，通常作为突变和野生型mtDNA分子的组合或形成 野生型变体的组合（Spikings 等，Hum Repro Update (2006) 12(4) :401_415)。因为异 质性可以导致线粒体疾病，因此存在多种机制以确保仅仅母系的传送（maternal-only transmission)。但是，随着绕过用于维持同型异源性的正常机制的方案（例如，胞楽运输 (CT)和SCNT)越来越多的应用，扰乱的线粒体功能对于来自这些来源的干细胞可以是固有 的。
[0141] 在一方面，因为单性生殖体是单亲的，异质性的可能性被最小化。
[0142] 可以由细胞疗法治疗的其它疾病和状况示例性地包括：脊髓损伤，多发性硬化症， 肌肉萎缩症，糖尿病，肝病--包括急性疾病（病毒性肝炎、药物过量（对乙酰氨基酚）和 其它）、慢性疾病（慢性肝炎和其它（通常导致肝硬化））、遗传性肝脏疾病（血友病B、因子 IX缺乏、胆红素代谢缺陷、尿素循环缺陷、溶酶体贮积病、al-抗胰蛋白酶缺陷和其它），心 脏疾病，软骨替代（cartilage replacement)、烧伤、足部溃疡、胃肠疾病、脉管疾病、肾病、 视网膜疾病、尿路疾病以及衰老相关疾病和状况。
[0143] 这种方法可以被用于替代缺陷的基因，例如，缺陷的免疫系统基因、囊性纤维化基 因，或被用于引入引起治疗有利的蛋白质表达的基因，所述蛋白质例如生长因子、淋巴因 子、细胞因子、酶等。
[0144] 例如，编码脑衍生生长因子的基因可以被引入根据本发明产生的人多能细胞中， 该细胞分化成神经细胞并且该细胞被移植进入帕金森患者体内以延缓这种病期间神经细 胞的丢失。
[0145] 并且，对象多能人ES细胞可用作体外分化模型，尤其用于涉及临床和生物学研究 中的基因的研究。这种研究包括但不限于早期发育调控、再生医学或药物开发。例如，与感 兴趣基因一起转录的报告基因（例如，绿色荧光蛋白（gfp)，荧光素酶等）的插入可用于研 究疾病、发育生物学、再生医学或药物开发。而且，使用对象ES细胞产生的分化的细胞组织 和器官可用于药物研究。
[0146] 进一步，对象ES细胞或由其得到的分化细胞可以被用作产生其它ES细胞和细胞 集落的核供体。
[0147] 更进一步地，根据本公开内容得到的多能细胞可以用于鉴定参与胚胎发生的蛋白 质和基因。这可以通过例如差异表达实施，即，通过比较根据本发明提供的多能细胞中表达 的mRNAs和当这些细胞分化成不同的细胞类型例如神经细胞、心肌细胞、其它肌细胞、皮肤 细胞等时所表达的mRNA。因此，有可能确定哪种基因参与特定细胞类型的分化。
[0148] 进一步地，具有特定遗传缺陷如导致杜兴肌营养不良（Duchene' s Muscular Dystrophy)的遗传缺陷的ES细胞和/或它们的分化后代，可以被用作研究与该遗传缺陷相 关的特定疾病的模型。
[0149] 并且，本公开内容的另一个目标是，以不同浓度以及在不同细胞培养条件下，例 如，在不同细胞基质中或在不同的气体分压下培养，使根据所述方法产生的多能细胞系暴 露于不同生长因子的混合物，以便确定诱导期望的分化细胞类型产生和繁殖的条件。
[0150] 下述的实施例意图说明本发明而不是限制本发明。
[0151] 实施例
[0152] 人单件牛葙杯胎发牛干细朐的产牛
[0153] 材料和方法
[0154] 供体选择和知情同意方法
[0155] 供体从女性集合中征集，其首先被提供至IVF中心，并且查明其符合根据临床指 导的IVF方法。
[0156] 每个可能的供体由她的医生接洽并被告知该研究并提供咨询。如果供体选择参 加，则向供体提供以俄语起草的全面知情同意文件（由独立的基于美国ESCR0委员会审查 和批准），其概述了研究目的和过程。如果可能的供体有疑问，可由医生进行处理。只有签 署知情同意文件的可能的供体参加该研究。
[0157] 供体自愿地捐献卵母细胞而没有支付金钱。供体签署知情同意文件，其陈述，所有 的捐献材料被用于研究而不是用于生殖目的，即，衍生人ES细胞和它们的分化后代的方法 的发展。
