Genet (1997) 61:423-429 ;Broman K.W?等，Am J Hum Genet (1998) 63:1563-1563)。
[0185] 为了测定供体和干细胞样本15条染色体中杂合SNPs的比例，对6个干细胞系、4 个供体以及1个对照样本分析用于早期分析的1495个随机取样的SNP标记物。
[0186] 通过对染色体1-12中的每一条取最后一个可用的p标记物（短臂）和第一个可 用的q标记物（长臂）之间的中点来测定每条染色体着丝粒的定位。对于近端着丝粒染色 体13-15,在p臂上没有SNP标记物，因此假定着丝粒在位置0 (q臂的起点）。
[01B7] 下列数值用作chr 1-15的着丝粒定位（以距p臂末端的Mbp计）：
[0188] 染色体 # Mbp
[0189] chrl = 131. 5051
[0190] chr2 = 92. 7926
[0191] chr3 = 93. 1514
[0192] chr4 = 51. 0889
[0193] chr5 = 46. 8726
[0194] chr6 = 60. 5099
[0195] chr7 = 57. 8019
[0196] chr8 = 45. 3089
[0197] chr9 = 54. 6881
[0198] chr 10 = 39. 0399
[0199] chrl 1 = 52. 7549
[0200] chrl2 = 35. 6473
[0201] chr 13 = 0
[0202] chrl4 = 0
[0203] chr 15 = 0
[0204] 对于每一个SNP标记物，计算在具体染色体上距着丝粒的绝对距离（即，从着丝 粒的两个方向被等同处理，所有"负"距离被转换为正距离）。为了计算杂合子的比例，染 色体距离（距着丝粒）被分为15个间隔（在输出中称为"bins"）。每个间隔在长度上为 10Mbps。分配给每个"bin"的数字相当于那个间隔在染色体距离上的上限。所有单位都以 百万碱基对（Mbp)表示。例如：
[0205] Bins = 10相当于距着丝粒的间隔[0, 10]Mbp。
[0206] Bins = 70相当于距着丝粒的间隔[60, 70]Mbp。
[0207] Bins = 150相当于距着丝粒的间隔[140, 150]Mbp。
[0208] 原始Affiymetrix SNP数据组提供的碱基对距离用于保持与之前数据分析的一致 性。对于每个间隔，通过在那个间隔中所有SNPs的杂合性指示变量的平均值来评估杂合性 的比例。
[0209] 对于供体和干细胞，杂合性变量储存供体（2、12、10、11)和干细胞样本（3、4、5、9、 6、7、8)在每个SNP标记物位置的杂合性指示变量的平均值。纯合性比例的相应值可通过从 1中减去杂合子值而容易地得到。
[0210] 内部对照正确地鉴定了源于作为"同卵双生双胞胎"的相同hpSC-Hhom系的分裂 培养物之间的配对的基因型关联。
[0211] 印记基因分析
[0212] 如所述提取总 RNA(Chomcznski 和 Sacchi, Anal Biochem (1987) 162:156-159)并 用异丙醇沉淀。使用无RNAse的DNAse处理（Promega)去除剩余的基因组DNA。在20 ill 的反应体积中，使用RevertAid M-MuLV逆转录酶（Fermentas)从1 u g总RNA合成cDNA。 使用Taq DNA聚合酶（Fermentas)用liil cDNA进行PCR反应。根据厂商说明书进行所有 反应。
[0213] 引物序列和 PCR 条件如下：TSSC5 (Lee 等，Cancer Res (1998) 58:4155-4159) 正向引物 5'-GCTCTTCATGGTCATGITCTCCA-3'（SEQ ID N0:1)和反向引物 5' -GGAGCAGTGGITGTACAGAGG-3'（SEQ ID NO: 2)，在 94 °C 4min 条件下进行 1 个循环； 94°C lmin、55°C lmin 和 72°C lmin 进行 33 个循环。产物大小为 364bp。H19(Hashimoto 等，NatGenet(1995)9:109-110)正向引物 5，-TACAACCACTGCACTACCTG-3'（SEQ ID N0:3) 和反向引物 5' -TGGCCATGAAGATGGAGTCG-3'（SEQ ID N0:4)，在 94°C 4min 条件下进行 1 个 循环；94°C lmin、52°C lmin 和 72°C lmin 进行 38 个循环。产物大小为 148bp。PEG1_1 (Li 等，J Biol Chem(2002)277:13518-13527)正向引物 5'-GAG TCC TGT AGG CAA GGT CTT ACC T-3'（SEQ ID N0:5)和反向引物 5' -CTT GCC TGA AGA CTT CCA TGA GTG A-3'（SEQ ID NO: 6)，在 94 °C 4min 条件下进行 1 个循环；94 °C lmin、55 °C lmin 和 72 °C lmin 进 行35个循环。产物大小为155bp。