肽-dicer底物试剂及其特异性抑制基因表达的方法

专利名称：肽-dicer底物试剂及其特异性抑制基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及肽-dicer底物缀合物及其使用方法。
背景技术：
由于需要安全、有效地递送治疗性分子，所以肽适体的鉴定很重要。已经描述了肽适体(在 Beldhoen 2008 Int. J. Mol. Sci 9 :1276-1320 ;Moschos 等，2007 BiochemicalSociety Transaction,第 35 卷，第 4 部分:807-810 中综述)。发明简述本发明涉及含有与肽缀合的双链RNA(“dsRNA”)的组合物和用于制备所述组合物的方法。本发明的dsRNA为具有通过与肽缀合而优化的结构的双链RNA、小干扰RNA (siRNA)和Dicer底物siRNA(“DsiRNA”)，用于有效递送和靶向且作为有效和高效的抑制剂起作用，任选地所述dsRNA具有延长的抑制作用持续时间。本发明提供用于改善递送和靶向的dsRNA-肽缀合物。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，该组合物包含具有5'端和3'端的第一寡核苷酸链和具有5'端和3'端的第二寡核苷酸链，其中所述第一链和所述第二链的长度为至少16个和至多50个核苷酸，其中肽与所述dsRNA缀合并且其中所述dsRNA-肽缀合物与靶标结合。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的双链核糖核酸(dsRNA)组合物 ，该组合物包含具有5'端和3'端的第一寡核苷酸链和具有5'端和3'端的第二寡核苷酸链，其中所述第一链和所述第二链的长度为至少16个和至多50个核苷酸，其中所述肽与所述dsRNA缀合并且其中所述dsRNA-肽缀合物被靶细胞内化。 在一个方面，所述第一链和所述第二链的长度为至少25个和至多35个核苷酸、至少19个和至多35个核苷酸、至少19个和至多24个核苷酸、至少25个和至多30个核苷酸、至少26个和至多30个核苷酸或至少21个和至多23个核苷酸。在另一个方面，第二链在3'端包含突出。在另一个方面，第一链在3'端包含突出。在另一个方面，所述第二链和所述第一链中的至少一个在3'端包含突出。在另一个方面，所述第一链和/或所述第二链的所述3'突出的核苷酸包括经过修饰的核苷酸。在另一个方面，3'突出的长度为1-5个核苷酸。在另一个方面，所述第一链和所述第二链中的每一条链由相同数目的核苷酸残基组成。
在另一个方面，所述第一链的所述5'端的最后一个残基与所述第二链的所述3'端的最后一个残基形成错配碱基对。在另一个方面，所述第一链的所述3'端的最后一个残基与所述第二链的所述5'端的最后一个残基形成错配碱基对。在另一个方面，所述第一链的所述5'端的最后一个残基和倒数第二个残基与所述第二链的所述3'端的最后一个残基和倒数第二个残基形成两个错配碱基对。在其它方面，所述第一链的所述3'端的最后一个残基和倒数第二个残基与所述第二链的所述5'端的最后一个残基和倒数第二个残基形成两个错配碱基对。在另一个方面，肽包含6-100个氨基酸。在另一个方面，肽包含10-50个氨基酸。 在另一个方面，肽包含15-30个氨基酸。在另一个方面，肽包含10个氨基酸。在另一个方面，dsRNA-肽缀合物与受体结合。在另一个方面，dsRNA-肽缀合物与LDL受体家族的至少一个成员结合。在另一个方面，肽是PAR配体。在另一个方面，肽是PARl配体。在另一个方面，肽是生长因子配体。在另一个方面，肽是胰岛素或胰岛素样生长因子配体。在另一个方面，肽是IGF-I配体。在另一个方面，肽是激素配体。在另一个方面，肽是PTH配体。在另一个方面，肽是PTH-I配体。在另一个方面，dsRNA-肽缀合物与受体结合蛋白结合。在另一个方面，用稳定的连接子将肽与所述dsRNA缀合。在另一个方面，稳定的连接子包括同型双功能交联剂。在另一个方面，稳定的连接子包括异型双功能交联剂。在另一个方面，稳定的连接子包括三功能交联剂。在另一个方面，用可裂解的连接子将肽与所述dsRNA缀合。在另一个方面，可裂解的连接子包括二硫化物连接子。在另一个方面，用碳连接子将肽与所述dsRNA缀合。在另一个方面，碳连接子包含至多十八个碳。在另一个方面,碳连接子包含6个碳。在另一个方面，在无连接子的情况下将肽与所述dsRNA缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的第一链的3'端缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的所述第二链的3'端缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的第一链的5'端缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的所述第二链的5'端缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的第一链的5'端和所述第二链的5'端缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的所述第一链的5，端和所述第二链的所述3，端缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的第一链的3'端和所述第二链的3'端缀合。在另一个方面，将肽与所述dsRNA的第一链的3'端和所述第二链的5'端缀合。在另一个方面，将 至少一个肽与所述dsRNA的所述第一链内部缀合。在另一个方面，将至少一个肽与所述dsRNA的所述第二链内部缀合。在另一个方面，将至少一个肽与所述dsRNA的所述第一链内部缀合且将至少一个肽与所述dsRNA的所述第二链内部缀合。在另一个方面，将至少两个肽与所述dsRNA缀合。在另一个方面，至少两个肽是相同的。在另一个方面，至少两个肽是不相同的。在另一个方面，组合物还包含至少一个染料分子，且所述染料分子与所述dsRNA和所述肽中的至少一个缀合。在另一个方面，染料分子为聚芳烃。在另一个方面，染料为荧光染料。在另一个方面，组合物还包含治疗剂。在另一个方面，治疗剂为抗癌药物。在另一个方面，抗癌药物选自紫杉醇、三苯氧胺、顺钼、阿霉素和长春碱。在另一个方面，治疗剂为用于治疗代谢疾病或病症的药物。在另一个方面，肽包含毒素的靶向部分的一部分。在另一个方面，神经毒素为梭菌神经毒素。在另一个方面，所述组合物还包含至少一种递送肽。在另一个方面，从所述dsRNA的第一寡核苷酸链的3'端的第一个核苷酸(位置I)开始，用经过修饰的核苷酸取代位置1、2和/或3。在另一个方面，经过修饰的核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在另一个方面，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链中的一个或两个包含5'磷酸。在另一个方面，所述第一链或所述第二链的至少一个核苷酸是经过修饰的。在另一个方面，经过修饰的核苷酸残基选自2' -0-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氣、2' _稀丙基、2' _0-[2_(甲基氛基)-2_氧代乙基]、4 ' _硫代、4' -CH2-0-2'-桥、f -(012)2-0-2'-桥、2' -LNA,2/ -氨基和^ _0-(N-甲基氨基甲酸酯)。在另一个方面，所述dsRNA在所述细胞中由Dicer内源性裂解。在另一个方面，在所述细胞环境中，足以降低靶基因表达的所述分离的双链核酸的量选自I纳摩尔或更少、200皮摩尔或更少、100皮摩尔或更少、50皮摩尔或更少、20皮摩尔或更少和10皮摩尔或更少。在另一个方面，第一链与第二链通过化学连接子连结。在另一个方面，所述第一链的3'端与所述第二链的所述5'端通过化学连接子连结。在另一个方面，用引导Dicer裂解定向的经过修饰的核苷酸取代所述第二链或第一链的核苷酸。
在另一个方面，分离的组合物包含经过修饰的核苷酸，该经过修饰的核苷酸选自脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸、3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-叠氮基_3 ' _脱氧胸昔(AZT)、2' , 3 ' _双脱氧肌昔(ddl)、〗',3 ' _双脱氧-3' _硫代胞苷(3TC)、2' ,3/ -双脱氢-2' ,3/ -双脱氧胸苷(d4T)、3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)的单磷酸核苷酸、2'，3'-双脱氧-3'-硫代胞苷(3TC)和2'，3'-双脱氢-2'，3'-双脱氧胸苷(d4T)的单磷酸核苷酸、4-硫尿嘧唆、5-溴尿嘧唆、5-碘尿嘧唆、5-(3-氨基烯丙基)_尿嘧啶、,-0-烷基核糖核苷酸、2' -0-甲基核糖核苷酸、2'-氨基核糖核苷酸、2'-氟核糖核苷酸和锁核酸。在另一实施方案中，分离的组合物包含磷酸骨架修饰，该磷酸骨架修饰选自磷酸酯、硫代磷酸酯和磷酸三酯。 在另一个方面，所述第一链的所述3'端的经过修饰的核苷酸残基选自脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸和荧光分子。在另一个方面，所述第一链的至少一个核苷酸与所述第二链的至少一个核苷酸形成错配喊基对。在另一个方面，递送肽具有选自SEQ ID NO :1_89的氨基酸序列。在另一个方面，组合物是药物组合物。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低细胞中的靶基因表达的方法，该方法包括以与参照dsRNA相比可有效降低细胞中的靶基因表达的量，使细胞与本发明的分离的组合物接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于选择性地抑制细胞生长的方法，该方法包括使细胞与足以抑制细胞生长的本发明的一定量的所述分离的组合物接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低动物中的靶基因表达的方法，该方法包括以与参照dsRNA相比可有效降低动物细胞中的靶基因表达的量，用本发明的分离的组合物治疗动物。