靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用图
【专利摘要】本发明涉及靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的CD8抗原的前导肽的编码序列、抗GPC3单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列和任选的EGFR序列的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明提供该多核苷酸序列编码的CAR及表达该CAR的T细胞。本发明制备的CAR?T细胞对特异性肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，效靶比是20比1的情况下，杀伤效率超过90％。
【专利说明】
靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途。
【背景技术】
[0002] 肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位 居第三（Bosch等，Gastroenterology 1 277: Sf5_Sl6，2〇〇4 ;El_Serag等，Gastroenterology 1 32:2557 76,2007)。根据美国癌症学会，肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75%，往往直到晚 期肝癌才会有症状。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药 物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。
[0003]磷脂酰肌醇蛋白多糖3(Glypican 3，GPC3)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝 素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋 白酶(furin)剪切产生40kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30kDa左 右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的竣基端(C末端)肽(Capurro等，Dev Ce 1114: 700 711，2008;Capurro等，Cancer Res 65:6245_6254,2005)〇
[0004] GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中 恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且 随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和 12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透 明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等 肿瘤中特异性的高表达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。
[0005] 嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR_T)T细胞是指经基因修 饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细 胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤 的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有 效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗 肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。
[0006] 嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予Τ细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗 原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目 标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA)结合区（通 常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段），一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信 号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造 T细胞自身的安全性来讲都 是关键的决定因素。
[0007] 随着嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR_T)技术的不 断发展，目前CAR-T主要可划分为四代。
[0008] 第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single chain fragment variable， scFV)、跨膜区（transmembrane region，TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序 (immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各 部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3G。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但 2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CAR-T 细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量 的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因 子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应〔Zhang T等， Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways,Cancer Res 2007,67 (22)：11029-11036)〇
[0009 ]第二代CAR-T细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。T细胞的完 全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈 细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动;第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第 二代CAR(Finney HM等，J Immunol. 1998; 161 (6):2791-7)。第2代CAR在胞内信号肽区添加 了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CAR-T细胞提供活 化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化， 能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体 是CD28,它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了 CD134(0X40)和41BB(4-1BB) 等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间 等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代 CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达 90%以上。
[0010] 第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞 因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的CAR可获得更强的抗肿瘤 应答（？1116]\^等，]\1〇111161.，2005，12(5) :933-941)。最典型的就是1]?611〇311几116在 CD28刺激因子的作用下又加了一个41BB的刺激因子。