PEGl_2(Li等，2002,见上文）正向引物5'-GCT GCT GGC CAG CTC TGC ACG GCT G-3'（SEQ ID N0:7)和反向引物 5' -CTT GCC TGA AGA CTT CCA TGA GTG A-3'（SEQ ID N0:8)，在 94°C4min 条件下进行 1 个循环；94°Clmin、 65°Clmin 和 72°Clmin 进行 39 个循环。产物大小为 230bp。SNRPN(Glenn 等，Hum Mol Genet(1993)2:2001-2005)正向引物 5' -CTTAGCTGAGACACCAAGAGG-3'（SEQ ID N0:9)和反 向引物 5' -GCAGCATCTTGCTACTCTTGC-3'（SEQ ID NO: 10)，在 94°C 4min 条件下进行 1 个循 环；94°C lmin、55°C lmin 和 72°C lmin 进行 33 个循环。产物大小为 246bp。GAPDH(Adjaye 等，661^(1999)237:373-383)正向引物5'-六〇^〇六6丁〇^丁6〇^11^(：-3'（5￡0 10勵：11)和 反向引物 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（SEQ ID NO: 12)，在 94°C 4min 条件下进行 1 个循 环；94°C lmin、55°C lmin和72°C lmin进行21个循环。产物大小为450bp。
[0214] 用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳（5iU/道）分析PCR产物，用溴化乙锭染色，并使用 Bioimaging系统（UVP)记录。重复进行RT-PCR实验，结果可重复。GAPDH用作遍在表达对 照。通过在每个PCT组中包括RT-阴性样本（在逆转录步骤不含逆转录酶）作为对照，排 除基因组污染。
[0215] 畸胎瘤形成和评价
[0216] 所有动物操作由实验动物保护国际评估和认证联合会（the Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Aminal Care International, AAALAC) 认证的俄罗斯科学院俄罗斯生物有机化学协会的分支--生物学实验室（the Biological Testing Laboratory-Branch of Shemyakin&Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences) (Pushchino, Moscow Region, Russia) 进行。
[0217] 由获自 Charles River laboratories Research Model and Services (德国）的 CB17/ICR-PRKDC-SCID CRL鼠繁殖的免疫缺陷SCID-米色小鼠用于畸胎瘤形成。为了注射 至小鼠中，使用IV型胶原酶将hpSC-Hhom从培养皿上酶分离，然后和重悬为小块。将大约两 百万至五百万hpSC-Hhom细胞注射至后肢上部皮下空间。大约两个月后，取出已形成的畸 胎瘤并用4%多聚甲醛固定。将一半的组织在蔗糖中低温防护并将另一半置于5%琼脂-琼 脂中，然后使用振动切片机将其切成60 y m的切片。将切片置于载玻片之上并用苏木精/ 伊红、Kraberg、Van Gieson 和 picrofucsin 染色。
[0218] 注射约两百万至五百万丝裂霉素C处理的用作phES细胞饲养层的人成纤维细胞 作为对照。在对照动物中未观察到畸胎瘤生长。
[0219] 卖施例1.单件牛葙体的产牛
[0220] 年龄均超过31岁的五个卵母细胞供体参与该研究。使用激素刺激获得卵母细胞， 其最初意图是体外受精（IVF)。从五个供体获得总共46个卵泡卵母细胞复合体（COCs)并 用于该研究（表1)。
[0221] 表1.单件牛葙体和单件牛葙杯胎干细朐系的产牛。
[0222]
【主权项】
1. 分离的多能人干细胞系，其源于单性生殖胚泡，其中所述胚泡和所述干细胞系缺少 父系印记，其中构成所述细胞系的至少一个细胞是 ： a) -个或更多个单核苷酸多态性（SNPs)杂合的；或 b) -个或更多个HLA等位基因纯合的；或 c) (a)和（b)的组合。
2. 权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞是HLA等位基因纯合的。
3. 权利要求1所述的分离的细胞系，其中当被移植到无免疫应答小鼠中时，所述至少 一个细胞形成畸胎瘤。
4. 权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞与未受精的卵母细胞供体 是MHC相容的。
5. 权利要求4所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞与胚泡供体的一级血亲是 MHC相容的。
6. 权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞根据供体来源被实质上遗 传印记。.
