葡萄糖特异性改善的可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶突变体、聚核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及可溶性化咯哇嘟酿依赖性葡萄糖脱氨酶（PQQ-sGDH)突变体，具体而 言就是W醋酸巧不动杆菌野生型PQQ-sGMl编码基因或其编码蛋白同源性在90%W上的 DNA作为模板，利用PCR扩增进行定点突变，获得一系列具有良好的葡萄糖底物特异性和/ 或热稳定性且对麦芽糖的交叉反应性显著降低的PQQ-sGMl突变体。同时还提供编码所述 PQQ-sGDH突变体的聚核巧酸、包含所述聚核巧酸的表达载体、包含所述表达载体的转化细 胞W及利用所述PQQ-sGDH突变体检测样品中葡萄的方法、试剂和装置。
【背景技术】
[0002] 血糖浓度是糖尿病的一个非常重要的标志物。血糖浓度的测定在糖尿病的临床诊 断和管理中极为重要。血糖的检测通常设及酶催化下的葡萄糖氧化。根据酶的类型不同， 可分为葡萄糖氧化酶（GOD)和葡萄糖脱氨酶（GDH)。在利用试纸条和血糖仪检测血糖时， GOD虽然具有较高的特异性，也不受到葡萄糖之外的糖类物质的干扰，但是极易受到血液中 氧气的干扰而导致测定结果不准确。而GDH则不受到血液中氧气的干扰，因而得到广泛应 用。
[0003] 对GDH而言，根据其辅酶的不同，它大致可分为化咯哇嘟酿依赖性葡萄糖脱氨酶 (PQQ-GDH)，黄素腺嚷岭二核巧酸依赖性葡萄糖脱氨酶（FAD-GDH)和烟酷胺腺嚷岭二核巧 酸依赖性葡萄糖脱氨酶（NAD-GDH)。作为GDH中的一种，PQQ-GDH使用化咯哇嘟酿（PQ曲作 为辅酶。
[0004]PQQ-GDH的EC编号早前为EC1. 1. 99. 17,后被更改为EC1. 1. 5. 2。目前科学家 们已在细菌中发现两类PQQ-GDH(EC1. 1.5. 2):第一种为膜结合的PQQ-GDH(PQQ-mGDH);第 二种是可溶性的PQQ-GDH(PQQ-sGDH)。运两种PQQ-GDH的生化性质差异较大。PQQ-sGDH 只在不动杆菌属细菌的周质空间（periplasmicspace)中发现，如醋酸巧不动杆菌 (Acinetobactercalcoacelicus)和鲍曼氏不动杆菌（A.baumannii)，[^下^醋酸巧不动杆 菌为例进行说明。
[0005] 醋酸巧不动杆菌同时含有上述两种不同的PQQ-GDH，其中，PQQ-mGDH只在细菌细 胞内是有活性的，而PQQ-sGDH只在细菌细胞外表现出活性。此外，它们的序列并不存在显 著的同源性。PQQ-sGDH是由两个相同的亚基组成的，每个亚基含有3个巧离子，每个亚基 的分子量为50kD，每个亚基的N端是一个由24个氨基酸残基组成的信号肤，在分泌到周 质空间中后被切除。PQQ-sGDH可W催化多种单糖和二糖氧化成相应的酬，酬再进一步水解 成醒糖酸，并且，该酶可W将氧化反应时产生的电子提供给吩嗦硫酸甲醋（PM巧、2, 6-二氯 說酪值CI巧、沃斯特蓝（Wurster'Sblue)W及短链泛酿分子如泛酿Q1和泛酿Q2W及某 些人工电子受体，如N-甲基二甲基苯基化挫酬硫酸甲醋（N-methylphenazoniummeth^ sul化te)，W及导电聚合物等。相比于PQQ-mGDH，PQQ-sGDH具有良好的水溶性和较广的电 子受体特异性，因此，它非常适合用于试纸条或血糖仪的葡萄糖测定之中。
[0006] 然而，醋酸巧不动杆菌的野生型PQQ-SGDH也有自身的缺陷，即底物特异性较差： 不仅能与葡萄糖发生氧化反应，而且也能氧化麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖等 单糖和二糖分子发生氧化反应。运种反应性可能会使得一些糖尿病患者在测定自身血糖水 平时获得错误的测量值。特别是当糖尿病患者静脉注射含麦芽糖或半乳糖或木糖制剂或者 进行基于艾考糊精（icodextrin)的腹腔透析时，利用WPQQ-sGMl作为氧化酶的血糖仪测 定的血糖值会错误性地升高，如果运些病人根据错误的血糖值接收治疗，可能会造成异常 的低血糖症、昏迷，甚至死亡。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足之处，本发明在醋酸巧不动杆菌野生型PQQ-sGDH编码基因 或与其编码蛋白的氨基酸序列同源性在90%W上的DNA序列的基础上，利用定点突变PCR 获得PQQ-sGDH突变体，所述突变体具有良好的葡萄糖底物特异性和/或热稳定性，对麦芽 糖等糖的交叉反应性显著下降，将所述突变体用于血液等样品中的葡萄糖测试时，所测得 的葡萄糖值准确性显著提高。
[0008] 野生型PQQ-sGDH最先是从醋酸巧不动杆菌菌株LMD79. 41中分离出来，其氨基酸 序列和DNA序列分别在SEQIDNO1和SEQIDNO2中给出。
[0009] 本发明中诸如"T372C"之类的符号均表示一种替代突变，WT372C为例进行说明， 其意思为372位点上的苏氨酸灯虹，T)被半脫氨酸（切s，C)取代。再WM52X为例，其意 思为452位点上的天冬酷胺（Asn，脚被除N之外的任何一种氨基酸狂）取代，即X选自丙 氨酸（Ala,A)、精氨酸（Arg，时、天冬氨酸（Asp,D)、半脫氨酸（切S，C)、谷氨酷胺（Gin,Q)、谷 氨酸（Glu，E)、组氨酸化is，H)、异亮氨酸（Ile，I)、甘氨酸（Gly，G)、亮氨酸化eu，L)、赖氨 酸化ys，K)、甲硫氨酸（Met,M)、苯丙氨酸（Phe，F)、脯氨酸（Pro,P)、丝氨酸（Ser，S)、苏氨酸 灯虹，T)、色氨酸灯rp，W)、酪氨酸灯yr，Y)或鄉氨酸（Val，V)中的任何一种氨基酸。
[0010] 本发明中诸如"T372C+K455R"之类的符号均表示一种组合替代突变，W T372C+K455R为例进行说明，其意思为372位点上的T被C取代和455位点上的K被R取 代，其中"+ "表示"+ "前后的两种替代突变同时发生。