[0011] 第四代的CAR-T细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12,其能够调节免疫微环境-增加 T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清 除革抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用〔Chmielewski M，Abken H. TRUCKs: the fourth generation of CARs,Expert Opin Biol Ther.，2015;15(8):1145-54〕。
[0012] CAR-T细胞的一大优点是它们是活性药物，一旦输入，生理机制会调控T细胞的平 衡、记忆形成和抗原驱动的扩增。然而，这种治疗尚未完善，T细胞会脱靶而攻击其他的组 织，或扩增量过高，超出治疗所需。鉴于C A R - T细胞已被纳入标准治疗范围，设计病人或药物 可控的启动或关闭机制来调控CAR-T细胞的存在是非常有用的。由于技术原因，关闭机制更 易应用于T细胞。作为其中之一，iCas9系统正在临床研究当中。细胞在表达iCas9时，使用小 分子化合物可诱导iCas9前体分子形成二聚体，激活凋亡途径，从而实现清除细胞的目的。 在移植物抗宿主病中，小分子AP1903已被用于诱导iCas9二聚体和清除T细胞，表明了这种 方法的可行性（Making Better Chimeric Antigen Receptors for Adoptive T-cell Therapy，Clin Cancer Res;22(8)，2016年4月15日）〇
[0013] 另外，还可利用临床上已经使用的清除性抗体，使CAR-T细胞同时表达这些抗体针 对的蛋白，如tEGFR，在治疗相关的毒性反应产生或是治疗已经完成后，通过给予抗体药物 清除相应的CAR-T细胞（Rational development and characterization of humanized anti-EGFR variant III chimeric antigen receptor T cells for glioblastoma,Sci Transl Med 2015；7：275ra22)〇
[0014] 特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体己被公开在如，中国专利文献 CN101186650A。此外据文献Advances in Liver Cancer Antibody Therapies:A Focus on 617口化&113311(1]^8〇让61丨11，8丨〇0^^8,2011年10月1日，25(5):275-284)，其他己知特异性 识别C末端表位的单克隆抗体包括GC33，其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基 酸残基。15例患者的GPC3-GC33抗体在治疗HCC的I期临床试验中观察到明显的治疗效果，推 测裸的抗体在对抗人的肝癌不能起到很好的疗效。一个关于GPC3衍生肽疫苗的I期临床试 验所获得的结果显示，肝癌患者的中位总生存期与GPC3特异性CTL的频率呈正相关，这项研 究表明GPC3针对性的T细胞可能是肝癌治疗潜在靶标。
[0015] 本申请是以GPC3-GC33的scFV的重链和轻链作为CAR的结构，同时也引入了tEGFR 结构（截短的EGFRhtEGFR缺乏细胞外的N末端配体结合结构域和胞内受体酪氨酸激酶活 性，但保留了天然氨基酸序列，属于I型跨膜细胞表面定位，其空间构象可与药物级别的抗 EGFR单克隆抗体西妥昔单抗紧密结合(A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection，in vivo tracking,and ablation of engineered cells，BL00D，2011年8 月4日，118:1255-1263) JEGFR的主要功能:可以作为细胞表面的标记，同时也适合T细胞的 体内追踪可通过流式和免疫组化检测;也可以在体内被妥西单抗(cetuximab)清除。本发明 引入此tEGFR结构既可以在使CAR-T细胞体内进行很好的被示踪，更重要的是此结构可以作 为CAR-T细胞的安全开关：即不想其发挥作用时可加入妥西单抗，安全有效的控制输注的针 对GPC3靶点的CAR-T细胞在体内发挥作用。为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。
【发明内容】
[0016] 本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：
[0017] (1)含有依次连接的CD8抗原的前导肽的编码序列、抗GPC3单链抗体的编码序列、 人CD8a铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3G胞 内区的编码序列和任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列的多 核苷酸序列;和
[0018] (2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
[0019]在一个或多个实施方案中，所述⑶8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示。
[0020]在一个或多个实施方案中，所述抗GPC3单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所示。
[0021 ]在一个或多个实施方案中，所述抗GPC3单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如 SEQ ID NO: 1第150-264位氨基酸所示。
[0022]在一个或多个实施方案中，所述人CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 265-311位氨基酸所示。
[0023] 在一个或多个实施方案中，所述人⑶8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第312- 333位氨基酸所示。
[0024]在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 334-381位氨基酸所示。
[0025]在一个或多个实施方案中，所述人CD3G胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 382-492位氨基酸所示。
[0026]在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构 域IV以及跨膜区。
[0027]在一个或多个实施方案中，由EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组 成。
[0028]在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段含有人EGFR的第310-646位氨基酸序 列。
[0029]在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段由人EGFR的第310-646位氨基酸序列 组成。
[0030] 在一个或多个实施方案中，所述EGFR片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第541-875 位氨基酸所示。
[0031] 在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列编码如SEQ ID N0: 2第1-492位所述 的氨基酸序列，或编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0032]在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO: 1或其第1-1476位 所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO: 1或其第1-1476位所示的核苷酸序列组成。
[0033]本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：
[0034] (1)含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗GPC3单链抗体、人CD8a铰链区、人CD8跨 膜区、人41BB胞内区和人CD3G胞内区的融合蛋白；和
[0035] (2)在（1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活 化T细胞活性的由（1)衍生的融合蛋白。