[0158] 根据针对人类细胞、组织以及基于细胞和组织的产品的FDA合格测定指南（FDA HCT/Ps，2004)和俄罗斯公共卫生部第67号（02. 26. 2003)，确定研究合格性。其包括全面的 医学检测，具有X-射线、血液（包括肝功能检测）和尿液分析。供体还被筛查沙眼衣原体 (Chlamydia trachomatis)、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae)、梅毒、HIV、HBV 和 HCV。
[0159] 根据HLA型进一步筛选参加研究的可能的供体和亲本。
[0160] 在该方法中，收获卵母细胞的优先选择是成功的IVF方法。选择最佳的完全发育 成熟的卵丘卵母细胞复合体进行IVF。如果收获的卵母细胞总数小于11，则将该女性从用 于研究目的的捐赠中自动去除。
[0161] 供体超排卵
[0162] 每一供体在她们月经周期的第3天到第13天经受应用FSH (Gonal-F, Lab. Serono, Switzerland)的卵巢刺激。总计给予1500IU。在供体月经周期的第10天到第 14天，以0. 25mg/天注射促性腺素释放激素拮抗剂0rgalutran(0rganon，Holland)。在 供体月经周期的第12天到第14天，每天提供注射75IU FSH+75IU LH(Menopur,Ferring GmbH, Germany)。如果超声波检查显示卵泡直径为18mm到20mm之间，则在供体月经周期的 第 14 天施用单剂量的 8000IU hGC(Choragon,Ferring GmbH,Germany)。在大约第 16 天， hCG注射之后35小时，进行经阴道穿刺。通过超声波引导的针抽吸，将来自麻醉供体囊状卵 泡的卵泡液收集到无菌试管中。
[0163] 卵母细胞活化和单性生殖胚胎的培养
[0164] 从卵泡液中选出卵丘卵母细胞复合体（COCs)，在冲洗培养基（MediCult)中冲 洗，随后在20% 02、5% C02 , 37°C潮湿气氛下，在通用IVF培养基（Universal IVF medium) (Medicult)中孵育2小时，用液体石蜡（MediCult)覆盖。在激活之前，COCs用SynVitro Hyadase (MediCult)处理而去除卵丘细胞，随后在的通用IVF培养基中孵育30分钟，用石蜡 覆盖。除了 A23187处理外，在湿润的环境下在37°C使用减少02的气体混合物（90% N2+5% 02+5%C02)进行卵母细胞和胚胎的进一步培养，其在COCs培养所述的条件下进行。通过 将卵母细胞连续暴露于5iiM A23187(Sigma)五分钟以及10ii g/ml嘌呤霉素（Sigma)或 ImM6-DMAP(Sigma)四小时，在通用IVF培养基中进行活化，用石蜡覆盖，然后在通用IVF培 养基中谨慎地洗涤卵母细胞。然后，将卵母细胞置于新鲜的IVF培养基中，培养后用石蜡覆 盖。次日（第一天），使用顺序的BlastAssist系统培养基（MediCult)，根据厂商的建议， 将单性生殖活化的卵母细胞培养至胚泡期。从衍生的胚泡中，在第五天从六个培养物中分 离内细胞团（ICM)。
[0165] 胚泡内细胞团的分离和hpSC-Hhom的培养
[0166] 用0.5%链霉蛋白酶（Sigma)处理去除透明带。将全胚泡置于丝裂霉素C有丝 分裂失活的人新生皮肤成纤维细胞（NSF)的饲养层上（Revazova等，2007,上文），在为 hpSC-Hhom培养设计的培养基中培养。当胚泡粘附后滋养层细胞铺展时，ICM成为可见。另 外培养三至四天后，使用精细拉长的玻璃移液管通过从滋养外胚层生长物中机械剪切ICM 来分离ICM。分离的ICM置于新鲜的饲养层上并另外培养三至四天。将第一个集落机械地 切出，并在培养五天后重新铺板。在培养五至六天后，得到所有的传代细胞。较早传代集落 被机械地分成块并重新铺板。用胶原酶IV处理和机械分离进行hpSC-Hhom的进一步传代。 在湿润气氛下在37°C、5% C02下进行hpSC-Hhom繁殖。
