专利名称：一种组织特异性兼可调控性慢病毒基因表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种慢病毒双基因表达载体、其构建方法及应用。
背景技术：
慢病毒载体是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久件表达.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。一种有效的治疗基因载体需满足以下基本条件基因表达效率高，能达到治疗效果；对靶细胞组织有特异性且基因表达水平可控性从而使其使用具有安全性。为了达到基因表达的可控性，目前常用四环素或其衍生物作用于与其相对应的启动子达到受其控制的外源目的基因水平的调控。为了提高基因治疗的安全性，在载体构建中通常使用组织特异性启动子以达到相应组织细胞内的目的基因的表达。由于基因治疗的效果很大部分取决于靶细胞内的基因表达水平。因此，为提高基因表达效率，目前在基因治疗领域中常用的方法是采用两个独立载体联合转染细胞。第一个载体通常含一启动子用于表达一种转录激活因子，第二个载体含一对应与第一载体所含的转录激活因子的启动子用来表达目的基因，第一载体的转录激活因子通过加强作用于第二载体的启动子从而增高目的基因的表达水平。 用这种方法虽能提高基因表达治疗量却增加了用于转染细胞所需的总病毒量滴度。此外，由于慢病毒载体的基因组(genome)约8kb，只能容纳有限的外源性插入DNA 序列，而且双基因表达载体多为顺式表达，对第二个基因的表达量具有一定的降低。因此， 构建一种可控性与高效率的基因表达盒于一体的载体既能提高治疗效果又能增加安全性。 同时这样一种载体不但具有联合转染的效果同时又降低为了能达到联合转染效果所需的两个载体的总病毒量滴度，从而保证了既具使用安全性又降低了成本。
发明内容
为解决以上所述现有技术中存在的问题，本发明的构建了一种具有组织细胞特异性并兼备可调控目的基因高效表达的慢病毒双基因表达载体。此慢病毒载体具有两个各自独立的基因表达盒。两个基因表达盒呈反式方向设置并共享一个PolyA尾巴。一个基因表达盒沿5’至3’方向含有对药物呈可调控启动子，由其控制外源性目的基因的表达。另一个基因表达盒沿3’至5’方向含有组织细胞特异性启动子控制一转录激活因子。此转录激活因子在四环素衍生物DoxycyclineQox)的存在并达到一定剂量下能激活并放大另一基因表达盒内的可调控启动子从而显著提高目的基因的表达量。在药物不存在或低于一定剂量时，此载体由于转录激活因子未有效作用于可调控性启动子而呈低基线基因表达水平。此夕卜，在特异的组织细胞内，组织细胞特异性启动子由于该组织内源性转录激活因子对其的作用而活性增强，使受控于该组织细胞特异性启动子的外源性转录激活因子表达提高。在非特异的组织细胞内，外源性转录激活因子呈基线表达水平。当此慢病毒载体感染对应与其组织特异细胞并在Dox存在一定剂量下，受控于可调控启动子的外源性目的基因因双重放大效应而达到最高表达水平。本发明的另一个目的在于提供上述载体的构建方法；本发明的再一个目的在于提供上述载体在基因治疗领域中的应用，特别是肿瘤治疗。
图 1 是载体 TRELuc，VEcadrtTA 和 SindLuc-Al。图2是荧光酶基因在四环素衍生药物D0X(l/ml)调控下分别在血管特异性内皮细胞和非特异性细胞中的表达水平。图3是TRELuc,VEcadrtTA双载体联合转染和SindLuc-Al载体单独转染人体宫颈癌Hela细胞72小时后的慢病毒滴度量与插入基因表达盒大小的关系。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。本实施例将以SEQ IDN0. 1所示的慢病毒表达载体为例来具体描述其构建方法及应用。本发明的表达载体具有序列表SEQ ID No. 1所示的序列，其至少包括polyA60尾巴、逆式四环素反应激活因子(rtTA2s-M2)、血管内皮细胞特异性(VEcad)启动子，四环素调控性白蛋白融合(TRE/alb)启动子、荧光素酶基因(Iuciferase)。本发明还提供了构建上述表达载体的方法，其包括如下步骤1.