[0036] 在一个或多个实施方案中，所述抗GPC3单链抗体为抗GPC3单克隆抗体GC33。
[0037]在一个或多个实施方案中，所述⑶8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示。
[0038]在一个或多个实施方案中，所述抗GPC3单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所示。
[0039]在一个或多个实施方案中，所述抗GPC3单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如 SEQ ID NO: 1第150-264位氨基酸所示。
[0040]在一个或多个实施方案中，所述人CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 265-311位氨基酸所示。
[0041 ]在一个或多个实施方案中，所述人⑶8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第312-333位氨基酸所示。
[0042]在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 334-381位氨基酸所示。
[0043]在一个或多个实施方案中，所述人CD3G胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 382-492位氨基酸所示。
[0044]在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构 域IV以及跨膜区。
[0045]在一个或多个实施方案中，由EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组 成。
[0046]在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段含有人EGFR的第310-646位氨基酸序 列。
[0047]在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段由人EGFR的第310-646位氨基酸序列 组成。
[0048] 在一个或多个实施方案中，所述EGFR片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第541-875 位氨基酸所示。
[0049]在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-492位 氨基酸所示。
[0050]本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸 序列。
[0051 ]在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。
[0052]在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位 点，3 ' LTR，5 ' LTR，以及本文所述的多核苷酸序列。
[0053]本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文所述的核酸构建 物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。
[0054]本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有本文所述的多核苷酸 序列或核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白和 任选的EGFR的含胞外结构域III、胞外结构域IV和任选的跨膜区的片段。
[0055] 本发明第六方面提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的基因修饰 的T细胞和药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂。
[0056] 本发明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物或逆转录 病毒在制备活化的T细胞中的应用。
[0057] 本发明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物、逆转录病 毒、或基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗GPC3介导的疾病的药物中的用途。 [0058]在一个或多个实施方案中，所述GPC3介导的疾病为肝癌。
【附图说明】
[0059]图1为实施例1制备的逆转录病毒表达载体GPC3-41BBZ的结构示意图。其中，VL为 轻链可变区；Lk为接头(G4S)3;Vh为重链可变区;Η表示CD8a铰链区；TM为CD8a跨膜区；41BB表 示41BB胞内区；⑶3z表示⑶3ζ胞内区；SP表示前导序列。
[0060]图2为实施例1制备的逆转录病毒表达载体GPC3-41BBZ的部分测序结果峰值图。 [00611图3为实施例2制备的逆转录病毒表达载体GPC3-tEGFR的结构示意图。其中，VL为 轻链可变区；Lk为接头(G4S) 3;Vh为重链可变区;Η表示CD8a铰链区；TM为CD8a跨膜区；41BB表 示41BB胞内区；⑶3z表示⑶3ζ胞内区；2A为T2A多肽;SP表示前导序列。
[0062]图4为实施例2制备的逆转录病毒表达载体GPC3-tEGFR的部分测序结果峰值图。 [0063] 图5为流式细胞仪显示逆转录病毒感染T细胞72小时的GPC3-GC33-CAR+表达效率。 [0064] 图6为流式细胞仪显示逆转录病毒感染T细胞72小时的GPC3-GC33-tEGFR-CAR+表 达效率。
[0065] 图7为制备3天的GPC3-GC33-CART细胞与靶细胞共培养5小时INF- γ的分泌。
[0066] 图8为制备3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART细胞与靶细胞共培养5小时INF- γ的分 泌。
[0067]图9为制备3天的GPC3-GC33-CART细胞与靶细胞共培养5小时后对肿瘤细胞的杀伤 作用。
[0068] 图10为制备3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART细胞与靶细胞共培养5小时后对肿瘤细 胞的杀伤作用。
【具体实施方式】
[0069]本发明提供一种靶向GPC3的嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有依次连接的抗GPC3单 链抗体、人CD8a铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3G胞内区。
[0070]适用于本发明的抗GPC3单链抗体可来自特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆 抗体。这类单克隆抗体包括但不限于CN101186650A以及文献〔Advances in Liver Cancer Antibody Therapies：A Focus on Glypican_3and Mesothelin，BioDrugs，2011年10月1 日；25(5): 275-284〕中公开的抗体，如针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基酸残 基的GC33和hGC33单克隆抗体，以及GPC3-C02和1G12单克隆抗体等。其它识别GPC3的C末端 表位的单克隆抗体也可以合适的方式运用于本发明。这些被公开的单克隆抗体可以用于制 备本发明CAR中的单链抗体部分。
[0071]在某些实施方案中，适用于本发明的抗GPC3单链抗体含有特异性识别人GPC3的C 末端表位的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。任选地，所述轻链可变区和重链可变 区可通过接头序列连接在一起。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是GC33。在某些实施方 案中，所述抗GPC3单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:2的第22 -134位氨基 酸残基所示。在其它实施方案中，所述抗GPC3单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:2的第150 - 264位氨基酸残基所示。
[0072] 适用于本发明的人CD8a铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID N0: 2第265-311位氨基 酸所示。
[0073]适用于本发明的人CD8跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8跨膜区序列。 在某些实施方案中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID N0: 2第312-333位氨基酸所 不。