在一个方面，当与合适的对照dsRNA相比时，分离的组合物具有增强的药代动力学。在另一个方面，当与合适的对照dsRNA相比时，dsRNA具有增强的药效学。在另一个方面，当与合适的对照dsRNA相比时，dsRNA具有降低的毒性。在另一个方面，当与合适的对照dsRNA相比时，dsRNA具有增强的细胞内摄取。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低受治疗者细胞中的靶基因表达的药物组合物，该药物组合物包含与参照dsRNA相比可有效降低细胞中的靶基因表达的量的本发明的分离的组合物和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于合成本发明的dsRNA-肽缀合物的方法，该方法包括通过化学法或酶法合成所述dsRNA。在另一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的dsRNA-肽缀合物及其使用说明。附图简述图I(A-H)呈现根据本发明的有用的dsRNA-肽缀合物的示例性结构。“P” =根据本发明的肽(A-平端-平端)、(B和C-平端-突出端)、(D和E-不对称端)和(F和G-错配端)。图2示出本发明的HPRTl靶向dsRNA和KRAS靶向dsRNA的示例性序列。加下划线的残基指示2' -0-甲基修饰的位置。箭头指示dsRNA内dicer酶裂解的预计位点，而虚线指示对应祀RNA序列内Argonaute2介导的裂解的预计位置。图3示出本发明的肽缀合dsRNA的示例性肽序列。还列出了由肽结合的靶标。图4示意性描绘了本发明的示例性DsiRNA-肽缀合物，以及编号为2、3、5和6的相应DsiRNA-肽缀合物的示于泳道2、3、5和6中的适当缀合分子的大小改变。示意图中的箭头指示DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物内预计的dicer酶裂解位点。图5示意性描绘了本发明的另外的示例性DsiRNA-肽缀合物，以及指示编号为2 和3的DsiRNA-肽缀合物的示于泳道2和3中的适当缀合分子的大小改变。示意图中的箭头指示DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物内预计的dicer酶裂解位点。图6示意性描绘了本发明的其它示例性DsiRNA-肽缀合物，以及编号为2、3、4和5的相应DsiRNA-肽缀合物的示于泳道2、3、4和5中的适当缀合分子的大小改变。示意图中的箭头指示DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物内预计的dicer酶裂解位点。图7示意性描绘了示例性DsiRNA-肽缀合物(包括本发明的可裂解肽缀合物)，以及编号为2、3、4和5的相应DsiRNA-肽缀合物的示于泳道2、3、4和5中的适当缀合分子的大小改变。示意图中的箭头指示DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物内预计的dicer酶裂解位点。图8示意性描绘了本发明的示例性DsiRNA-环肽缀合物，以及指示编号为2的DsiRNA-肽缀合物的示于泳道2中的适当缀合分子的大小改变。示意图中的箭头指示DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物内预计的dicer酶裂解位点。图9示意性描绘了本发明的示例性DsiRNA-肽缀合物，其中示出DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物两者的Dicer加工分析的结果。

图10示出柱状图数据，这些数据表明转染的DsiRNA-肽缀合物是保持体外效力的有效的基因沉默剂。在HeLa细胞中进行转染测定。图11展示了示例性DsiRNA-肽缀合物的血清稳定性，且指示了半衰期。图12示出柱状图数据，这些数据表明示例性DsiRNA-肽缀合物在不存在转染媒介物的情况下显示体外靶基因沉默功效，且随着DsiRNA-肽缀合物浓度不断增加观察到提高的递送。在HeLa细胞中进行测定。图13示出柱状图数据，这些数据表明在不存在转染媒介物的情况下示例性DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物体外敲低HepG2细胞中的靶基因。DsiRNA、DsiRNA-肽和肽以浓度为5 ii M施用。图14示出IC5tl曲线数据，这些数据说明在不存在转染媒介物的情况下示例性DsiRNA和DsiRNA-肽缀合物体外敲低H印G2细胞中的靶基因。还示出了测试试剂的示意图。发明详述本发明涉及含有包含肽的双链RNA(" dsRNA")的组合物，与不含如本文所述的肽的dsRNA分子相比，所述肽能够增强dsRNA的递送和/或生物分布或针对靶标的靶向并且能够增加其它功能和/或增强这种试剂的(例如)药代动力学或药效学。本发明还涉及制备包含肽的dsRNA的方法，所述包含肽的dsRNA能够在体内或体外降低基因的水平和/或表达。本发明提供新型dsRNA肽缀合物。本发明还提供用于使dsRNA靶向特定组织的新型dsRNA-肽缀合物。通过使靶向肽与目标组织或肿瘤上的表面标记高度特异性结合而进行本文所述的基于肽的靶向。这种肽结合特异性为本发明的dsRNA-肽缀合物提供使dsRNA以高度特异性、选择性且有效的方式靶向靶标的提高的能力，所述高度特异性、选择性且有效的方式有利于本领域已知的dsRNA革巴向方法或试剂。本发明提供以下优点。本发明提供增强本发明的dsRNA递送的递送肽。本发明提供接近中性或为中性的递送肽。例如，核酸与阳离子肽缀合。TAT (Tat48,)、穿膜肽(Antp43_58，寡聚精氨酸(R8，R9)等)为本领域已知的。不同于本发明的中性或接近中性的肽，由于核酸的聚阴离子性质，阳离子肽缀合物特别不利于dsRNA缀合。
本发明的肽还优于本领域已知的肽，因为本文所述的肽不需要通过可裂解的连接子与dsRNA连接而是可通过稳定的连接子与dsRNA缀合，因为dicer酶将加工本发明的dsRNA-肽以产生适于在RISC途径中加工的siRNA分子。这对药物组合物特别有利，因为稳定的连接子具有改进的稳定性(可裂解的连接子在制造和/或存储期间可裂解，由此丧失其功能)。定义本发明提供用于降低细胞中的靶基因表达的改进的组合物和方法，涉及以有效降低细胞中的靶基因表达的量使靶标与分离的dsRNA接触。本发明的dsRNA分子包含如本文中所定义的肽以提供dsRNA-肽缀合物。与不含有经过修饰的核苷酸模式的对应长度的dsRNA试剂相比，所述肽增强dsRNA的递送和/或生物分布或针对靶RNA的靶向并且增加其它功能，例如药代动力学或药效学。除非另外定义，否则本文中所使用的所有科技术语都具有本发明所属技术领域的专业人员通常所理解的含义。以下参考文献为技术人员提供本发明中所使用的许多术语的一般定义Singleton 等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第 2版，1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker 编，1988)；The Glossary of Genetics,第 5 版，R. Rieger 等(编)，Springer Verlag (1991);以及Hale&Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文所用，除非另外指明，否则以下术语具有下文对其所归结的含义。本发明的特征在于与根据本发明的一个或多个肽缀合的一个或多个dsRNA分子，和使用这些dsRNA分子来调节目标RNA或所编码蛋白质的水平的方法。本发明的dsRNA-肽可由dicer酶裂解并且可抑制靶RNA的表达。如本文所使用，“肽”包括“递送肽”和“靶向肽”。如本文所使用，“肽”是指直链肽、支链肽或环肽。本发明进一步涉及使用肽将dsRNA运输至所需祀标,例如，细胞或细胞上或细胞内的受体、所需祀组织或所需祀细胞。根据本发明，所需位点可为，例如但不限于脑、肾上腺或脑外部的其它位点(例如，颅外位点)，例如，肾脏、肝脏、胰腺、心脏、脾脏、肠胃(GI)道(例如，胃、肠、结肠)、眼、肺、皮肤、脂肪、肌肉、淋巴结、骨髓、泌尿和生殖系统(卵巢、乳房、睾丸、前列腺)、胎盘、血细胞及其组合。因此，所需祀标位点可为选自以下的一个或多个位点脑、肾上腺或脑外部的其它位点(例如，颅外位点)，例如，肾脏、肝脏、胰腺、心脏、脾脏、肠胃(GI)道(例如，胃、肠、结肠)、眼、肺、皮肤、脂肪、肌肉、淋巴结、骨髓、泌尿和生殖系统(卵巢、乳房、睾丸、前列腺)、胎盘、血细胞及其组合。“靶细胞”是指如本文中所定义的任何细胞，例如来源于或存在于任何器官中的细胞，所述器官包括但不限于脑、肾上腺或脑外部的其它位点(例如，颅外位点)，例如，肾脏、肝脏、胰腺、心脏、脾脏、肠胃(GI)道(例如，胃、肠、结肠)、眼、肺、皮肤、脂肪、肌肉、淋巴结、骨髓、泌尿和生殖系统(卵巢、乳房、睾丸、前列腺)、胎盘、血细胞及其组合。如本文所使用，“递送肽”是指中性或基 本上中性的肽。“基本上中性”是指带有+5或更少(例如，+5、+4、+3、+2、+1或0)的净电荷。根据本发明的“净电荷”由根据本领域已知的方法确定。例如，如本文中所定义的净电荷由获得阳离子氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)的总数的净电荷和阴离子氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的总数的净电荷的来确定。如本文所使用，“递送肽”是指至少6个氨基酸，其中肽带有约+5或更少(例如，+5、+4、+3、+2、+1或0)的净电荷。