以 pRRL. cPPT. PGK. eGFP. WPRE (Adogen 购买)为模版，用 BamHl-SaLl 酶切释放 eGFP 片段，然后把含有 BamHl-Xhol-Xmal-Smal-Xbal-Mlul-Nhel-BglII-SaLl 多酶切位点的DNA片段通过BamHl-SaLl位点联接到模版DNA载体，得到中间载体pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE ； 2.以 pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE 载体为模版，用 Xmal-Xbal 从 pG13_basic 载体(Invitrogen购买)酶切释放荧光媒体基因片段后再通过Xmal-Xbal位点，联结到pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE，得到中间载体 pRRL. cPPT. PGK. Luc. WPRE ；3.以 pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE 为模版，同过Xhol 酶切释放出 PGKDNA片段，得到中间载体 pRRL. cPPT. linker. WPRE ；4.通过 Nhel-BamHl 酶切载体 pmVEcad-rtTA(Invitrogen 购买)，释放出 mVEcad-rtTA片段，然后通过Nhel-BglII位点，联结到pRRL. cPPT. linker. WPRE得到慢病毒载体 pRRLcPPT.mVEcad-rtTA. WIRE(VEcadrtTA)(图 1)；5.通过 Xhol-Xbal 酶切点，从载体 pTREalb-Luc (Invitrogen 购买)释放 TREalb-Luc 片段；联接到 pRRL. cPPT. linker. WPRE，得到载体 pRRL. cPPT. TREalb-Luc (TRELuc)(图 1)；6. mVEcad-rtTA-S60PA 基因表达盒从载体 pmVEcad-rtTA-S60PA (Invitrogen 购买)通过Xhol-Accl酶切位点释放后再通过Xhol-ClaI联接到TRELuc载体，得到pRRL. cPPT. S60PA-rtTA-mVEcad-TREalb-Luc (SindLuc-Al)(图 1)慢病毒可控性载体。慢病毒转染 细胞与荧光酶基因表达水平测试人体微血管内皮细胞(Humvec)，人体脐带血管内皮细胞(Humvec)，人体脐带血管内皮细胞(Huvec)，！fep3B细胞和人体宫颈癌细胞(Hela)分别置于24孔细胞培养板，每孔用300微升DMEM含10%牛血清的培养液。当细胞在每孔中达到50-60%克隆率后，用慢病毒载体SindLuc-Al和TRELuc,VEcadrtTA双载体分别转染人体微血管内皮细胞(Humvec)， 人体脐带血管内皮细胞(Huvec)，！fep3B细胞和人体宫颈癌细胞(Hela)，感染复数(MOI) 为5次。转染16小时后，每孔内细胞用PBS清洗以去除病毒RNA，然后再加上述培养液继续扩增生长。至72小时，每孔内转染细胞再次由PBS液清洗两次后加Passive Lysis Buffer (Promega购买)溶碎，各孔内细胞提取物被系列稀释后每20微升用100微升荧光酶基因表达测试剂Luciferase Assay Reagent (Promega购买)混合，荧光酶基因表达水平由光度计测试。慢病毒滴度量测试慢病毒滴度的定量通过测试慢病毒感染颗粒量。分别被SindLuc-Al和TRELuc， VEcadrtTA双载体转染后的Hela细胞被置于24-孔培养板，每孔培养液中每毫升含8微克的聚凝胺(Sigma购买)。72小时后，被各载体转染的Hela细胞的全细胞基因组DNA用微小DNA血测试剂盒DNA Blood Mini Kit 50(Qiagen购买)提取.慢病毒颗粒滴度量用 (TU/mL)表示并通过定量聚合酶链式反应PCR来作定量分析。探针的5’用波长为518nm 的报告染色分子FAM标记，3’用波长为582nm的报告染色分子TAMRA标记，在PCR过程中探针的3’又被磷酸化。用于PCR作慢病毒滴度测试的引物和探针分别为正向引物 5，-CCGTTTCAGGCAACGTG-3，；反向引物5，-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3，；探针5，FAM-CCAGC CATGTACGTTGCTATCCAGGC-TAMRA-3 ‘ . PCR 的测试用 PCR Master Mix (Promega 购买)。