[0074]适用于本发明的41BB可以是本领域已知的各种用于CAR的41BB。作为示范性例子， 本发明使用SEQ ID N0:2第334-381位氨基酸序列所示的41BB。
[0075] 适用于本发明的人CD3G胞内区可以是本领域常规用于CAR的各种人CD3G胞内区。 在某些实施方案中，所述人⑶3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第382-492位氨基酸所 不。
[0076] 本发明的CAR在5'端还可含有来自⑶8的前导序列。适用于本发明的⑶8前导序列 的一个例子的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第1-21位氨基酸所示。
[0077] 形成本发明的融合蛋白的上述各部分，如CD8抗原的前导肽、抗GPC3单链抗体的轻 链可变区和重链可变区、人⑶8α铰链区、人⑶8跨膜区、41BB和人⑶3ζ胞内区等，相互之间可 直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序 列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个如后重复的基序。例如，该基序可以 是6663、66663、33336、63634和66366。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间 没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3 ~25个氨基酸残基，例如3~15、5~15、10~20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列 是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2~20个，例如2~15、2 ~10、2~8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸 (Α)、亮氨酸(L)、苏氨酸(Τ)、谷氨酸(Ε)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。作为例 子，接头可由以下氨基酸序列组成：G(SGGGG) 2SGGGLGSTEF(SEQ ID N0:7)、RSTSGLGGGS (GGGGS)2G(SEQ ID N0:8)、QLTSGLGGGS(GGGGS)2G(SEQ ID N0:9)、GGGS(SEQ ID N0:10)、 GGGGS(SEQ ID N0:11)、SSSSG(SEQ ID N0:12)、GSGSA(SEQ ID N0:13)、GGSGG(SEQ ID NO: 14)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:15)、SSSSGSSSSGSSSSG(SEQ ID N0:16)、 GSGSAGSGSAGSGSA(SEQIDN0:17)和GGSGGGGSGGGGSGG(SEQIDN0:18)等。
[0078] 在某些实施方案中，本发明抗GPC3单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由 (GGGS)n连接，其中η为1~5的整数。
[0079]在某些实施方案中，本发明CAR的氨基酸序列如SEQ ID Ν0: 2第1-492位氨基酸所 不。
[0080]应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨 基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建 融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白 的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适 区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的 融合蛋白（即所述CAR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任 何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HAl， C-MyC，P〇ly-His， Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，ΕΕ，Τ7,4Α6, ε，B，gE以及Tyl。这些标签可用于对蛋白进行纯 化。
[0081 ] 本发明也包括SEQ ID N0: 2第1-492位氨基酸序列所示的CAR的突变体。这些突变 体包括：与该CAR具有至少80 %，优选至少85 %，优选至少90%，优选至少95%，优选至少 97%的序列相同性并保留该CAR的生物学活性（如活化T细胞）的氨基酸序列。可采用例如 NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
[0082]突变体还包括:在SEQ ID N0:2第1-492位氨基酸序列所示的序列中具有一个或数 个突变(插入、缺失或取代）、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变 通常指1 一 10个以内，例如1 一8个、1 一5个或1 一3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领 域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。 "性能相近或相似的氨基酸"包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括 具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬 氨酸、谷氨酸）、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨 酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨 酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，在 本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上 影响其活性。
[0083] 本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是 DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNAANA可以是单链的或是 双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并 变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
[0084] 本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公 开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术 人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需 要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在 某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如如SEQ ID NO: 1第1 一 1476位核 苷酸所示。
[0085]在某些实施方案中，本发明的多核苷酸序列还包含编码EGFR的片段的核苷酸序 列。
[0086] 适用于本发明的EGFR可以是本领域周知的EGFR，例如来自人的EGFLEGFR含有N末 端胞外结构域I和II，胞外结构域III，胞外结构域IV，跨膜区，近膜区结构域以及酪氨酸激 酶结构域。本发明优选使用截短的EGFR( "tEGFR"，即本文所述的EGFR的片段），尤其是不包 括其胞内区域(近膜区结构域及酪氨酸激酶结构域)的截短的EGFR。在某些实施方案中，还 可以进一步将不包括胞内区域的EGFR进一步截短成不包括胞外结构域I和II。因此，在某些 实施方案中，本发明使用的tEGFR含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或 由EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组成。在某些实施方案中，所述tEGFR含 有人EGFR的第310-646位氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列组成，其中第 310-480位氨基酸序列为人EGFR的胞外结构域III，第481-620为人EGFR的胞外结构域IV，第 621-646位氨基酸为人EGFR的跨膜区。在某些实施例中，所述tEGFR的氨基酸序列的胞外结 构域III和IV如SEQ ID N0: 2第541-852位氨基酸所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所 述tEGFR的跨膜区序列如SEQ ID N0:2第853-875位氨基酸所示。