在一个方面，肽为6-100个氨基酸(例如，6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100)，且肽带有约 +5 或更少的净电荷。在另一个实施方案中，肽为10-50个氨基酸(例如，10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸)且带有约+5或更少的净电荷。在另一个实施方案中，肽为15-30个氨基酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个氨基酸)且带有约+5或更少的净电荷。根据本发明的“递送肽”包括为至少6个氨基酸且为中性的肽。在一个方面，肽为6-100 个氨基酸(例如，6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100)且不带有净电荷。在另一个实施方案中，肽为10-50个氨基酸(例如，10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸)且肽不带有净电荷。在另一个实施方案中，肽为 15-30 个氨基酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30氨基酸)且不带有净电荷。根据本发明的“递送肽”还指至少6个氨基酸且至多19个氨基酸的肽，其中肽带有约+5或更少(例如，+5、+4、+3、+2、+1或0)的净电荷。如本文所使用，“递送肽”是指至少6个氨基酸，其中肽带有约+5或更少(例如，+5、+4、+3、+3、+2、+1或0)的净电荷，且其中肽具有至少一个阴离子氨基酸。在一个方面，肽为 6-100 个氨基酸(例如，6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85,90,95或100)且带有约+4更少的净电荷。在另一个实施方案中，肽为10-50个氨基酸(例如，10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸)且带有约+5或更少的净电荷。在另一个实施方案中，肽为 15-30 个氨基酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸)且带有约+5或更少的净电荷。如本文所使用，“至少一个阴离子氨基酸”是指谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)中的至少一个。例如，XXXEXX或XXXDXX或XXDXEXX或XXXEDXX，其中X为任何氨基酸，其中肽带有+5或更少的净电荷。不带有净电荷的肽是指“中性肽”。
如本文所使用，“中性肽”在中性pH(例如，pH 6,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7、6. 8,6. 9、7、7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、8、8. 1、8. 2、8. 3、8. 4 或 8. 5)下带有
大约为0的净电荷。“中性肽”还包括在中性pH下带有大约为0的净电荷和/或在约pH 7(例如，pH6、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9、7、7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、
8、8.1、8. 2、8. 3、8. 4或8. 5)下具有等电点(pi)的肽。带正电荷的氨基酸为赖氨酸(Lys、K)、精氨酸(Arg、R)和组氨酸(His、H)。带负电荷的氨基酸为天冬氨酸或天冬氨酸根(Asp、D)、谷氨酸或谷氨酸根(Glu、E)。(参考Lehninger Principles of Biochemistry,第 3 版 ，2000 年，由 David L. Nelson 和 MichaelM.编，Cox, Worth Publisher, New York, NY)。根据本发明的“递送肽”为当与本发明的dsRNA缀合时可将dsRNA递送至合适的靶RNA的氨基酸序列。“递送肽”还指当dsRNA与肽缀合时可跨越细胞膜运输dsRNA的氨基酸序列。 与未与肽缀合的dsRNA相比，在肽与dsRNA缀合时，根据本发明有用的“递送肽”提高dsRNA向靶细胞的内化。与未与肽缀合的dsRNA相比，在肽与dsRNA缀合时，根据本发明有用的“递送肽”提高dsRNA向靶RNA的递送。如本文所使用，“提高”是指肽-dsRNA向靶RNA的递送是未与肽缀合的dsRNA的递送的 1、2、3、4、5、10、15、20、25、40、35、40、45、50、100、1000 或 10，000 倍或更多。如本文所使用，“提高”是指肽-dsRNA向靶标的递送比未与肽缀合的dsRNA的递送多 1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100%。由下文中所描述的内化分析或摄取分析来评估dsRNA、肽或dsRNA-肽缀合物的“递送”。在另一个实施方案中，如本文所使用的“肽”是指6-100个氨基酸(例如，6、7、8、
9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或 100)且与靶细胞结合
的“靶向肽”。当与如本文中所定义dsRNA缀合时，根据本发明的“靶向肽”与靶标或结合位点特异性地结合。如本文所使用，“特异性地结合”是指与目标受体的氢键结合或静电吸引。在一个方面，靶标为受体或受体结合蛋白。在一个方面,祀标或结合位点或者受体位于细胞表面上。在另一个方面，祀标或结合位点或者受体位于例如细胞中(例如，位于细胞质中、细胞核中或细胞核表面上)。在另一个方面，靶标或结合位点或受体裸露于溶液中。“特异性结合”是通过本领域已知且如本文中所定义的结合测定来确定(例如，参见US20080064092和US2009004174)。在一个实施方案中，特异性结合是通过比较dsRNA递送肽与所述的对应受体的结合和dsRNA-肽与其它受体的结合来确定，其中所有受体皆以混合物存在。如本文中所定义，与其它受体相比，与所述受体结合的提高指示特异性结合。
在一个实施方案中，特异性结合是通过比较dsRNA递送肽与所述细胞的结合与dsRNA-肽与其它细胞的结合来确定，其中所有细胞皆以混合物存在。如本文中所定义的，与其它细胞相比，与所述细胞结合的提高指示特异性结合。“特异性结合”是通过测定dsRNA-肽与溶液中裸露受体的结合而在体外确定或通过测定dsRNA-肽与细胞的结合而在体内确定。如本文所使用，“受体”包括细胞表面受体、溶液中的裸露受体和位于细胞内部(例如,位于细胞质中、细胞核中或细胞核表面上)的受体。如本文所使用，“受体结合蛋白”是指
如本文所使用的“靶向肽”可以进行以下中的至少一个当与dsRNA缀合时跨越细胞膜、当与根据本发明的dsRNA缀合时跨越细胞膜运输dsRNA和当与dsRNA缀合时结合配体的受体(例如，细胞表面受体)。在一个方面，使“靶向肽”与转位结构域或转位结构域的一部分(例如，神经毒素的转位结构域)缀合。如本文所使用，转位结构域是指有助于蛋白质的穿透和/或内化的氨基酸序列。如本文所使用，转位结构域的一部分是指足以维持所述功能的氨基酸序列，所述功能例如引导细胞进入或有助于细胞表面结合，例如，如本文中所定义的细胞表面受体结合。“转位结构域的一部分”还指完整氨基酸序列的I %或更多，例如1^5110120125%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或99%。在一个方面，靶向肽能够内化(例如，通过直接穿透或通过需要核内体形成的胞吞途径进行内化，并且也称为受体介导的胞吞作用)。dsRNA、肽或dsRNA-肽缀合物的“结合”是通过配体结合测定来评估。在一个实施方案中，对应受体的肽或dsRNA-肽缀合物的结合亲合力为约100 U M。在另一个实施方案中，对应受体的肽或dsRNA-肽缀合物的结合亲合力为约liiM。在另一个实施方案中，对应受体的肽或dsRNA-肽缀合物的结合亲合力为约100nM。在另一个实施方案中，对应受体的肽或dsRNA-肽缀合物的结合亲合力为约10nM。在另一个实施方案中，对应受体的肽或dsRNA-肽缀合物的结合亲合力为约5nM。在另一个实施方案中，对应受体的肽或dsRNA-肽缀合物的结合亲合力为约InM。在另一个实施方案中，对应受体的肽或dsRNA-肽缀合物的结合亲合力为约0. InM或更小。(Gauguin等，J Biol Chem. 2008 ；283 2604-2613 ;Grupping 等，Endocrinology 1997 ； 138 (10) :4064-4068 ;以及 Stone, Chervin和 Kranz, Immunology. 2009 年；126 (2) :165-76)。在一个实施方案中，“靶向肽”是指与靶细胞结合的6-100个氨基酸(例如，6、7、8、
9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸)，且包含