结果组织特异性可调性慢病毒载体SindLuc-Al在转染具血管内皮细胞特异性人体微血管内皮细胞(Humvec)，人体脐带血管内皮细胞(Huvec)和非血管内皮细胞特异性 Hep3B细胞和人体宫颈癌细胞(Hela) 72小时后，在无Dox存在下，荧光酶基因在Humvec， Huvec, Hep3B和Hela细胞中基因表达水平与用慢病毒载体TRELuc，VEcadrtTA双载体联合转染的同种细胞中的表达水平无显著差别并呈基线水平表达(图2)。在Dox以每毫升1 微克存在的情况下同Dox不存在的条件下相比，荧光酶基因在SindLuc-Al转染的Humvec 细胞内的表达水平与用双载体转染的细胞内的表达水平都有显著提高(图2)，且呈现药物 Dox的可调控性。其中，在SindLuc-Al转染的Humvec细胞内的表达水平虽低于用双载体转染的细胞内的表达水平，而在SindLuc-Al转染的Huvec细胞内的表达水平却显著高于用双载体转染的细胞内的表达水平(图2)。在非血管内皮细胞特异性H印3B和Hela细胞内，用 SindLuc-A 1载体单独转染和TRELuc，VEcadrtTA双载体联合转染后，Dox的存在于否对荧光酶基因表达水平几乎无影响(图2)。在用慢病毒载体SindLuc-Al和TRELuc，VEcadrtTA 双载体联合转染的Hela细胞中，转染72小时后测试出的SindLuc-Al病毒滴度比TRELuc 和VEcadrtTA的滴度要低。由此可见，慢病毒载体SindLuc-Al不但呈现显著组织特异性和药物可调控性而且在不需增加病毒滴度的前提下能达到TRELuc，VEcadrtTA双载体联合转染的基因表达水平(图3)。
权利要求
1.一种慢病毒基因表达载体，其特征在于从5’ -3’方向至少包括以下元件i.PolyA尾巴序列；ii.转录激活因子编码序列；iii.对应于组织特异性启动子序列；iv.对应于药物和转录激活因子的可调控性启动子；v.包括编码至少一种目的外源基因序列。
2.权利要求1所述的慢病毒基因表达载体，其特征是元件i是S60PolyA尾巴。
3.权利要求1所述的慢病毒基因表达载体，其特征是元件ii是逆式四环素反应激活因子 rtTA2s-M2。
4.权利要求1所述的慢病毒基因表达载体，其特征是元件iii是血管内皮细胞特异性启动子VEcad。
5.权利要求1所述的慢病毒基因表达载体，其特征是元件vi是四环素调控性白蛋白融合启动子TRE/alb。
6.权利要求1所述的慢病毒基因表达载体，其特征是元件ν是荧光素酶基因 Iuciferase0
7.权利要求1-6所述的慢病毒基因表达载体中的任何一项，其特征是元件ν是选自一种或者多种治疗性基因，一种或多种报告基因。
8.权利要求7所述的慢病毒基因表达载体，其特征在于所述外源目的基因在功能与表达上受启动子iii影响。
9.权利要求1中所述的慢病毒基因表达载体在将遗传序列物质转入细胞的方法中的用途。
10.权利要求9所述的用途，其中所述细胞为血管内皮细胞。
11.权利要求9所述的用途，其中所述细胞为神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞。
全文摘要
本发明涉及一种慢病毒载体。具有组织特异性兼备可调控性双基因表达。其特征在于具有沿着5’至3’方向至少包括下列元件polyA60尾巴、逆式四环素反应激活因子(rtTA2s-M2)、血管内皮钙启动子(VEcad)，四环素调控性白蛋白融合启动子(TRE/alb)、荧光素酶基因(luciferase)。本发明构建的载体的双基因表达盒采用反式表达的方式，最大限度减少了外源性核苷酸序列片段，使其可插入有容量限制的慢病毒载体，并对插入的荧光素酶基因不作限定，可以自由选择外源性目的基因与可调控性启动子搭配，该载体表达盒在不需要提高慢病毒量滴度转染细胞的同时既能保持外源性目的基因可控性表达且显著提高外源基因的表达效率。
文档编号A61P35/00GK102154368SQ201010110290
公开日2011年8月17日 申请日期2010年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者张文炜, 杨光华, 王 华 申请人:上海比昂生物医药科技有限公司