时将成为 显而易见的。
[0038] 本发明公开用于获得人HLA纯合单性生殖干细胞系的至少两种不同方法，所述细 胞系用于基于移植的干细胞治疗。
[0039] 在一个实施方式中，一个细胞系源于HLA纯合供体，其包括在卵母细胞活化过程 中使用A23187和6-DMAP，阻止第二极体的挤出，从而保留MII卵母细胞的所有遗传物质。 源于这些卵母细胞的干细胞的HLA基因型与供体的HLA基因型匹配（Revazova等，Cloning Stem Cells(2007)9(3) :432-449)。在一个相关方面，也可获得来自HLA纯合供体的二倍体 hpSC-Hhom-1 系。
[0040] 在另一个实施方式中，HLA纯合胚胎干细胞可源于HLA杂合卵母细胞供体，其 包括使用A23187和嘌呤霉素的组合将卵母细胞单性生殖活化，其允许第二极体挤出。 因此，活化的卵母细胞只含有一套中期II染色体的一半，其允许形成纯合基因型。例 如，由钙离子载体和嘌呤霉素的组合活化的人卵母细胞的80 %显示前核，第二极体挤 出。进一步，细胞遗传分析表明，78%含有一套正常单倍染色体（Yamano S.等，J Med Investigation(2000)47(1-2) : 1-8)。此外，用A23187和嘌呤霉素活化的人卵母细胞显 示一个前核和两个极体，具有一套单倍染色体（Nakagawa K.等，Zygote(2001)9:83_88)。 这种具有一套正常单倍染色体的前核单性生殖体已在小鼠模型中发育（Nakasaka H?等，Zygote (2000) 8:203-208)。
[0041] 使用这种方法从分离自HLA杂合供体的卵母细胞产生多个二倍体细胞系（例如但 不限于 hpSC-Hhom-2、hpSC-Hhom-3、hpSC-Hhom-4)。
[0042] 尽管不被理论所束缚，但HLA基因型分型数据表明，HLA单元型排他性地从供 体亲本之一遗传。SNP分析数据表明，这三种细胞系是整个基因组纯合的，如SNP分析 所评估。例如，本发明中公开的示例性细胞系（参见实施例1)具有二倍体核型，这对应 于其中二倍体干细胞系源于单倍体小鼠胚胎的早期工作（Kaufman等，J Embryol Exp Morphol (1983)73:249-261)。
[0043] 卵母细胞活化后单倍体遗传物质复制的准确机制和时间是不清楚的，但是，尽管 不被理论所束缚，DNA复制看起来在不存在细胞卵裂或分裂的情况下发生。在先研究表明， 80%的单性生殖活化的小鼠卵母细胞保持它们的单倍体状态直到桑椹胚期，随后的源于这 些胚胎的干细胞系成为二倍体（Kaufman M. H.等，1983,上文）。
[0044] 除了替代疗法之外，源于hpSC-Hhom系的细胞和组织的储存在遗传疾病治疗中可 具有无法衡量的价值。根据约翰霍普金斯大学（John Hopkins University)在线人类孟 德尔遗传数据库（the Online Mendelian Inheritance in Man，0MIM)和美国国立生物技 术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI)，存在多于 100种遗传疾病，这一目录持续扩展。实例包括阿尔茨海默氏症、糖尿病、Graves症（突眼 性甲状腺肿）、血友病、亨廷顿氏症、肌肉萎缩症、帕金森氏症、镰状细胞贫血症、苯丙酮尿 症-PKU和重度联合免疫缺陷病（SCID)。在这些情况中，使用获自不携带相同遗传缺陷的供 体的细胞系会是重要的。
[0045] "分化"是指发生在细胞中的变化，所述变化使那些细胞呈现某些特化的功能以 及失去变化成某些其它特化的功能单元的能力。能够分化的细胞可以是全能细胞、多能 (pluripotent)细胞或多能性（multipotent)细胞中的任意。分化相对于成熟的成体细胞 可以是部分的或完全的。