[0087]为促进tEGFR的表达，还可在其N端设置前导序列。在某些实施方案中，本发明使用 来自GM-CSF受体（"GMCSFR"）α链的信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如 SEQ ID Ν0:2第519-540位氨基酸所示。
[0088]除此之外，可通过T2A多肽的编码序列将所述信号肽及tEGFR的编码序列与本发明 CAR中人CD3G胞内区的编码序列相连。在一个或多个实施方案中，所述T2A肽的氨基酸序列 如SEQ ID NO: 1第493-518位氨基酸所示。
[0089]因此，在某些实施方案中，本发明的多核苷酸序列含有本发明CAR的编码序列、T2A 多肽的编码序列、来自GM-CSF受体α链的信号肽的编码序列、以及tEGFR的编码序列。在某些 实施方案中，本发明多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0090] 本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与 这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被 操作以保证所述融合蛋白（CAR和/或tEGFR)的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据 表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列 的技术是本领域已知的。
[0091] 调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操 作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突 变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽 的基因获得。
[0092] 调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。 终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3'末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能 的任何终止子都可用于本发明。
[0093]调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前 导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5'末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任 何终止子都可用于本发明。
[0094] 在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接本发明的多 核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。该载体 对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达 的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
[0095] 本发明的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌 粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体 形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等（2001， Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York) 和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病 毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
[0096] 通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便 的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，W0 01/96584;W001/29058;和美国专利号 6,326,193)。
[0097] 例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复 制起始位点，3'LTR，5'LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。
[0098] 合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序 列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序 列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-MEF-Ια)。然而，也可使用其他组成型启 动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺 陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时 早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、 肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动 子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型 启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子 包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0099] 为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标 记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群 中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转 染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主 细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0100] 报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被 引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码 荧光素酶、半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基 因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。
[0101] 将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在 本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如， 表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
[0102] 将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微 注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载 体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶 囊、微球、珠;和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
