一种特异性靶向QKI基因的sgRNA及其应用
【技术领域】
[00011本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及一种特异性靶向QKI基因的sgRNA，以 及CRISPR-Cas9特异性敲除人HEK293T细胞QKI基因的方法。
【背景技术】
[0002] 规律成族间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat;CRISPR_associated，CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复 合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks, DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)，造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除。
[0003] Cas9靶向切割DNA是通过向导核糖核酸（guide RNA，SgRNA)和靶序列互补识别的 原理实现的。sgRNA的特异性决定了基因编辑的精确程度。因此，设计、制备出精确性和特异 性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR_Cas9基因敲除的关键技术。
[0004] QKI是一类RNA结合蛋白，具有调控RNA剪切、运输等多个生物学功能。
[0005] CRISPR-Cas9快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过靶向敲除QKI基因，有助 于深入研究其功能。而能否设计、制备出精确性和特异性靶向QKI基因的sgRNA以及通过分 子生物学方法制备出靶向QKI基因的CRISPR-Cas9系统成为实现QKI基因敲除的关键技术。
[0006] 参考文献： Ran,F.A.et al.,Genome engineering using the CRISPR-Cas9system.NAT PR0T0C 8 2281(2013)。
[0007] Lauriat,T.L.et al·，Developmental expression profile of quaking，a candidate gene for schizophrenia,and its target genes in human prefrontal cortex and hippocampus shows regional specificity.J NEUR0SCI RES 86 785 (2008)。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供制备特异性靶向目标基因 QKI的SgRNA，序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 本发明的另一个目的是提供CRISPR-Cas9特异性敲除人HEK293T细胞QKI基因的方 法，通过以下步骤实现。
[00?0] -、sgRNA寡核苷酸的设计和选择
[0011] 靶向QKI基因的sgRNA的设计按如下原则：
[0012] 1.在QKI基因上选择特征为 5'-N(19)GG或 5'-N(20)GG-3'或5'，(21)66-3'的序 列。
[0013] 2. SgRNA在QKI基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
[0014] 3. sgRNA在QKI基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结 构域中；
[0015] 按以上原则，设计得到sgRNA，序列为SEQ No.l。
[0016]二、合成双链sgRNA寡聚核苷酸
[0017]根据选择的sgRNA，去除3 '端NGG三个碱基，在其5 '端加上CACCG得到正向寡核苷 酸；根据选择的sgRNA，去除3 '端NGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其5 '加上 AAAC，3'端加上C得到反向寡核苷酸。上述正向、反向寡核苷酸序列见SEQ N0.2和SEQ N0.3。 [0018]分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的SgRNA寡聚核苷酸变性、退 火，形成可以连入pSpCas9(BB)真核表达载体的双链。
[0019 ] 三、将SgRNA构建至pSpCas9 (BB) -2A-Puro载体，鉴定并扩增
[0020] 1.将退火的SgRNA寡聚核苷酸双链与pSpCas9(BB)-2A-Puro载体（序列见SEQ N0·4)连接获得pSpCas9(BB)-2A-Puro-QKIsg质粒(序列见SEQN0·5)。
[0021] 2.转化并涂Amp+平板。
[0022] 3.用SEQ ID N0.6的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。
[0023] 4.37°C 摇床摇菌过夜并抽提 pSpCas9(BB)-2A-Pur〇-QKIsg 质粒。
[0024]四、转染HEK293T细胞获得QKI基因敲除细胞
[0025] 1、按照.jet.PRIME*DNA&siRNA Transfection Reagent(Polyplus transfection， 114-01)的操作手册，将 pSpCas9(BB)-2A-Pur〇-QKIsg 质粒转染至 HEK293T 细胞。
[0026] 2.转染后细胞加入10μg/ml Puromycin(Merck，540411)药筛，消化存活细胞，将单 个细胞接种于96孔板。
[0027] 3、待细胞扩增后，提取基因组DNA，RT-PCR扩增靶向QKI区域片段，所用引物序列见 SEQ N0 · 7和SEQ N0 · 8，用Sanger法测序检测sgRNA靶向区域附近基因序列，测序引物见SEQ N0.8，确认是否发生移码突变。用Western Blot检测QKI基因已经被敲除。
[0028]本发明可以在较短时间内实现QKI基因敲除，免去了购买QKI基因敲除小鼠分离原 代细胞的复杂操作，且价格低廉，有助于进一步深入研究QKI的生物学功能。利用本发明制 备的特异性靶向人QKI基因的sgRNA能够精确靶向人QKI基因并且实现基因敲除。该制备方 法步骤简单、sgRNA靶向性好，QKI基因敲除效率高。
【附图说明】
[0029] Sanger法测序确认QKI阅读框发生移码突变，与参考序列相比缺失22个碱基（图1 和图2)。
[0030] Western Blot确认QKI基因敲除（图3)。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。
[0032]实施例1靶向人QKI基因的sgRNA的设计和合成
[0033] 1.靶向人QKI基因的sgRNA的设计。
[0034] (1)在狐1基因上选择特征为5'4(19)66或5'4(20)66-3'或5'4(21)66-3'的序 列。
[0035] (2)sgRNA在QKI基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
[0036] (3)sgRNA在QKI基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能 结构域中。
[0037] 按以上原则，设计得到sgRNA，序列为SEQ No.l。
[0038] 3.靶向人QKI基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建。
[0039]根据选择的sgRNA，去除3 '端NGG三个碱基，在其5 '端加上CACCG得到正向寡核苷 酸；根据选择的sgRNA，去除3 '端NGG三个碱基，获得