7. 权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞（i)会在体外培养中增殖 一年以上，（ii)在整个培养中保持分化为内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，以及 (iii)当在成纤维细胞饲养层上培养时被抑制分化。
8. 权利要求7所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞分化成下列细胞，选自： 神经元细胞、心脏细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、以及少突胶质细胞、 造血细胞、脂肪细胞、基质细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、角化细胞、胰岛细胞、淋巴前体细 胞、肥大细胞、中胚层细胞以及内胚层细胞。
9. 权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞由于缺少父系印记而不具 有形成可存活生物体的能力。
10. 权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞表达一个或更多个选自 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 以及 0CT-4 的标记物。
11. 包括分化细胞的细胞组合物在制备用于治疗下列疾病的药物中的应用：帕金森氏 症、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏症、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化症、肌肉萎缩症、囊性 纤维化、肝病、糖尿病、心脏病、黄斑变性、软骨缺陷或损伤、烧伤、足部溃疡、血管疾病、尿路 疾病、AIDS以及癌症，其中所述分化的细胞源于权利要求1所述的干细胞系。
12. 多能干细胞库，其包括自体或同种异体干细胞，其中所述干细胞源于来自一个或更 多个人供体的单性生殖活化的卵母细胞，以及其中所述干细胞是HLA纯合干细胞并且缺少 父系印记。
13. 权利要求12所述的库，其中根据单核苷酸多态性（SNP)标记物，每个库成员被鉴定 为全同胞、半同胞或不相关。
14. 权利要求12所述的库，其中所述卵母细胞供体与所述库中的成员是组织相容的。
15. 权利要求12所述的库，其中所述库的成员根据所述卵母细胞供体来源被基因组印 记。
16. 权利要求12所述的库，其中干细胞源于HLA杂合或HLA-纯合的卵母细胞供体。
17. 权利要求12所述的库，其中每个成员对于不同于其它库成员的MHC/HLA等位基因 组合而言是纯合的。
18. 权利要求12所述的库，其中每个成员是至少一个或更多个HLA I类基因和HLA II 类基因纯合的。
19. 权利要求12所述的库，其中所述HLA I类基因选自HLA A*、HLA B*、HLA以及Cw* 单元型组合。
20. 权利要求12所述的库，其中所述HLA II类基因选自HLA DRB1*、DRB3*、DRB4*、 DRB5*、DQAl*以及DQBl*单元型组合。
21. 权利要求12所述的库，其中每个成员（i)会在体外培养中增殖一年以上，（ii) 在整个培养中保持分化为内胚层、中胚层和外胚层组织之一或全部的衍生物的潜能，以及 (iii)当在成纤维细胞饲养层上培养时被抑制分化。
22. 权利要求21所述的库，其中每个成员保持这样的核型，其中染色体是整倍体并且 在延长培养中不改变。.
23. 权利要求12所述的库，其中每个成员可分化成外胚层、中胚层和内胚层生殖系细 胞。
24. 权利要求12所述的库，其中每个库成员根据HLA-型表征，并且每个成员与潜在受 体是HLA-匹配的。
25. 细胞库，其包括HLA-纯合多能干细胞，其中所述干细胞源于来自HLA-纯合或 HLA-杂合人卵母细胞供体的单性生殖活化的卵母细胞并且其中所述干细胞缺少父系印记。
26. 权利要求25所述的细胞库，其中所述干细胞通过与给定群体中常见的HLA-单元型 的同一'I"生来分选。
27. 权利要求25所述的细胞库，其中所述细胞库包括冷藏的自体或同种异体干细胞。
【专利摘要】本发明公开从HLA纯合和HLA杂合供体产生HLA纯合单性生殖人干细胞(hpSC-Hhom)系的方法。这些hpSC-Hhom系显示典型的人胚胎干细胞形态学，表达适当的干细胞标记物并具有高水平的碱性磷酸酶和端粒酶活性。另外，将这些细胞系注射到免疫缺陷动物导致畸胎瘤形成。而且，在HLA杂合供体的情况下，hpSC-Hhom系只从供体亲本之一遗传单元型。SNP数据分析表明：通过单核苷酸多态性(SNP)分析评估，源于HLA杂合卵母细胞供体的hpSC-Hhom系是整个基因组纯合的。本发明公开的方法将源自动物的组分的应用减到最少，其使干细胞可更实际地进行临床应用。
【IPC分类】A61K35-44, C12N5-077, A61P9-00, C12N5-0793, C12N5-075, A61P35-00, A61P25-14, A61P27-02, C12N5-0735, A61P25-00, A61P17-02, A61P25-16, A61P3-10, C12N5-07, A61P31-18, A61P37-02, C12N5-071
【公开号】CN104651299
【申请号】CN201510018547
【发明人】E·S·列瓦泽瓦, N·A·图罗文茨, L·N·库兹米切夫, J·D·贾纳斯
【申请人】国际干细胞公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2008年4月7日
【公告号】CA2683060A1, CN101715485A, EP2155861A1, EP2155861A4, US20080299091, WO2008124142A1