目标氨基酸序列的至少一部分，例如，靶肽的氨基酸序列。与未与肽缀合的dsRNA相比，在肽与dsRNA缀合时，根据本发明有用的肽提高dsRNA向细胞的靶向。如本文所使用，“提高”是指肽-dsRNA缀合物向细胞的靶向是未与肽缀合的dsRNA的靶向的 1、2、3、4、5、10、15、20、25、40、35、40、45、50、100、1000 或 10，000 倍或更多。如本文所使用，“提高”是指肽-dsRNA缀合物向细胞的靶向比未与肽缀合的dsRNA的靶向多 1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100%。如本文所使用，“提高”是指与未与肽缀合且为实现相当水平的结合、缔合或内化所需的相同dsRNA的量或剂量相比,肽-dsRNA缀合物向细胞的祀向(如下文所定义)需要更少dsRNA(较低剂量的dsRNA)，这由下文所述分析中的IC5tl来确定。例如，如体内或体外所测量，与未与肽缀合的相同dsRNA的IC5tl相比，实现RNA/基因表达的50%降低所需的dsRNA-肽缀合物的IC50有所下降(例如，参见Hefner等，J Biomol Tech. 2008年9月19 (4) 231-237 ;Zimmermann 等，Nature. 2006 年 5 月 4 日441(7089) :111-114 ;Durcan 等，Mol Pharm. 2008 年 7-8 月；5(4) :559-566 ；Heidel 等，Proc Natl Acad Sci U SA. 2007 年4 月 3 日:104(14) :5715-5721)。如本文所使用，“下降”是指dsRNA-肽缀合物的IC5tl为未与肽缀合的相同dsRNA 的 IC5tl 的 I、1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/25、1/40、1/35、1/40、1/45、1/50、1/100、1/1000 或 1/10,000 或更小。如本文所使用，“下降”是指dsRNA-肽缀合物的IC5tl比未与肽缀合的相同dsRNA的 IC50 小 I 5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100%。在一个实施方案中，与单独的dsRNA相比，dsRNA-肽缀合物增加的靶向由结合系数Kd表示，其为约25%。在另一个实施方案中，与单独的dsRNA相比，dsRNA-肽缀合物的增加靶向为约100%，S卩，与单独的dsRNA相比，dsRNA-肽缀合物在结合亲合力方面显示出约I倍的增加(即，下降的Kd)。在另一个实施方案中，与单独的dsRNA相比，dsRNA-肽缀合物在结合亲合力方面显示出约4倍的增加。在另一个实施方案中，与单独的dsiRNA相比，dsRNA-肽缀合物在结合亲合力方面显示出约9倍的增加。在另一个实施方案中，与单独的dsRNA相比，dsRNA-肽缀合物在结合亲合力方面显示出约99倍的增加。在另一个实施方案中，与单独的dsRNA相比，dsRNA-肽缀合物在结合亲合力方面显示出约999倍或更多倍的增加。“结合”是通过本领域已知且如本文中所定义的结合测定来确定。在一个实施方案中，结合是通过测定dsRNA递送肽与所述受体的结合来确定。在另一个实施方案中，结合是通过测定dsRNA递送肽与所述细胞的结合来确定，其中所有细胞皆以混合物存在。“结合”是通过测定dsRNA-肽与溶液中裸露受体的结合而在体外确定或通过测定dsRNA-肽与细胞的结合而在体内确定。如本文所使用，“靶向”是指与受体混合物中的另一个受体相比，dsRNA肽缀合物与目标受体的优先或特异性结合或缔合或内化。如本文所使用，“靶向”涵盖与细胞混合物中细胞上的另一个受体相比，dsRNA肽缀合物与细胞上的目标受体的优先或特异性结合或缔合或内化。如本文所使用，“靶向”涵盖与细胞混合物中的另一个细胞相比，dsRNA肽缀合物与细胞的优先或特异性结合或缔合或内化。也就是说，根据本发明的“靶向”是在体外和体内确定或测量。“靶向”还指本发明的“肽”向细胞上合适的结合位点的运输或递送，例如，如果肽为配体，那么靶向是指肽向配体的合适受体、结合蛋白或粘附蛋白的递送。
根据本发明的肽可以连接到本发明的dsRNA的第一链的5'或3'端或第二链的5'或3'端，或者连接到第一链的5'端和第二链的5'端，连接到第一链的5'端和第二链的3'端，连接到第一链的3'端和第二链的5'端或连接到第一链的3'端和第二链的3/端。根据本发明的肽还可以例如通过氨基酸残基上的特定官能团(例如，Cys上的-SH基或Lys的氨基)在内部连接到第一链和/或第二链。在一个方面，一个以上的肽(例如，二聚体、三聚体或多聚体)连接到dsRNA。如本文所使用，“二聚体”是指两个以任何结构(例如通过羧基和氨基末端线性地或通过每个肽的氨基酸之间的共价键平行地)定向的彼此缀合的肽，且其中两个肽中的一个还与dsRNA缀合。二聚体还指其中每一个肽与dsRNA上的唯一位点缀合的两个肽。如本文所使用，“三聚体”是指三个彼此缀合的肽，且其中三个肽中的一个与dsRNA缀合。三聚体还指其中每一个肽与dsRNA上的唯一位点缀合的三个肽。三聚体还指其中三 个肽中的两个肽彼此缀合且其中两个肽中的一个肽还与dsRNA缀合且第三个肽与dsRNA上的唯一位点缀合的三个肽。如本文所使用，“多聚体”是指多于I个肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。
本发明提供与多个肽缀合的dsRNA，其中肽具有相同的或不同的序列。在一个实施方案中，多个肽是指一个或多个递送肽和一个或多个靶向肽。术语“肽”包含有限数量的连续氨基酸，所述氨基酸是结合在一起的肽；并且所述术语“肽”包含如本文中所定义的靶向肽或递送肽，不管所述肽是天然的分子还是合成的(即，天然的分子，或其经化学/物理修饰的变体)，所述靶向肽或递送肽能够递送dsRNA和/或与肽靶标(例如，细胞或细胞上的受体)结合。如本文所使用的“肽”可以源自天然的蛋白质。如本文所使用的“肽”可以包含不同的蛋白质结构域(例如，嵌合肽)。如本文所使用的“肽”可以是基于特定氨基酸序列的结构功能关系而设计的合成肽，且不必与天然序列具有同源性。本发明的肽与本发明的dsRNA缀合。如本文所使用，缀合是指通过本领域已知的任何共价或非共价缔合进行连接。可以通过肽中的任何氨基酸残基将本发明的肽与本发明的dsRNA缀合，例如，通过C端氨基酸的羧基与C端的C端氨基酸缀合、或通过N端氨基酸的a -氨基与N端的N端氨基酸缀合或者与氨基酸残基上的特定官能团(例如，Cys上的-SH基或Lys的氨基)缀
八
口 o可以通过肽序列中的任何氨基酸残基(例如，通过肽序列中间的赖氨酸残基的氨基)将本发明的肽与本发明的dsRNA缀合。可以通过稳定的共价键(包括但不限于零长度连接子、同型双功能连接子、异型双功能连接子或三功能连接子)，将根据本发明的肽与本发明的dsRNA缀合(参考Bioconjugate Techniques，1996，Greg T. Hermanson, Academic Press，San Diego, CA.；Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking,1991,Shan S. Wong,CRC Press，Boca Raton, FL)。如本文所使用，“零长度连接子”是指通过反应进行缀合，其中在无连接子的情况下使反应物(例如，dsRNA上的反应基团和肽上的官能团，例如氨基酸侧链上的活性基团、端氨基酸残基的自由氨基和自由羧基等)缩合以形成缀合分子。例如，通过将肽的端反应物与dsRNA的端反应物反应，形成“零长度连接子”。零长度连接的实例包括但不限于二硫化物、酰胺、酯、硫酯等。如本文所使用，“同型双功能连接子”是指与具有两个类似官能团的连接子的缀合。同型双功能连接子的实例包括但不限于氨基定向的、羧基定向的、巯基定向的等。如本文所使用，“异型双功能连接子”是指与具有两个不同特异性的不同官能团的连接子缀合。异型双功能连接子的实例包括但不限于氨基和巯基定向的、氨基和羧基定向的、羧基和巯基定向的组合等。如本文所使用，“三功能连接子”是指与具有三个反应官能团的连接子的缀合。三功能连接子的实例包括但不限于4-叠氮基-2-硝基苯基生物胞素-4-硝基苯酯(ABNP)、磺 酰琥珀酰亚胺基-2-[6-(生物素胺)-2-(p-叠氮苯甲酰氨基)己酰氨基]乙基_1，3' -二硫代丙酸酯(sulfo-SBED)，其它基于生物胞素的分子等。还可以通过可裂解的连接子(包括但不限于二硫化物、酯、乙二醇、重氮和砜连接子)使根据本发明的肽与dsRNA缀合。通过碳连接子使根据本发明的肽可以与dsRNA缀合，所述碳连接子是例如一个或多个碳(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个碳)的碳连接子。可以使用辅基使根据本发明的肽与dsRNA缀合。辅基包括但不限于金属离子、口卜啉基、辅酶和其它非肽基部分，例如，碳水化合物或寡聚糖(Wong，S. S. (1991)，Chemistryof protein conjugation and cross-linking, CRC Press)。在一个实施方案中，通过表达为融合构建体使肽与dsRNA缀合。可通过为本领域技术人员所熟知的任何常规化学缀合技术，将“肽”连接到dsRNA。在这点上，参考 Hermanson, G. T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press,和参考 Wong, S. S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRCPress。可通过离子相互作用使“肽”与dsRNA非共价缀合。如本文所使用，“肽-dsRNA缀合物”是指通过某种方法(包括但不限于本文所述的连接/缀合方法)与dsRNA缀合的肽。在一个方面，肽-dsRNA缀合物还包含一个或多个染料分子。如本文所使用，“染料分子”包括但不限于聚芳烃染料或荧光染料，例如Cy3、Cy5,Cy5. 5、Alexa Fluor (例如，Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 647 等)。在一个方面，如本文中所定义，肽-dsRNA缀合物还包含递送肽。在一个方面，肽-dsRNA缀合物还包含治疗剂，例如抗癌剂或治疗代谢疾病或病症的试剂。抗癌剂包括但不限于抗病毒剂(Fiume等，FEBS Lett. 1983 ; 153 (I) :6-10)、顺钼(Mukhopadhyay S 等,Bioconjug Chem. 2008 ； 19 (I) :39-49)、阿霉素(Guan H 等,BioconjugChem. 2008 ； 19 (9) :1813-21)、紫杉醇(Dubikovskaya EA 等，Proc Natl Acad Sci U SA. 2008 ； 105 (34) :12128-33, Regina A 等，Br J Pharmacol. 2008 ; 155 (2) :185-97)、三苯氧胺(Rickert 等,Biomacromolecules. 2007 ；8 (11) :3608-3612)和长春喊(DeFeo-Jones D等，Mol Cancer Ther. 2002 ；1(7) :451-459)。包含与肽-dsRNA缀合物组合的治疗剂的组合物可分别包括I : 10，000至I : I至10，000 I的试剂/缀合物比率，例如I : 5000至 5000 1、1 1000 至 1000 1、1 100 至 100 1、1 10 至 10 1，基于分子量、摩