[0167]对于 ICM 和 hpSC-Hhom 的培养，我们使用 VitroHES (Vitrolife)，其补充有 4ng/ml hrbFGF(Chemicon)、5ng/ml hrLIF(Chemicon)和 10%人胳带血清。用于 NSF 培养的培养基 由90 % DMEM (高葡萄糖，具有L-谷氨酰胺）（Invitrogen)、10 %人脐带血清和青霉素-链霉 素（lOOU/lOOiigMlnvitrogen)组成。在培养基制备前，对人脐带血清进行梅毒、HIV、HBV 和HCV筛选。
[0168] hpSC-Hhom 的表征
[0169] 为了免疫染色胚胎干细胞标记物，用4%多聚甲醛将hpSC-Hhom集落在室温固定 20分钟，以鉴定SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4,在-20°C用100%甲醇固定5分钟以鉴定其余 标记物。所用单克隆抗体包括：来自Chemicon的SSEA-1 (MAB4301)、SSEA-3(MAB4303)、 SSEA-4(MAB4304)、TRA-1-60(MAB4360)和 TRA-1-81(MAB4381)，以及来自 Santa Cruz Biotechnology 的 OCT-4 (sc-9081)。第二抗体包括：来自 Molecular Probes (Invitrogen) 的Alexa Fluor 546 (橙色-荧光）和488 (绿色-荧光），用DAPI染核（Sigma)。用AP试 剂盒和TRAPEZE试剂盒（Chemicon)检测碱性磷酸酶和端粒酶活性。用常规方法制备染色 体切片。根据胰蛋白酶-Giemsa技术进行G-带分析，并且在每种情况下对30-100个中期 染色体进行核型分析。
[0170] 胚状体形成和神经分化
[0171] 将HpSC-Hhom集落机械地分成块和置于用2 %琼脂糖（Sigma)预包被的24-孔 族集板（cluster plate)中，在含有 85% Knockout DMEM、15%人胳带血清、1XMEM NEAA、 ImM Glutamax、0.055mM P-巯基乙醇、青霉素-链霉素（50U/50iig)(除血清外均来自 Invitrogen)的培养基中。在悬浮液中培养胚状体14天，然后铺板进行生长发育或在悬浮 液中另外培养一周。
[0172] 在一周时间内，在分化培养基DMEM/F12、B27、2mM Glutamax、青霉素-链霉素 (lOOU/lOOu g)和20ng/ml hrbFGF (均来自Invitrogen)中，通过培养附着至培养皿表面的 两周大的胚状体，诱导神经分化。一些胚状体产生具有神经形态的分化细胞，其它被分开并 另外培养产生神经球。
[0173] 在与用于产生胚状体的相同培养基中，在铺至粘附表面上培养五天后，搏动胚状 体（beating embryoid bodies)自发出现。
[0174] hpSC-Hhom分化衍生物的免疫细胞化学
[0175] 胚状体、神经球或收缩胚状体被铺在聚-D-赖氨酸（Sigma)处理的小盖玻片（VWR Scientific Inc.)上并在适当的分化培养基中培养约一周。对于免疫染色，在-20°C用 100%甲醇固定分化细胞5分钟。
[0176] 对于检测外胚层标记物，我们使用单克隆小鼠抗神经丝68抗体（Sigma)、抗人 Q)56(NCAM)抗体（Chemicon)和抗0 III微管蛋白抗体（Chemicon)来显示神经元标记物。 抗神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP)抗体（Chemicon)用于检测神经胶质细胞标记物。
