。
[0026] 图2显示，phESC表明与阳性对照细胞相比高水平的端粒酶活性来自500个 细胞的提取物；热处理的细胞提取物，端粒酶失活；"对照+"_端粒酶阳性细胞提取物 (应用TRAPEZE试剂盒）；"B" -CHAPS裂解缓冲液，引物-二聚体/PCR污染对照；TSR8-端 粒酶定量对照模板（〇.1和〇.2amole/ ill) ;"M"-标记，DNA梯形条带。
[0027] 图 3 显示 phESC 系的 G-带核型分析。phESC-1 (A)、phESC-3(B)、phESC-4 (C)、 phESC-5 (D)和 phESC-6 (E)系具有正常的 46, XX 核型。phESC-7 系具有 47, XXX 核型（F)。
[0028] 图4显示将phESC体外分化为所有三个胚层的衍生物。外胚层分化通过神经元特 异性标记物神经丝68 (A)、NCAM(B)、0 III微管蛋白（C)和神经胶质细胞标记物GFAP (D，M) 的阳性免疫细胞化学染色来显示。分化的细胞对于下列中胚层标记物是阳性的：肌肉特异 性a-辅肌动蛋白（G)和结蛋白（J)、内皮标记物PECAM-l(E)和VE-钙粘蛋白（F)。内胚 层分化通过a-胎蛋白（H，L)阳性染色来显示。phESC产生色素上皮-样细胞（I，K)。放 大倍数：（I) 100 倍，（A-H，J-M) 400 倍。
[0029] 图5显示在SCID小鼠中phESC的体内分化和畸胎瘤形成。对三个胚层的标记物 进行免疫荧光染色。中胚层细胞标记物肌肉肌动蛋白围绕其它成分进行组织并且可清晰鉴 别（A)。纤维连接蛋白以较高量存在对于中胚层来源的结缔组织具有特异性（B)。神经分 化细胞（外胚层来源）区域是广泛的并用0微管蛋白抗体进行强烈标记（C)。不成熟的 内胚层细胞标记物a-胎蛋白可在腺体外观的区域找到（D)。用DAPI对细胞核染色-(A)、 〇))。放大倍数：(A)、（C)、⑶，100 倍；(B) 200 倍。
[0030] 图6显示印记基因表达的RT-PCR分析。来自丢弃IVF胚胎的两个hESC系hESl和 hES2用作在下列phESC系中父本表达的基因SNRPN和PEG1_2以及母本表达的基因TSSC5和 H19 的表达分析的阳性对照：phESC-1 ;phESC-3 ;phESC-4 ;phESC-5 ;phESC-6 和 phESC-7(分 别为1、3、4、5、6以及7)。PEG1_1基因是双等位基因表达的并用作另外的对照。包括GAPDH 作为mRNA定量对照。RT-数据表明RT样本没有基因组污染。
[0031] 图7显示hpSC-Hhom系的特异性标记物特征。来自所有四种hpSC-Hhom系的细胞 表明SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、0CT-4(用DAPI进行细胞核染色）、碱性磷酸酶 阳性染色，以及SSEA-1阴性染色。小鼠胚胎干细胞（ESC)用作SSAE-1染色的阳性对照。
[0032] 图8显示，hpSC-Hhom系表明与阳性对照细胞相比高水平的端粒酶活性： "K1+"-端粒酶阳性细胞提取物（应用TRAPEZE试剂盒）；"K2+"_来自500个细胞的提取 物；"K-"或热处理的细胞提取物，端粒酶失活；Buf-CHAPS裂解缓冲液，引物-二聚体 /PCR污染对照；TSR-端粒酶定量对照模板（0.1和0.2amole/ ill) ;"M"_标记物，DNA梯形 条带。
[0033] 图9显示人HLA纯合单性生殖干细胞系的G-带核型分析：hpSC-Hhom-1 (A)和 hpSC-Hhom-4(B)系具有正常的 46，XX 核型；hpSC-Hhom-2(C)系的 15%细胞具有 47，XX，+8 核型-染色体8的非整倍性；1^5(：-扭1〇111-3(0)系的4.2%细胞具有47，乂乂，+1核型-染色 体1的非整倍性。
[0034] 图10显示hpSC-Hhom-4体外分化成来自所有三个胚层的衍生物：外胚层分化是明 显的，因为神经元特异性标记物神经丝68(A)和NCAM(B)是免疫细胞化学染色阳性的；内胚 层分化是明显的，因为a-胎蛋白（C)的染色是阳性的；分化的细胞是中胚层标记物肌肉特 异性结蛋白⑶和a -辅肌动蛋白（E)阳性的；放大倍数200倍（A-E)。
[0035] 图11显示hpSC-Hhom-4的体内分化。SCID小鼠中的畸胎瘤形成。来自所有三个 胚层（外胚层、内胚层和中胚层）的衍生物：由间充质细胞包绕的充分形成的呼吸型腺体， 苏木精/伊红（h/e)染色，放大倍数140倍（A);可能的具有单层细胞的神经管，右侧为内 胚层腺体和底部为软骨-分化，h/e染色，放大倍数70倍（B);由间充质细胞包绕的骨骼，中 心是具有立方上皮的管状腺，picrofucsin染色，放大倍数140倍（C);充分形成的由间充质 细胞包绕的骨骼和脂肪组织，h/e染色，放大倍数140倍（D);左侧是内胚层腺体、中胚层和 脂肪组织、胶原，骨骼见于右侧和底部，Kraberg染色，放大倍数70倍（E);由间充质细胞包 围绕的内胚层腺体结构，胶原纤维大量产生，Van Gieson染色，放大倍数280倍（F);复层上 皮，中心为角化过度的珠状物（pearl)，左侧为另一个腺体，h/e染色，放大倍数140倍（G); 腺体集落，h/e染色，放大倍数70倍（H);含有产生褐色色素--可能为胆汁色素--的细 胞的腺体，由脂肪组织和间充质细胞包绕，h/e染色，放大倍数140倍（I)。
【具体实施方式】
[0036] 在描述本发明的组合物、方法以及培养方法学之前，应理解的是，本发明不限于所 描述的具体组合物、方法以及实验条件，因为这些组合物、方法以及条件可变化。还应理解 的是，本文所使用的术语目的仅在于描述【具体实施方式】，而不意图进行限制，因为本发明的 范围将仅由所附权利要求书来限制。
[0037] 如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，单数形式"一 (a) "，"一（an) "和"该（the) "包括复数指代物。因此，例如，提及"该方法"包括一种或更 多种方法，和/或本文描述类型的步骤，其在本领域技术人员阅读本公开内容等