[0046] "单雌生殖（Gynogenesis) "是指在细胞活化后导致产生包含可辨别的滋养外胚层 和内细胞团的胚胎，所述细胞例如卵母细胞或其它胚胎细胞类型，包括全部雌性来源的哺 乳动物DNA，优选人类雌性来源，例如人类或非人类灵长动物卵母细胞DNA。这种雌性哺乳 动物DNA可以通过例如至少一个DNA序列的插入、缺失或取代被遗传修饰，或可以未被修 饰。例如，DNA可以通过插入或缺失期望的编码序列，或促进或抑制胚胎发生的序列被修饰。 一般地，这样的胚胎将通过体外激活包含全部雌性来源DNA的卵母细胞而获得。单雌生殖 包含在下面所定义的单性生殖中。它还包括其中精子的DNA没有贡献于被激活卵母细胞中 的DNA的激活方法。
[0047] 在一个相关的方面，卵母细胞从制备用于IVF的超排卵（superovulating)对象获 得。用于IVF中的"超排卵"技术，如用激素处理雌性对象，被设计成刺激卵巢产生几个卵 (卵母细胞），而不是如在自然周期中通常的一个卵。
[0048] 促进卵产生所需要的药物治疗可包括但不限于下列：醋酸亮丙瑞林（Lupron)(促 性腺素释放激素激动剂）、〇rgalutran、Antagon或西曲肽（Cetrotide)(促性腺素释放激素 拮抗剂）、Follistim、Bravelle 或果纳芬（Gonal-F) (FSH，促卵泡激素）、Repronex (FSH 和 LH的组合，促黄体激素）、和波热尼乐（Pregnyl)或Novarel (hCG，人绒毛膜促性腺素）。 [0049] 在一个相关方面，在经阴道超声指引下可以进行卵的收集。为完成这一过程，应用 超声将针通过阴道壁插入（例如，在IV镇静下）到卵巢中以定位每一个卵泡。卵泡液被抽 到试管中以取得卵。
[0050]通过"单性生殖（Parthenogenesis) "（ "单性生殖激活（parthenogenically activated)" 和"单性生殖激活（parthenogenetically activated)" 被交换使用）过程， 卵母细胞的激活在缺少精子穿入下发生，并且其是指包含滋养外胚层和内细胞团的早期阶 段胚胎的发育，所述胚胎通过激活包含全部雌性来源DNA的卵母细胞或胚胎细胞例如卵裂 球而获得。在一个相关方面，"单性生殖体"是指通过这种激活得到的所得细胞。在另一相 关方面，"胚泡"是指分裂阶段的受精或激活的卵母细胞，其包含由外滋养层细胞和内细胞 团（ICM)组成的中空细胞球。在又一相关方面，"胚泡形成"是指在卵母细胞受精或激活之 后的过程，其中随后卵母细胞在培养基中被培养一段时间，所述时间能够使其发育成由外 滋养层细胞和ICM组成的中空细胞球（例如，5到6天）。
[0051] 在一个实施方式中，公开了通过单性生殖激活的卵母细胞产生克隆人类胚胎干 细胞系的方法。虽然单性生殖在自然界中不是罕见的繁殖形式，但不知道哺乳动物能够 进行这种繁殖形式。然而，在雌性近交系小鼠LT/Sv的卵母细胞中，可以发现比例为10% 的自发单性生殖（Hoppe 和 Illmensee，Proc Natl Acad Sci USA(1982)79:1912-1916)， 并且自发单性生殖也解释了人类葡萄胎的形成（Berkowitz和Goldstein, New Eng J Med (1990) 335 (23) : 1740-1748)。有胎盘哺乳动物的卵母细胞能够被诱导进行体外单性生 殖；但是，胚胎发育是不成功的。
[0052] 单性生殖激活哺乳动物卵母细胞和将激活的卵母细胞转移进入代理母亲 之后，具有有限的胚胎存活：小鼠为10天；羊为21天；猪为29天；兔为11. 5天 (Kure-bayashi 等，Theriogenology(2000)53:1105-1119;Hagemann 等，Mol Repord dev (1998) 50:154-162 ;0zil 和 Huneru，Development (2001) 128 :917-928 ;Surani 和 Bar ton, Science (1983) 222:1034-1036)。这种发育停滞的原因可能是由于遗传印记（genetic imprinting)。