[0103] 将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载 体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源 自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的 系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便 的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该 重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中 是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在 一个实施方案中，使用慢病毒载体。
[0104] 因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化Τ细胞的逆转录病毒，该病毒含 有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。
[0105] 适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于 B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。
[0106] 在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的（例如30~80ng/ml，如50ng/ml) 的⑶3抗体刺激活化，然后在含有适量的（例如30~80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基进行 培养备用。
[0107] 因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞 含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的逆转录病毒载体，或感染了本文所述的 逆转录病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的融合蛋白和任选的 tEGFR。
[0108] 本发明的CAR-Τ细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持 续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随 后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CAR-Τ细胞可体内分化成中心记忆样状态。
[0109] 本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的CAR和任选 的tEGFR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。 不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0110] 由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的 免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特 异性的免疫应答。
[0111] 因此，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及CAR-T细 胞治疗的疾病优选为GPC3介导的疾病。
[0112] 具体而言，本文中，"GPC3介导的疾病"尤其包括各种类型的肝癌。
[0113] 本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其 他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如 本文所述的CAR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。 这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等;碳水化合物诸如葡 萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸;抗氧化剂;螯合剂 诸如EDTA或谷胱甘肽;佐剂(例如，氢氧化铝）；和防腐剂。
[0114] 本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防）的疾病的方式施用。施用的数量 和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
[0115] 当指出"免疫学上有效量"、"抗肿瘤有效量"、"肿瘤-抑制有效量"或"治疗量"时， 待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者（对象）的年龄、重量、肿瘤大 小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物 可以以1〇 4至1〇9个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物 也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术（见例如 Rosenberg等，New Eng · J · of Med· 319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗 方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0116] 对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输 液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉 内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注 射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细 胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
[0117] 在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的 其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知 的治疗GPC3介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
[0118] 本文中，"抗肿瘤效应"指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的 减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。
[0119] "患者"、"对象"、"个体"等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机 体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
[0120]本发明采用抗GPC3抗体（具体是衍生自GC33的scFV)的基因序列，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人的⑶8α铰链区、人的⑶8跨膜区、人的41BB胞内区和人的⑶3ζ胞 内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体GC33scFv-CD8铰链区-CD8TM-41BB-CD3G与 GC33scFv-CD8铰链区-CD8TM-41BB-CD3G-tEGFR的基因片段，插入到逆转录病毒载体中。重 组质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明实现嵌合 抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转化方法是基于逆转录病毒转化方法。该方法具有转化 效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等 优点。在该转基因 T淋巴细胞表面，转化的核酸通过转录、翻译表达在其上。本发明制备的 GPC3-GC33CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，效靶比是20比1的情况下，杀伤 效率超过90 %。更进一步地，通过携带tEGFR组件，本发明的CAR还具有体内示踪和安全开关 的作用。
[0121] 本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明 性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以 下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