尔或实际重量。“肽-dsRNA缀合物”是指其中所述肽和所述dsRNA保持它们功能的分子。如本文所使用，“下降”(例如，dsRNA-肽缀合物的起效时间减少或dsRNA-肽缀合物的递送速率下降)是指dsRNA-肽缀合物的起效时间或递送速率为 与肽缀合的相同 dsRNA 的起效时间或递送速率的 1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/25、1/40、1/35、1/40、1/45、1/50、1/100、1/1000 或 1/10，000 或更低。如本文所使用，“下降”(例如，dsRNA-肽缀合物的起效时间减少或dsRNA-肽缀合物的递送速率下降)是指dsRNA-肽缀合物的起效时间或递送速率比未与肽缀合的相同dsRNA的起效时间或递送速率降低1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100%。如本文所使用，“起效时间”是指体外(例如，向细胞或向组织培养基)或体内(例如，向人或动物(例如，小鼠或大鼠)受治疗者)施用dsRNA与dsRNA到达靶RNA之间的时间段。如本文所使用，“递送速率”是指在施用dsRNA之后dsRNA到达靶RNA所需的时间。如本文所使用，“作用持续时间”是指dsRNA抑制靶RNA表达的时间段。如本文所使用，“对照”或“参照”(例如，对照dsRNA)是指在长度上与对特定靶RNA (测试dsRNA)特异的dsRNA相当但对特定靶RNA非特异的dsRNA。对照RNA具有与对目标靶标特异的dsRNA不相同的核苷酸序列。对照(例如，对照肽)是指长度和电荷中的一个或多个与和对靶RNA特异的dsRNA缀合的肽(测试肽)相当，但具有与和对靶RNA特异的dsRNA缀合的肽(测试肽)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。对照(例如，对照dsRNA-肽缀合物)是指其中dsRNA在长度上与对特定靶RNA特异的dsRNA相当，但对特定靶RNA非特异的dsRNA的dsRNA-肽缀合物。对照dsRNA-肽缀合物还指其中所述肽在长度和电荷中的一个或多个上与和对靶RNA特异的dsRNA缀合的肽相当但具有与和对靶RNA特异的dsRNA缀合的肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列的dsRNA-肽缀合物。对照dsRNA-肽缀合物还指其中所述肽在长度和电荷中的一个或多个上与和对靶RNA特异的dsRNA缀合的肽相当但具有与和对靶RNA特异的dsRNA缀合的肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且其中dsRNA在长度上与对特定靶RNA特异的dsRNA相当但对特定靶RNA非特异的dsRNA的dsRNA-肽缀合物。如本文所使用，测试肽或测试dsRNA是指包含降低根据本发明的靶RNA表达的缀合物的肽或dsRNA。测试dsRNA是指降低根据本发明的靶RNA的表达的dsRNA。“测试” dsRNA-肽缀合物包含与测试肽缀合的测试dsRNA。如本文所使用，术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或经过修饰的核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经过修饰的骨架残基或键联的核酸，这些核酸为合成的、天然的和非天然的，具有与参照核酸类似的结合特性，而且按照与参照核苷酸类似的方式代谢。这些类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核苷酸(PNA)。
如本领域中所公认的，如本文所使用的“核苷酸”用于包括具有本领域熟知的天然碱基(标准)和经过修饰的碱基的那些核苷酸。这些碱基通常位于核苷酸糖部分的I'位。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸基。核苷酸可以在糖、磷酸和/或碱基部分处未经修饰或经过修饰，(还可替换地称为核苷酸类似物、经过修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；例如参见Usman和McSwiggen,同上文；Eckstein等，国际PCT公开第WO 92/07065号；Usman等，国际PCT公开第WO 93/15187号；Uhlman&Peyman,同上文,全部在此以引用的方式并入本文)。存在本领域已知的经过修饰的核酸碱基的若干个实例，如Limbach等于Nucleic Acids Res. 22 :2183,1994中所概述。可被引入核酸分子的碱基修饰的一些非限制性实例包括次黄嘌呤、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5_卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基11密唆(例如，6-甲基尿苷)、丙块等(Burgin 等，Biochemistry 35 14090,1996 ;UhIman 和Peyman，同上文)。在这方面，“经过修饰的碱基”是指位于I'位除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷酸碱基或其等效物。 如本文所使用，“经过修饰的核苷酸”是指对核苷、核苷碱基、戊糖环或磷酸基进行一种或多种修饰的核苷酸。例如，经过修饰的核苷酸不包括含有单磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、单磷酸尿苷和单磷酸胞苷的核糖核苷酸以及含有单磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧胸苷和单磷酸脱氧胞苷的脱氧核糖核苷酸。修饰包括由修饰核苷酸的酶(诸如，甲基转移酶)修饰产生的天然修饰。经过修饰的核苷酸还包括合成的核苷酸或非天然的核苷酸。核苷酸中合成修饰或非天然的修饰包括具有2'修饰的那些修饰或包含碱基类似物的那些修饰，所述2'修饰例如2' -0-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、
21 _烯丙基、2' -0-[2_ (甲氨氨基)-2-氧代乙基]、4 ' _硫代、4' -CH2-CH' _桥、4/ _(CH2)2-0-2'-桥、2' -LNA和'_0_(N-甲基氨基甲酸酯)。关于本公开所描述的与2'修饰核苷酸，“氨基”是指可经修饰或未经修饰的2' -NH2或2' -O-NH2。这类经过修饰的基团描述于例如Eckstein等美国专利第5，672, 695号和Matulic-Adamic等美国专利第6，248，878 号中。关于本公开的核酸分子，修饰可根据这些试剂的模式而存在于dsRNA的一条链或两条链上。如本文所使用，“交替位置”是指其中每隔一个核苷酸有一个经过修饰的核苷酸或在确定长度的dsRNA链上的每个经过修饰的核苷酸之间存在未经修饰的核苷酸(例如，未经修饰的核糖核苷酸)的模式(例如，5' -MNMNMN-3' ；3/ -MNMNMN-5';其中M为经过修饰的核苷酸而N为未经修饰的核苷酸)。在某些实施方案中，根据本文所述的任何位置编号规定，修饰模式从位于5'或3'端处的第一核苷酸开始，(在某些实施方案中，参照本发明的DsiRNA试剂预计的Dicer裂解事件之后链的末端残基指定位置1，因此，位置I并不总是构成本发明的预加工试剂的3'端或5'端残基)。在其它实施方案中，参照与相反链的5'或3'端互补的第一或第二链的核苷酸残基指定位置I。例如，在某些实施方案中，位置I为与第一寡核苷酸链的5'端核苷酸残基互补的第二链的核苷酸残基。本发明涵盖其中修饰模式从5'或3'端(根据本文所述的任何位置编号规定)开始于位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 中的任何一个位置的dsRNA。本发明还涵盖其中修饰模式从5'或3'端残基开始于为至少一个核苷酸的任何位置的dsRNA。处于交替位置的经过修饰的核苷酸的模式可贯穿链的全长，但是在某些实施方案中，所述模式分别包括含有至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或更多个经过修饰的核苷酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 、27、28 个或更多个核苷酸。如本文所使用，“交替位置对”是指其中在确定长度的dsRNA链上两个连续的经过修饰的核苷酸由两个连续的未经修饰核苷酸分隔开的模式(例如，5' -MMNNMMNNMMNN-3/ ；3' -MMNNMMNNMMNN-5/ ;其中M为经过修饰的核苷酸并且N为未经修饰的核苷酸)。在一个实施方案中，根据本文所述的任何位置编号规定，修饰模式从5'端或3'端的第一核苷酸位置开始。处于交替位置的经过修饰的核苷酸的模式可能贯穿链的全长，但优选地，所述模式分别包括含有至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 个经过修饰的核苷酸的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个核苷酸。应强调的是，上述修饰模式为示例性的而不打算限制本发明的范围。如本文所使用，“碱基类似物”是指位于可并入核酸双链体的经过修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的位置I'(或可并入核酸双链体的核苷酸糖部分取代中的等效位置)的杂环部分。