携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫治疗领域，更具体地，本发明设及携带PD-L1阻断剂的嵌合抗原 受体修饰的免疫效应细胞。
【背景技术】
[0002] 免疫效应细胞（如T淋己细胞）在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。目前， 基于T淋己细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方 法可W克服抗体治疗的缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意。近年来，根据CTL对 祀细胞的识别特异性依赖于T淋己细胞受体灯CellReceptor,TCR)的发现，将针对肿瘤 细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋己细胞受体的CD3ζ或FcεRI丫等胞内信号激活基序 融合成嵌合抗原受体烟limericantigenreceiptor,CAR),并将其通过如慢病毒感染等方 式基因修饰在T淋己细胞表面。运种CART淋己细胞能够W主要组织相容性复合物（Major HistocompatibilityComplex,MHC)非限制性方式选择性地将T淋己细胞定向到肿瘤细胞 并特异性地杀伤肿瘤。
[0003] 嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别 肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪 氨酸活化基序（ITAM)CD3ζ或化εRI丫及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134等的 胞内信号区。
[0004] 胞内信号区仅包含ΙΤΑΜ的为第一代CARΤ淋己细胞，其中嵌合抗原受体各部分按 如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CART可W激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子 分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应。
[0005] 随后发展的第二代CART淋己细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内 信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：SCFV-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/ CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1B化/CD137共刺激作用引起T淋己细胞的 持续增殖，并能够提高T淋己细胞分泌IL-2和IFN- 丫等细胞因子的水平，同时提高CART 在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
[0006] 近些年发展的第Ξ代CART淋己细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接： scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CART在体内的存 活周期和其抗肿瘤效果。
[0007] 尽管免疫效应细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但是其在实体瘤中的疗效 仍不显著，免疫效应细胞在肿瘤组织内的存活率较差、活性不高。因此，本领域仍然需要进 行进一步的研究，W期进一步提高免疫效应细胞对于肿瘤免疫治疗的疗效。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供携带PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，它携带或表 达PD-Ll(程序性死亡配体1)阻断剂度locker)。
[0010] 在一个优选例中，所述的PD-L1阻断剂包括（但不限于）：
[0011]可溶性PD-l(sPD-l);
[0012] 可溶性PD-1与hIgG4el-Fc的C册结构域的融合肤；
[0013] 可溶性PD-1与hIgG4el-Fc的融合肤；或
[0014] 特异性抗PD-L1抗体。
[0015] 在另一优选例中，所述的可溶性PD-1包括：信号肤和胞外区；较佳地，所述的信 号肤是如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列编码而成的；较佳地，所述的胞外区是如SEQID N0:2所示的核巧酸序列编码而成的。
[0016] 在另一优选例中，所述的hIgG4el-Fc的C册结构域是如SEQIDN0:2所示的核巧 酸序列编码而成的；和/或
[0017] 所述的hIgG4el-Fc的序列是第288位由Ser突变为Pro的。
[0018] 在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号 区，其中所述胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体。