已经显示，母亲与父亲的基因组是表观遗传上不同的（epigentically different)并且这两组对于成功的胚胎发育都是必需的（Surani，Cell (1998) 93:309-312 ; Sasaki等，（1992)6:1843-1856)。虽然不限于理论，但在单性生殖体中，所有的遗传物质应 该是母系来源，因此应当缺少父系印记。父系印记被认为负责胚外（extra-embryo)组织发 育，因此负责去核卵母细胞受精之后滋养层组织发育（Surani和Barton，（1983)，见上文）。 因此，在动物中，去核的受精卵对于核转移和随后的单性生殖激活可以是有用的。
[0053] 哺乳动物单性生殖体仅仅经历有限的发育，胚胎最终死亡。在食蟹猴（Macac €&8(^(311131^8)中，体外单性生殖激活之后的中期11阶段卵母细胞中的仅仅14%在 培养 8 天之后发育到胚泡阶段（Vrana 等，Proc Natl Acad Sci USA(2003) 100(Suppl 1):11911-11916)。
[0054] 在LT/Sv近交系小鼠的未交配雌性中，以自发激活单性生殖体形成的胚胎在几天 内死亡。当从包含这些胚胎的内细胞团（ICM)的细胞进行核转移到受精的去核C57BL/6j 小鼠卵母细胞中时，得到具有LT/Sv基因组的克隆小鼠（Hoppe和Illmensee，Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79:1912-1916)。因此，受精卵母细胞的使用允许单性生殖体的足月发 育。在一方面，受精的去核人卵母细胞能够被用于支持包含供体细胞核的单性生殖胚胎的 发育，直到胚泡阶段。
[0055] "多能细胞"是指来自通过激活包含全部雌性或雄性来源DNA的细胞而产生的胚 胎的细胞，其可以在未分化状态下在体外保持长期时期、理论上为无限的时期，其可以产生 不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层、和内胚层。细胞的多能状态优选地通过在合适条 件下培养内细胞团或来自胚胎的内细胞团的细胞而保持，所述胚胎由雄核发育或雌核发育 方法产生，所述条件例如，通过在成纤维细胞饲养层或其它饲养层或包含白血病抑制因子 (LIF)的培养物上培养。这种培养细胞的多能状态可以通过多种方法确认，例如，（i)确认 表征多能细胞的标志物的表达；（ii)包含表达多能细胞基因型的细胞的嵌合动物的产生； (iii)将细胞注入到动物例如SCID小鼠中，在体内产生不同的分化细胞类型；以及（iv)在 体外，观察到细胞分化（例如，当在缺少饲养层或LIF下培养时）为胚状体和其它分化细胞 类型。
[0056] "二倍体细胞"是指细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有全部雄性或雌性来源的 二倍DNA内容物。
[0057] "单倍体细胞"是指细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有单倍DNA内容物，其中单 倍DNA是全部雄性或雌性来源。
[0058] 激活是指一种过程，其中例如--但不限于此，在减数分裂中期II中，受精或未受 精卵母细胞进行这样的过程：所述过程一般包括染色单体对的分离，第二极体挤出，产生具 有单倍数目染色体的卵母细胞，每一染色体具有一条染色单体。激活包括这样的方法，通 过该方法，包含全部雄性或雌性来源DNA的细胞被诱导发育成具有可辨别的内细胞团和滋 养外胚层的胚胎，这对于产生多能细胞是有用的，但其本身可能不能发育成存活的后代。例 如，激活可以在下面的一种条件下进行：（i)不引起第二极体挤出的条件；（ii)引起极体挤 出但其中极体挤出被抑制的条件；或（iii)抑制单倍体卵母细胞第一次细胞分裂的条件。
[0059] "中期II'是指细胞发育的一个阶段，其中细胞的DNA内容物由单倍数目染色体组 成，每一染色体由二条染色单体表示。对于本发明，人中期II卵母细胞单性生殖活化后的 第二减数分裂的抑制和二倍体胚胎的产生导致MHC-杂合phESC的获得。