在本发明的dsRNA中，碱基类似物通常为嘌呤或者嘧啶碱基，不包括常见碱基鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。碱基类似物可与dsRNA中的其它碱基或碱基类似物形成双链体。碱基类似物包括可用于本发明的化合物和方法的碱基类似物，例如在Benner的美国专利第5，432，272号和第6，001, 983号和Manoharan的美国专利公开第20080213891号中所公开的碱基类似物，其以引用的方式并入本文。碱基的非限制性实例包括次黄嘌呤(I)、黄嘌呤(X) >3 ^-D-呋喃核糖基-(2，6_ 二氨基嘧啶)(K)、3-P-D-呋喃核糖基-(I-甲基-吡唑并[4，3-d]嘧啶-5，7(4H，6H)_ 二酮)(P)、异胞嘧啶(iS0-C)、异鸟嘌呤(iS0-G)、I- P -D-呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、I- P -D-呋喃核糖基-(3-硝基吡咯)、5_溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、4-硫代-dT、7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)、2_氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(S)、2-氧代吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异喹诺酮基、5-甲基异喹诺酮基和3-甲基-7-丙炔基异喹诺酮基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-丙炔基异喹诺酮基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2，4，5_三甲苯基、4-甲基吲哚基、4，6_ 二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基及其结构衍生物(Schweitzer等，J. Org. Chem. ,59:7238-7242(1994) ；Bergerr 等，Nucleic Acids Research, 28 (15)2911-2914(2000) ；Moran 等，J. Am. Chem. Soc. , 119 :2056-2057(1997) !Morales 等，J. Am.Chem. Soc.，121 :2323-2324(1999) ；Guckian 等，J. Am. Chem. Soc. , 118 :8182-8183(1996)；Morales 等，J. Am. Chem. Soc. , 122 (6) 1001-1007 (2000) ；McMinn 等，J. Am. Chem. Soc.,121 :11585-11586(1999) ；Guckian 等，J. Org. Chem. ,63 :9652-9656(1998) ；Moran 等，Proc. Natl. Acad. Sci. , 94 10506-10511 (1997) ；Das 等，J. Chem. Soc. , Perkin Trans.,I :197-206 (2002) Shibata 等，J. Chem. Soc.，Perkin Trans.，I 1605-1611 (2001)；Wu 等，J. Am. Chem. Soc. , 122(32) :7621-7632(2000) ；0 ' Neill 等，J. Org. Chem. , 67 5869-5875(2002) ；Chaudhuri 等，J. Am. Chem. Soc. , 117 :10434-10442(1995);以及美国专利第6，218，108号)。碱基类似物还可为通用碱基。如本文所使用，“通用碱基”是指位于经过修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的位置I'或位于核苷酸糖部分取代中的等效位置的杂环部分，当存在于核酸双链体中时，所述杂环部分可在不改变双螺旋结构(例如，磷酸骨架的结构)的情况下与一种以上碱基相对定位。另外，通用碱基不会破坏其所位于的单链核酸与靶核酸形成双链体的能力。可通过本领域技术人员来说显而易见的方法(例如，紫外吸光度法、圆二色谱法、凝胶迁移法、单链核酸酶敏感性法等)测定含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体的能力。另外，可改变能观察双链体形成的条件(例如，温度)以确定双链体稳定性或形成，因为解链温度(Tm)与核酸双链体的稳定性相关。相较于与靶核酸精确互补的参照单链核酸，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成的双链体的Tm低于与互补核酸形成的双链体的Tm。然而，与其中通用碱基被碱基置换而产生单一错配的参照单链核酸相比较，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成的双链体的Tm高于与具有错配碱基的核酸形成的双链体的Tm。一些通用碱基能够通过在碱基对形成条件下在通用碱基与全部碱基鸟嘌呤(G)、 胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)之间形成氢键来进行碱基配对。通用碱基不是仅与单一的互补碱基形成碱基对的碱基。在双链体中，通用碱基可与双链体的相对链上与所述通用碱基相对的G、C、A、T和U中的每一个不形成氢键、形成一个氢键或多于一个氢键。优选地，通用碱基不会与双链体的相对链上与所述通用碱基相对的碱基相互作用。在双链体中，在通用碱基之间进行碱基配对而不改变磷酸骨架的双螺旋结构。通用碱基还可通过堆积相互作用与相同核酸链上的相邻核苷酸中的碱基相互作用。这种堆积相互作用使双链体稳定，特别是在通用碱基不会与双链体的相对链上位于与所述通用碱基相对的碱基形成任何氢键的情况下。通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、I-P-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或I- P -D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(Quay等的美国专利申请公开第20070254362 号；Van Aerschot 等，An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogueas ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 年 11 月 11 日；23(21) :4363-70;Loakes等，3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNAsequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 年 7 月 11 日；23(13) :2361-6 ;Loakes和Brown,5-Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res. 1994 年 10月 11 日；22(20) :4039-43)。如本文所使用，“环”是指由核酸的单一链形成的结构，其中位于特定单链核苷酸区侧面的互补区以互补区之间的单链核苷酸区不能进行双链体形成或Watson-Crick碱基配对的方式杂交。环为任何长度的单链核苷酸区。环的实例包括存在于诸如发夹结构、茎环或延伸环等结构中的未配对核苷酸。如本文所使用，在dsRNA的情况下“延伸环”是指单链环以及位于环侧面的另外I、2、3、4、5、6或多达20个碱基对或双链体。在延伸环中，位于5'侧上的环侧面的核苷酸与位于3'侧上的环侧面的核苷酸形成双链体。延伸环可形成发夹或茎环。如本文所使用，在dsRNA的情况下“四核苷酸环”是指由四个核苷酸组成的环(单链区)，所述环形成稳定的二级结构，所述二级结构有助于邻接的Watson-Crick杂交核苷酸的稳定性。在不受理论束缚的情况下，四核苷酸环可通过堆积相互作用使邻接的Watson-Crick碱基对稳定。另外，在四核苷酸环中的四个核苷酸间的相互作用包括但不限于非Watson-Crick碱基配对、堆积相互作用、氢键和接触相互作用(Cheong等，Nature 1990 年 8 月 16 日；346(6285) :680-2 ;Heus 和 Pardi，Science 1991 年 7 月 12 日；253(5016) :191-4)。四核苷酸环使邻接双链体的解链温度(Tm)升高，其高于根据由四个随机碱基组成的简单模型环序列所预期的解链温度(Tm)。例如，四核苷酸环可赋予包含长度至少为2个碱基对的双链体的发夹结构在IOmM NaHPO4中至少55°C的解链温度。四核苷酸环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸及其组合。RNA四核苷酸环的实例包括=UNCG家族四核苷酸环(例如，UUCG)、GNRA家族四核苷酸环(例如，GAAA)和CUUG 四核苷酸环。(Woese 等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990 年 11 月；87(21) :8467-71 ；Antao 等，Nucleic Acids Res. 1990 年 11 月 11 日；19(21) :5901-5)。DNA 四核苷酸环的实例包括d(GNNA)家族四核苷酸环(例如，d(GTTA)), d(GNNA)家族四核苷酸环、d(GNAB)家族四核苷酸环、d(CNNG)家族的四核苷酸环、d(TNCG)家族的四核苷酸环(例如，d(TTCG))。