[0011] 本发明中提及的"同源性"，是指来自除醋酸巧不动杆菌之外的微生物的野生 型PQQ-sGDH在氨基酸序列上与沈QIDNO1具有至少90 %的同源性。比如，鲍曼氏 不动杆菌野生型PQQ-sGMl就满足运个条件，其野生型氨基酸序列已在中国专利申请 CN200610067817. 6中公开。运种同源性可利用ClustalW软件进行氨基酸序列比对就可得 出。
[0012] 本发明中的"氨基酸位点编号"是基于醋酸巧不动杆菌的野生型PQQ-sGDH序列 SEQIDNO1计算出的。至于来自于其他微生物（如鲍曼氏不动杆菌）的野生型PQQ-sGDH 的氨基酸位点编号，可通过ClustalW软件进行氨基酸序列比对找出运两种细菌的氨基酸 位点编号的对应关系。本发明基于便于描述的原因，仅仅利用SEQIDNO1进行氨基酸位 点编号。
[0013] 本发明的目的在于提供一种可溶性化咯哇嘟酿依赖性葡萄糖脱氨酶（PQQ-sGDH) 突变体，所述PQQ-sGDH突变体源自于醋酸巧不动杆菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQ IDNO1，或者源自于其他微生物的与SEQIDNO1具有至少90%同源性的野生型氨基 酸序列，所述PQQ-sGDH突变体的氨基酸位点编号对应于来自醋酸巧不动杆菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQIDN01，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自W下一组突 变中的一种：（1)T372C; (2)T372N; (3)T372D，且所述PQQ-sGDH还在 99、167、170、192、193、 270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少一个位点发生替换突变。
[0014] 进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自W下一组突变中的一种： (1)T372C，且所述PQQ-sGDH还在 99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、 452和455位点中至少一个位点发生替换突变；（2)T372D，且所述PQQ-sGDH还在99、167、 170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452 和 455 位点中至少两个位点发生替换突 变。
[0015] 进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自W下一组突变中的一种： (1)T372C，且所述PQQ-sGDH还在 99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、 452和455位点中至少两个位点发生替换突变；（2)T372D+D167X+N452X+M365X;
[0016] (4)T372D+N452X+M365X+S170X+Q270X；
[0017] (5)T372D+N452X巧367X+S170X+Q270X+Q192X;
[0018] 化）T372D+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X。
[0019] 进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自W下一组突变中的一种： (DT372C+D167X+N452X+M365X；
[0020] (2)T372C+N452X+M365X+S170X+Q270X；
[0021] (3)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X；
[0022] (4)T372C+N452X巧367X+S170X+Q270X+Q192X;
[0023] 巧）T372D+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X+A31拙；
[0024] 化）T372D+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X+R402X。
[002引进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自W下一组突变中的一种：
[0026] (1)T372C+D167E+N452P+M365V+Q270H+Q192X;
[0027] (2)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+Q192X；
[0028] (3)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+L193X〇
[0029] 进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自W下一组突变中的一种：
[0030] (1)T372C+N452X巧366X+S170X+Q270X+Q192X+G99X;
[0031] (2)T372C+N452X+M365X巧366X+S170X+Q270X+L193X。
[003引进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自W下一组突变中的一种：
[0033] (DT372C+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+A31拙+Q192X ;
[0034] (2)T372C+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+R402X+Q192X ;
[0035] (3)T372C+N452X+M365X巧366X+S170X+Q270X+Q192X+L193X。
[0036] 所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括99位点，则99位点的G可被除G之外的 任何一种氨基酸狂）取代，其