[0060] 通常，哺乳动物输卵管和子宫中的氧张力远小于在正常大气中发现的氧张力的一 半（Fischer 和 Bavister，J Reprod Fertil(1993)99:673-679;Kaufman 等，Comp.Biochme Physiol Comp Physiol (1994) 107:673-678)。对于IVF后人胚胎的成功培养，已使用20%以 及5%的氧浓度。但是，增加的氧可产生可诱导凋亡的活性氧种类（Van Soom等，Theriogeo logy (2002) 57:1453-1465)。已报道，低氧浓度增加植入前胚胎的存活性，帮助它们的正常发 育并给予健康胚泡形成的较高发生率，其通过更多细胞数量和内细胞团（ICM)的良好形成 显示（Dumoulin等，Hum Reprod (1999) 14:465-469)。在以往的研究中，使用具有高（20%) 氧含量的气体混合物，人单性生殖胚胎在体外发育（Lin等，Stem Cell (2003) 21:152-161 ; Cibelli 等，J Reg Med(2001)2:25-31)。
[0061] 在一个实施方式中，ICM分离和phESC培养的方法包括使用人皮肤成纤维细胞，以 及细胞用人脐带血清（HUCBS)而不是用动物血清繁殖并将它们用做饲养细胞。phESC系的 衍生和培养可在为hESC培养设计的VitroHES培养基（Vitrolife)中添加HUCBS进行。例 如，在hESCs产生中使用HUCBS具有对ICM生长和phESC繁殖的正效应（例如，添加HUCBS 与缺乏HUCBS相比，在VitroHES培养基中的phESC生长更好）。进一步，与免疫外科和胰蛋 白酶处理相比，通过从滋养外胚层生长的机械剪切从全胚泡中分离ICMs显示为更温和与 优选的方法。此外，该方法允许与动物衍生试剂之间相互作用的排除。
[0062] 虽然本发明的phESC系显示hESC系表现出的一般特征，但是它们也显示独特的特 征，其包括实际上与卵母细胞供体的基因型相同的基因型，如见于单性生殖衍生的猴ES细 胞系 Cyn〇-l(Vrana 等，2003, Proc Natl Acad Sci USA (2003) 100:11911-11916)。同样地， 与SCNT比较，从单性生殖胚胎产生hESC系可以是产生MHC-匹配的和可能组织相容的胚胎 干细胞的较好方法。
[0063] 如小鼠和猴单性生殖干细胞的以往研究已显示的，这些细胞可形成畸胎瘤，其具 有来自所有三个胚层的衍生物（Lin等，2003,见上文；Vrana等，见上文）。在选择性培养 条件下，猴单性生殖胚胎干细胞已分化成神经细胞和功能性的多巴胺能和5-羟色胺能神 经元（Vrana等，2003,见上文）。本发明的phESC也可体外和体内分化成所有三个胚层的 衍生物并且是多能性的。此外，来自phESC的胚状体能够产生搏动的心肌细胞样细胞。
[0064] 本发明表明产生单性生殖人胚胎干细胞的方法，其中实验性数据显示，phESC可分 化成在治疗人类变性疾病中可具有重大价值的功能性细胞。
[0065] 在一个实施方式中，中期II卵母细胞在不同的02张力气体环境下通过温育卵母 细胞而激活。在一个相关方面，低〇2张力气体环境由包含大约2%、3%、4%、或5%的02浓 度的气体混合物产生。在进一步相关的方面，气体混合物包含大约5% C02。进一步地，气体 混合物包含大约90% N2、91%队或93% N2。这种气体混合物区别于含有5% 0)2的空气， 其大约有约5% C02、20% 02和75% N2。
[0066] "02张力"是指在流体（例如，液体或气体）中的氧气的分压（气体混合物的单一 成分施加的压力）。低张力是当氧分压（P〇2)低时的情况，高张力是当P〇2高时的情况。 [0067] "确定成分培养基条件"是指培养细胞的环境，其中详细描述了最佳成长所需要的 其中成分的浓度。例如，取决于细胞的用途（例如，治疗应用），从包含异种蛋白质的条件中