(Nakano 等，Biochemistry, 41 (48)，14281-14292, 2002 ；SHINJI 等，Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, H 78 卷；第 2 期；第 731 页(2000))。本发明的dsRNA组合物由于它们经塑造像Dicer酶的底物那样进入RNAi路径，至少部分地归因于此类组合物的链长度，所以本文中也称为Dicer底物siRNA (“DsiRNA”)试齐U。本发明的“DsiRNA试剂”组合物包含作为用于Dicer酶加工的前体分子的dsRNA，即，在体内加工本发明的DsiRNA以产生活性siRNA。具体来说，通过Dicer将DsiRNA加工成并入RISC中的活性siRNA。在本文中主要称为“DsiRNA试剂”或“DsiRNA分子”的这个前体分子在本文中还可以被称为前体RNAi分子。如本文所使用，术语“活性siRNA”指双链核酸，其中每一条链包含RNA、RNA类似物或RNA和DNA。siRNA包含19至23个核苷酸或包含21个核苷酸。活性siRNA通常在每一条链的3'端上具有2bp突出，以便siRNA中的双链体区包含17至21个核苷酸，或19个核苷酸。在某些实施方案中，本发明的dsRNA包括但不限于包含第一链和第二链的dsRNA，所述第一链和所述第二链在长度上包含16至50、19至35、19至24、25至30、25至35、26至30、21至23个核苷酸。本发明的DsiRNA试剂具有足够长度以便DsiRNA试剂通过Dicer加工来产生siRNA。因此，合适的DsiRNA试剂含有一个寡核苷酸序列(第一序列)，所述寡核苷酸序列的长度为至少25个核苷酸且不超过约35个核苷酸。RNA的此序列的长度可以为约26至35,26至34、26至33、26至32、26至31、26至30和26至29个核苷酸。此序列的长度可以为约27或28个核苷酸或者为27个核苷酸。DsiRNA试剂的第二序列可以为在生物条件下(例如，在真核细胞的细胞质内)与第一序列退火的任何序列。通常，第二寡核苷酸序列将具有至少19个与第一寡核苷酸序列互补的碱基对，更通常地，第二寡核苷酸序列将具有约21个或更多个、或约25个或更多个与第一寡核苷酸序列互补的碱基对。在一个实施方案中，第二序列与第一序列长度相同，且DsiRNA试剂为平端。在另一个实施方案中，DsiRNA试剂的末端具有一个或多个突出。在某些实施方案中，其中第二序列与第一序列长度相同，所述第一链的所述3'端的最后一个残基与所述第二链的所述5'端的最后一个残基形成错配碱基对。在其它实施方案中，其中第二序列与第一序列长度相同，所述第一链的5'端的最后一个残基与第二链的3'端的最后一个残基形成错配碱基对。在其它实施方案中，其中第二序列与第一序列长度相同，第一链的3'端的最后一个残基和倒数第二个残基与第二链的5'端的最后一个残基和倒数第二个残基形成两个错配碱基对。在其它实施方案中，其中第二序列与第一序列长度相同，第一链的5'端的最后一个残基和倒数第二个残基与第二链的3'端的最后一个残基和倒数第二个残基形成两个错配碱基对。在某些实施方案中，DsiRNA试剂的第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列存在于单独的寡核苷酸链上，所述单独的寡核苷酸链可以是且通常是化学合成的。在一些实施方案中，两条链的长度为26至35个核苷酸。在其它实施方案中，两条链的长度为25至30个或26至30个核苷酸。在一个实施方案中，两条链的长度为27个核苷酸,完全互补且具有平端。在一个实施方案中，一条或两条寡核苷酸链能够用作Dicer的底物。在其它实施方案中，存在至少一种修饰，其促进Dicer按照使双链RNA结构抑制基因表达的功效最大的定向结合于双链RNA结构。在本发明的某·些实施方案中，DsiRNA试剂由两条不同长度的寡核苷酸链组成，其中DsiRNA在第一链(有义链)的3'端处具有平端且在第二链(反义链)的3'端处具有3'突出。DsiRNA还可以含有一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)碱基取代。含有两个单独寡核苷酸的合适DsiRNA组合物可以通过化学连接基团以化学方式在它们的退火区的外部连接。本领域已知且可使用许多合适的化学连接基团。合适的基团将不会阻断Dicer对DsiRNA的活性并且不会干扰由靶基因转录的RNA的定向破坏。或者，两个单独的寡核苷酸可以通过第三个寡核苷酸连接，以便在组成DsiRNA组合物的两个寡核苷酸退火之后产生发夹结构。发夹结构将不会阻断Dicer对DsiRNA的活性且将不会干扰靶RNA的定向破坏。如本文所使用，具有与靶RNA或cDNA序列“充分互补”的序列的dsRNA(例如，DsiRNA或siRNA)是指具有足以通过RNAi机构(例如，RISC复合物)或过程引起的靶RNA(其中已叙述了 cDNA序列，RNA序列对应于所述cDNA序列)破坏的序列的dsRNA。可设计dsRNA分子以便使反义链中的每个残基与靶分子中的残基互补。或者，可在分子内进行取代以增加所述分子的稳定性和/或增强所述分子的加工活性。可在链内进行取代，或可对链的末端残基进行取代。在某些实施方案中，在DsiRNA试剂内的特定残基处进行取代和/或修饰。这类取代和/或修饰可包括，例如，当从DsiRNA试剂的有义链的3'端位置编号时，在位置1、2和3的一个或多个残基处进行的脱氧修饰；当从DsiRNA试剂的反义链的5'端位置编号时在位置1、2、3或4的一个或多个残基处进行的脱氧修饰；以及在DsiRNA试剂的反义链的3'端残基处进行引入'-0-烷基(例如，2' -0-甲基)修饰，其中这类修饰同样地或可选地存在于反义链的3'部分的突出位置处和/或存在于DsiRNA试剂各处，例如，存在于DsiRNA试剂的加工形成活性siRNA试剂的区内包括的DsiRNA反义链的交替残基或成对残基处。前面的修饰是作为示例而提供的，而不打算以任何方式加以限制。在下文中可发现有关优选的DsiRNA试剂的结构的进一步考虑，包括可对本发明的DsiRNA试剂实施的修饰和取代的进一步描述。所谓“互补”是指核酸可与另一个核酸序列通过传统的Watson-Crick或其它非传统形式形成氢键。关于本发明的核酸分子，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以使核酸履行相关功能，例如，RNAi活性。测定核酸分子的结合自由能是本领域熟知的(例如，参见 Turner 等，1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII,第 123-133 页；Frier 等，1986, Proc. Nat.Acad. Sci. USA 83 :9373-9377 ;Turner 等，1987，J. Am. Chem. Soc. 109 :3783-3785)。互补百分比指示某一核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分率(例如，第一寡核苷酸中总共10个核苷酸之中有5、6、7、8、9或10个核苷酸与具有10个核苷酸的第二核酸序列碱基配对分别代表50 %、60 %、70 %、80 %、90 %和100%互补)。“完全互补”是指某一核酸序列中的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。在一个实施方案中，本发明的DsiRNA分子包含与一个或多个靶核酸分子或其一部分互补的约19至约30个(例如，约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或者更多个)核苷酸。短语“双链体区”是指两个互补或者基本上互补的寡核苷酸中的区，所述寡核苷酸通过Watson-Crick碱基配对或允许互补或基本上互补的寡核苷酸链之间的形成双链体的任何其它方式彼此形成碱基对。例如，具有21个核苷酸单位的寡核苷酸链可以与具有21个核苷酸单位的另一个寡核苷酸碱基配对，但每一个链上仅19个碱基互补或基本上互补，以使“双链体区”由19个碱基对组成。剩余碱基对可例如作为5'和3'突出存在。此外，在双链体区内，不需要100%互补；在双链体区内容许基本上互补。
基本上互补是指链之间的互补以使其能够在生物条件下退火。凭经验确定两个链是否能够在生物条件下退火的技术是本领域熟知的。或者，可以在生物条件下将两个链合成且加在一起，以确定两个链是否彼此退火。单链核酸在若干碱基进行碱基配对被称为“杂交”。杂交通常在生理学上或生物学上相关的条件(例如，细胞内pH 7.2，140禮钾离子；细胞外袖7.4，1451111钠离子)下确定。杂交条件通常含有一价阳离子和生物学上可接受的缓冲液，且所述杂交条件可以含有或可以不含有二阶阳离子、络合阴离子(例如，来自葡糖酸钾的葡糖酸根)、不带电的物质(诸如，蔗糖)和降低样品水的活性的惰性聚合物(例如，PEG)中。这类条件包括可以形成喊基对的条件。通过解离形成双链体的单链核酸所需的温度(即解链温度；Tm)度量杂交。杂交条件也是可以形成碱基对的条件。可使用各种严格条件以测定杂交(例如，参见Wahl，G.M.和S.L. Berger(1987)Methods Enzymol. 152 :399 ；Kimmel,A. R. (1987)Methods EnzymoI. 152 507)。严格的温度条件通常将包括至少约30°C，更优选地至少约37°C，且最优选地至少约42°C的温度。长度预期为小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应比该杂交物的解链温度(Tm)低5至10°C，其中根据以下等式确定Tm。对长度小于18个碱基对的杂交物来说，Tm (°C ) = 2 (A+T碱基的数量)+4 (G+C碱基的数量)。对长度为18至49个碱基对的杂交物来说，Tm(°C ) = 81. 5+16. 6 (IoglO [Na+] )+0. 41 (% G+C) - (600/N)，其中 N 是杂交体中的碱基数目，且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于lXSSC[Na+]为0. 165M)。例如，在表I中示出杂交测定缓冲液。表I.