[0177] 对于检测三周大的胚状体或收缩胚状体中的中胚层标记物，将单克隆小鼠抗结蛋 白抗体（Chemicon)、抗人a辅肌动蛋白抗体（Chemicon)用作肌肉特异性标记物，将抗人 CD31/PECAM-1 抗体（R&D Systems)、抗人 VE-钙粘蛋白（CD 144)抗体（R&D Systems)用作 内皮标记物。
[0178] 对于检测胚状体中的内胚层标记物，使用单克隆小鼠抗人a -胎蛋白抗体（R&D Systems)。第二抗体Alexa Fluor 546 (澄色突光）和488 (绿色突光）来自Molecular Probes (Invitrogen)。用 DAPI 染核（Sigma)。HLA 基因型分型
[0179] 对供体和它们的亲本进行HLA单元型和HLA基因型分型的研究。用来自 Dynal (Invitrogen)的 Dynabeads DNA Direct Blood 从血液、卵丘细胞、hpSC-Hhom 和 NSF 中提取基因组DNA。用等位基因特异性测序引物（PCR-SSP，Protrans)通过PCR进行HLA基 因型分型。所有测试根据厂商推荐进行。.
[0180] Affimetrix SNP 微阵列分析
[0181] 通过酚/氯仿提取方法，从血液、卵丘细胞、hpSC-Hhom和NSF分离基因组DNA。用 Affimetrix Mapping 250K Nsp Arrays对从三个供体、四个hpSC-Hhom系和NSF获得的DNA 样品进行基因型分型。由于包含252, 973个二进制（binary) SNP标记物的原始数据组超过 确定基因组样品等价性（equivalency)所需的数目，其被减少以简化计算。
[0182] 下列标准用于选择基于遗传考虑的标记物：1)标记物中的杂合性程度越高，它 们提供的鉴定SNP样本来源的信息越多。二进制SNP标记物的杂合性最大值设为0. 5 (is capped at a maximum of 0? 5)。只选择杂合性大于0? 375的SNP标记物（即在高加索人 群中，没有等位基因具有小于〇. 25或大于0. 75的频率）；2)使用所有22对常染色体；3) 去除可靠性低的标记物，因为普通来源样品的鉴定是对基因型分型误差高度敏感的。在 Affymetrix数据组中，高置信度得分相对应于低可靠性，因此去除这些具有高置信度得分 的标记物。在默认设置中，如果它的置信度得分超过0.25,则对标记物不进行呼叫（call)。 通过对所有12个样本只选择那些置信度得分小于或等于0. 02的标记物，对可靠性应用甚 至更为严格的要求。
[0183] 应用这些标准，SNP标记物的数量从252, 973个降至4, 444个。采取一个最终步骤 来降低标记物数量（不进行随机采样），其通过只选择那些标记物间距为至少0. lcM(lMbp =lcM)的标记物而实施，因为相互距离很近的标记物提供较少的信息，原因在于在它们之 间存在紧密连锁。这些步骤产生3, 993个标记物的最终选择。
[0184]因此，用 Relcheck (版本 0? 67, copyright (C) 2000Karl W. Broman, Johns Hopkins University,得到 GNU General Public License version 2 许可（1991 年 6 月））分析所 选择的3, 993个标记物。Relcheck提供测定一对SNP样本之间关系的方法。这基于计算 似然比，用于观察根据样本之间的遗传关系的标记物的给定构型。使用Relcheck基于的知 识是由于同卵双生双胞胎具有相同DNA，所以两个样本之间的等价性测试可通过检测是否 那些样本可能来自同卵双生双胞胎来进行。运行Relcheck，假定基因型分型误差率为大约 0.4%。Relcheck程序鉴定五种类型的关系：同卵双生双胞胎、父母/子女对、全同胞（full siblings，full sibs)、半同胞（half siblings，half sibs)和不相关（Boehnke M?等，Am J Hum