[0019] 在另一优选例中，所述的胞内信号区包括（但不限于）：CD3C，FceRI丫，CD27， CD28,4-1BB(CD137)，CD134,CD40的胞内信号区序列或Myd88,或其组合。
[0020] 在另一优选例中，所述的跨膜区包括（但不限于）：CD8(如CD8α)跨膜区，CD28 跨膜区。
[0021] 在另一优选例中，所述的胞外抗原结合区和跨膜区之间，还包括较链区；较佳地， 该较链区包括：CD8(如CD8α)较链区。
[002引在另一优选例中，所述的肿瘤高表达的抗原包括（但不限于）：EGFR，GPC3,肥R2，E；pM2,ClaudinlS. 1，ClaudinlS. 2,Claudin6,GD2,lipCAM，mesothelin，CD19,CD20,ASGPR1， EGFRvIII，de4EGFR，CD19,CD33,IL13R，LMPl，PLACl，NY-ESO-1，MAGE4,MUCl，MUC16,LeY， CEA，CAIX，CD123。
[0023] 在另一优选例中，所述的特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体是：单链抗体或结 构域抗体。
[0024] 在另一优选例中，所述的免疫效应细胞包括：Τ淋己细胞，NK细胞或NKT细胞，Treg 细胞。
[00巧]在本发明的另一方面，提供一种核酸构建物，其编码用于修饰免疫效应细胞的融 合多肤，所述的核酸构建物包括顺序连接的：PD-L1阻断剂编码序列，胞外抗原结合区编码 序列，跨膜区和胞内信号区编码序列；其中所述胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤高表达 的抗原的抗体。
[0026] 在一个优选例中，所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之 间，W连接肤编码序列连接；和/或。
[0027] 所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间，还包括核糖体跳 跃序列（F2A)。
[0028] 在另一优选例中，所述的连接肤是（GlyGlyGlyGlySe;r)3。
[0029] 在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含编码所述的核酸构建物。
[0030] 在本发明的另一方面，提供一种病毒，所述的病毒包含所述的表达载体。
[0031] 在本发明的另一方面，提供所述的核酸构建物、或包含该核酸构建物的表达载体 或病毒的用途，用于制备祀向肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。
[0032] 在一个优选例中，所述的免疫效应细胞是表达PD-1的免疫效应细胞。
[0033] 在本发明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的用途，用 于制备抑制肿瘤的药物组合物。
[0034] 在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其包括：所述的嵌合 受体修饰的免疫效应细胞。
[0035] 在本发明的另一方面，提供PD-L1阻断剂的用途，用于制备嵌合抗原受体修饰的 免疫效应细胞，增加免疫效应细胞的抗肿瘤作用。
[0036] 在一个优选例中，所述的PD-L1阻断剂包括（但不限于）：
[0037]可溶性PD-1;
[003引可溶性PD-1与hIgG4el-Fc的C册结构域的融合肤；
[003引可溶性PD-1与hIgG4el-Fc的融合肤；或[0040] 特异性抗PD-L1抗体。
[00川在另一优选例中，所述的肿瘤是表达（或高表达）PD-L1的肿瘤。
[0042] 在本发明的另一方面，提供一种制备嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的方法， 所述的方法包括：将所述的核酸构建物转入免疫效应细胞中。
[0043] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0044]图1、人源可溶性PD-1 (sPD-1)、sPD-1-C册、sPD-1-Fc融合蛋白示意图。
[0045] 图2、sPD-1-Fc与M27-CAR融合蛋白示意图。其中，化和VH分别表示单链抗体 M27 (即Y022单链抗体，它可特异性识别抗原EGFRvIII及过量表达的EGFR，参见中国专利 【申请号】201510431481.6)的轻链可变区和重链可变区。CAR区中，4-lBB-CD3C简称为BBZ， CD28-CD3ζ简称为 28Z，CD28-4-1BB-CD3ζ简称为 28BBZ。
[0046]图 3、sPD-1-C册/sPD-l-Fc-F2A-M27CARΤ细胞的阳性率。
[0047] 图4、sPD-l-C册/sPD-l-Fc在感染T细胞&上清中的表达。其中，lysis表示裂解 液，supernatant表示上清液。
[004引图5、肿瘤细胞系中EGFR2S7 3°2表位的暴露情况。
[0049] 图6、PD-L1W及EGFR在各种肿瘤细胞系中的表达情况分析。
[0050]图 7、SPD-1-FC-F2A-M27CART细胞对U87-EGFR、U87-EGFRVIII、A431、CAL27 的杀伤效果。图中，M27-28Z、M27-BBZ、M27-28BBZ表示转入了仅表达M27-28Z、M27-BBZ、 M27-28BBZ的T淋己细胞的实验结果；FC-28Z、FC-BBZ、FC-28BBZ表示转入了表达 SPD-1-FC-F2A-M27-28Z