权利要求
1.一种分离的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，其包含具有5'端和3'端的第一寡核苷酸链和具有5'端和3'端的第二寡核苷酸链，其中所述第一链和所述第二链的长度为至少16个和至多50个核苷酸，其中所述肽与所述dsRNA缀合并且其中所述dsRNA-肽缀合物与靶标结合。
2.一种分离的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，其包含具有5'端和3'端的第一寡核苷酸链和具有5'端和3'端的第二寡核苷酸链，其中所述第一链和所述第二链的长度为至少16个和至多50个核苷酸，其中所述肽与所述dsRNA缀合，其中所述dsRNA-肽缀合物被靶细胞内化。
3.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链和所述第二链的长度为至少25个和至多35个核苷酸、至少19个和至多35个核苷酸、至少19个和至多24个核苷酸、至少25个和至多30个核苷酸、至少26个和至多30个核苷酸或至少21个和至多23个核苷酸。
4.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第二链在3'端包含突出。
5.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链在3'端包含突出。
6.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第二链和所述第一链中的至少一个在3'端包含突出。
7.如权利要求6所述的分离的组合物，其中所述第一链和/或第二链的所述3'突出的所述核苷酸包括经过修饰的核苷酸。
8.如权利要求6所述的分离的组合物，其中所述3'突出的长度为I至5个核苷酸。
9.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链和所述第二链中的每一条链由相同数目的核苷酸残基组成。
10.如权利要求9所述的分离的组合物，其中所述第一链的所述5'端的最后一个残基与所述第二链的所述3'端的最后一个残基形成错配碱基对。
11.如权利要求9所述的分离的组合物，其中所述第一链的所述3'端的所述最后一个残基与所述第二链的所述5'端的所述最后一个残基形成错配碱基对。
12.如权利要求9所述的分离的组合物，其中所述第一链的所述5'端的所述最后一个残基和倒数第二个残基与所述第二链的所述3'端的所述最后一个残基和倒数第二个残基形成两个错配碱基对。
13.如权利要求9所述的分离的组合物，其中所述第一链的所述3'端的所述最后一个残基和倒数第二个残基与所述第二链的所述5'端的所述最后一个残基和倒数第二个残基形成两个错配碱基对。
14.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽包含6-100个氨基酸。
15.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽包含10-50个氨基酸。
16.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽包含15-30个氨基酸。
17.如利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽包含10个氨基酸。
18.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述dsRNA-肽缀合物与受体结合。
19.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述dsRNA-肽缀合物与所述LDL受体家族的至少一个成员结合。
20.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽为PAR配体。
21.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽为PARl配体。
22.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽是生长因子配体。
23.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽是胰岛素或胰岛素样生长因子配体。
24.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽是IGF-I配体。
25.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽是激素配体。
26.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽是PTH配体。
27.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽是PTH-I配体。
28.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述dsRNA-肽缀合物与受体结合蛋f~\H 彡口 口
29.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中用稳定的连接子将所述肽与所述dsRNA缀合。
30.如权利要求29所述的分离的组合物，其中所述稳定的连接子包括同型双功能交联剂。
31.如权利要求29所述的分离的组合物，其中所述稳定的连接子包括异型双功能交联剂。
32.如权利要求29所述的分离的组合物，其中所述稳定的连接子包括三功能交联剂。
33.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中用可裂解的连接子将所述肽与所述dsRNA缀合。
34.如权利要求33所述的分离的组合物，其中所述可裂解的连接子包括二硫化物连接子。
35.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中用碳连接子将所述肽与所述dsRNA缀口 o
36.如权利要求35所述的分离的组合物，其中所述碳连接子包含至多十八个碳。
37.如权利要求35所述的分离的组合物，其中所述碳连接子包含6个碳。
38.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中在无连接子的情况下将所述肽与所述dsRNA缀合。
39.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将所述肽与所述dsRNA的所述第一链的所述3'端缀合。
40.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽与所述dsRNA的所述第二链的所述3'端缀合。
41.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将所述肽与所述dsRNA的所述第一链的所述5'端缀合。
42.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将所述肽与所述dsRNA的所述第二链的所述5'端缀合。
43.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将所述肽与所述dsRNA的所述第一链的所述5'端和所述dsRNA的所述第二链的所述5'端缀合。
44.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将所述肽与所述dsRNA的所述第一链的所述5'端和所述dsRNA的所述第二链的所述3'端缀合。
45.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将所述肽与所述dsRNA的所述第一链的所述3'端和所述dsRNA的所述第二链的所述3'端缀合。
46.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将所述肽与所述dsRNA的所述第一链的所述3'端和所述dsRNA的所述第二链的所述5'端缀合。
47.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将至少一个肽与所述dsRNA的所述第一链内部缀合。
48.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将至少一个肽与所述dsRNA的所述第二链内部缀合。
49.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将至少一个肽与所述dsRNA的所述第一链内部缀合且其中将至少一个肽与所述dsRNA的所述第二链内部缀合。
50.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中将至少两个肽与所述dsRNA缀合。
51.如权利要求50所述的分离的组合物，其中所述至少两个肽是相同的。
52.如权利要求50所述的分离的组合物，其中所述至少两个肽是不相同的。
53.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其还包含至少一个染料分子，且其中所述染料分子与所述dsRNA和所述肽中的至少一个缀合。
54.如权利要求53所述的分离的组合物，其中所述染料分子为聚芳烃。
55.如权利要求53所述的分离的组合物，其中所述染料为荧光染料。
56.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其还包含治疗剂。
57.如权利要求56所述的分离的组合物，其中所述治疗剂为抗癌药物。
58.如权利要求57所述的分离的组合物，其中所述抗癌药物选自紫杉醇、三苯氧胺、顺钼、阿霉素和长春碱。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述治疗剂为用于治疗代谢疾病或病症的药物。
60.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述肽包含毒素的靶向部分的一部分。
61.如权利要求60所述的分离的组合物，其中所述神经毒素为梭菌毒素。
62.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其还包含至少一种递送肽。
63.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中从所述dsRNA的所述第一寡核苷酸链的所述3'端的所述第一个核苷酸(位置I)开始，用经过修饰的核苷酸取代位置1、2和/或3。
64.如权利要求60所述的分离的dsRNA，其中所述经过修饰的核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
65.如权利要求I或2所述的分离的dsRNA，其中所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链中的一个或两个包含5'磷酸。
66.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链或所述第二链的至少一个核苷酸是经过修饰的。
67.如权利要求66所述的分离的组合物，其中所述经过修饰的核苷酸残基选自2' -O-甲基、2' _甲氧基乙氧基、2' _氣、2' _稀丙基、2' _0-[2-(甲基氣基)-2-氧代乙基]、4' _ 硫代、4' -CH2-Q-2 ' _ 桥、4' - (CH2) 2-0-2 '-桥、2' -LNA>2 ' _ 氛基和2' -0-(N-甲基氨基甲酸酯)。
68.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述dsRNA在所述细胞中由Dicer内源性裂解。
69.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中在所述细胞环境中，足以降低所述靶基因表达的所述分离的双链核酸的量选自I纳摩尔或更少、200皮摩尔或更少、100皮摩尔或更少、50皮摩尔或更少、20皮摩尔或更少和10皮摩尔或更少。
70.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链与所述第二链通过化学连接子连结。
71.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链的所述3'端与所述第二链的所述5'端通过化学连接子连结。
72.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中用弓I导Dicer裂解定向的经过修饰的核苷酸取代所述第二链或所述第一链的核苷酸。
73.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其包含经过修饰的核苷酸，所述经过修饰的核苷酸选自脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸、3'-脱氧腺苷(虫草素)、3' _叠氣基_3' _脱氧胸昔(AZT)、2 ' , 3 ' _双脱氧肌昔(ddl)、2 ' , 3 ' _双脱氧-3'-硫代胞苷(3TC)、2'，3'-双脱氢-2'，3'-双脱氧胸苷(d4T)、3 '-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)的单磷酸核苷酸、2' ,3/ -双脱氧-3'-硫代胞苷(3TC)和2'，3'-双脱氢-2'，3'-双脱氧胸苷(d4T)的单磷酸核苷酸、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶、2' -O-烷基核糖核苷酸、2' -0-甲基核糖核苷酸、2'-氨基核糖核苷酸、2'-氟核糖核苷酸和锁核酸。
74.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其包含磷酸骨架修饰，所述磷酸骨架修饰选自磷酸酯、硫代磷酯和磷酸三酯。
75.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链的所述3'端的所述经过修饰的核苷酸残基选自脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸和荧光分子。
76.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述第一链的至少一个核苷酸与所述第二链的至少一个核苷酸形成错配碱基对。
77.如权利要求62所述的分离的组合物，其中所述递送肽具有选自SEQIDN0:l_89的氨基酸序列。
78.如权利要求I或2所述的分离的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
79.一种用于降低细胞中的靶基因表达的方法，其包括 以与参照dsRNA相比可有效降低细胞中的靶基因表达的量，使细胞与权利要求I或2中所要求的所述分离的组合物接触。
80
81.一种用于降低动物中的靶基因表达的方法，其包括以与参照dsRNA相比可有效降低动物细胞中的靶基因表达的量，用权利要求I或2中所要求的所述分离的组合物治疗动物。
82.如权利要求81所述的方法，其中当与合适的对照dsRNA相比时，所述分离的组合物具有增强的药代动力学。
83.如权利要求81所述的方法，其中当与合适的对照dsRNA相比时，所述dsRNA具有增强的药效学。
84.如权利要求81所述的方法，其中当与合适的对照dsRNA相比时，所述dsRNA具有降低的毒性。
85.如权利要求81所述的方法，其中当与合适的对照dsRNA相比时，所述dsRNA具有增强的细胞内摄取。
86.一种用于降低受治疗者细胞中的靶基因表达的药物组合物，其包含与参照dsRNA相比可有效降低细胞中的靶基因表达的量的如权利要求I或2所述的所述分离的组合物和药学上可接受的载体。
87.一种合成如权利要求1-78中的任一项所要求的dsRNA-肽缀合物的方法，其包括通过化学法或酶法合成所述dsRNA。
88.—种试剂盒，其包含如权利要求1-78中的任一项所述的所述dsRNA-肽缀合物及其使用说明。
全文摘要
本发明涉及通过使用Dicer底物siRNA(DsiRNA)-肽缀合物而用于降低靶RNA和蛋白质水平的化合物、组合物和方法。
文档编号C07H21/00GK102753187SQ201080034356
公开日2012年10月24日 申请日期2010年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者苏杰特·库马尔·巴苏, 鲍勃·戴尔·布朗 申请人:戴瑟纳制药公司