[0122] 实施例 1 :mGPC3scFv-CD8a-41BB-CD3C 基因序列的确定
[0123] 从NCBI网站数据库搜索到人的CD8a铰链区、人的CD8a跨膜区、人的41BB胞内区和 人的⑶3ζ胞内区基因序列信息，抗GPC3单链抗体克隆号为GC33,这些序列在网站http:// sg. idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类 细胞表达。
[0124] 采用重叠 PCR将上述序列依次按抗GPC3scFv、人⑶8α铰链区基因、人⑶8α跨膜区基 因、人41ΒΒ胞内区基因、人CD3G胞内区基因序列进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位 点，形成完整的mGPC3-CAR基因序列信息，获得CAR分子(下文称为"mGPC3CAR"），其基因序列 如SEQ ID NO: 1第1-1476位所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第1-492位氨基酸所 不。
[0125] 用Notl(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切该CAR分子的核苷酸序列，经T4连接酶(NEB)连 接插入逆转录病毒MSCV(Addgene)的Notl-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5a)。
[0126] 将所获得的重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合 成的mGPC3_CAR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：
[0127] 有义：AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQ ID N0:3);
[0128] 反义：TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQ ID N0:4)。
[0129] 经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的 质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。
[0130]本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。图2显示该MSCV-CAR逆转录病毒表达 质粒的部分测序结果峰值图。
[0131] 实施例2:mGPC3CAR-tEGFR基因序列的确定
[0132] 从NCBI网站数据库搜索到人的EGFR胞外区基因序列信息，序列在网站http:// sg. idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类 细胞表达。
[0133] 采用重叠 PCR将上述序列依次按实施例1的GPC3CAR、GMCSFR前导序列、tEGFR进行 连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的mGPC3CAR-tEGFR基因序列信息，获得 CAR分子，其序列如SEQ ID N0:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0134] 用Notl(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切该CAR分子的核苷酸序列，经T4连接酶(NEB)连 接插入逆转录病毒MSCV(Addgene)的Notl-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5a)。
[0135] 将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的 mGPC3CAR-tEGFR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：
[0136] 有义：AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQ ID N0:5);
[0137] 反义：TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQ ID N0:6)。
[0138] 经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的 质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。
[0139] 本实施例所构建得到的质粒图谱如图3所示。图4显示该MSCV-CAR逆转录病毒表达 质粒的部分测序结果峰值图。
[0140] 实施例3:逆转录病毒包装
[0141] 1.第1天:293T细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6*10~6细胞/ml铺板，10cm 皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜。
[0142] 2.第2天:293T细胞融合度达到90%左右进行转染(通常是铺板14-18h左右）；准备 质粒复合物，各种质粒的量为实施例1或2的MSCV骨架载体12.5ug，Gag-pol 10ug，VSVg 6.25ug，CaCl2 250ul，H20 lml，总体积为1.25ml;在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的 HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37°C培养 4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。
[0143] 3.第4天:转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80°C，继续添加 预热的新鲜DMEM培养基。
[0144] 实施例4:逆转录病毒感染人的T细胞
[0145] 1.用Ficcol分离液(天津灏洋)分离获得较纯的⑶3+T细胞，用含5%AB血清X-VIV0 (L0NZA)培养基调整细胞密度为1 X 106/mL。将细胞以lml/孔接种到预先用抗人50ng/ml CD3抗体(北京同立海元)和50ng/ml CD28抗体（北京同立海元），再加入100IU/ml的白细胞 介素2(北京双鹭），刺激培养48小时后用实施例3制备得到的病毒感染；
[0146] 2.T细胞活化培养后隔天，PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin(Takara)包 被非组织处理培养板，24孔板每孔250μ1。避光，4°C过夜备用。
[0147] 3. T细胞活化培养两天后，取出2块包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2 % BSA的 HBSS室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μ1，吸弃封闭液，用含2.5%HEPES的HBSS洗板两 次。
[0148] 4.将实施例3制备得到的病毒液加入孔内，每孔加2ml病毒液，32°C，2000g，离心 2h〇
[0149] 5.弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的T细胞1 X 106个，体积lml，培养基为T细 胞培养基中添加 IL-2 20011]/1111。30°(：，100(^，离心1011^11。
[0150] 6.离心完毕后，将培养板置于37°C，5%C〇2培养箱中培养。
[0151] 7.感染后24h，将细胞悬液吸出，1200rpm，4°C，离心7min。
[0152] 8.细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100IU/ml的T细胞培养液， 使T细胞的密度维持在5 X 105/ml左右，使细胞扩增。
[0153]由此获得分别感染了实施例3所示逆转录病毒的CART细胞，分别命名为GPC3-GC33-CART细胞(表达实施例1的GPC3CAR)和GPC3-GC33-tEGFR-CART细胞(表达实施例2的 mGPC3CAR和tEGFR)。
[0154] 实施例5:流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达
[0155] 分别离心收集感染后72小时的CAR-T细胞和NT细胞(对照组），roS洗涤1次后弃上 清，加入相应的抗体避光30min后PBS洗涤，重悬，最后流式细胞仪检测。CAR+由抗鼠 IgG F (ab，）抗体(Jackson Immunoresearch)检测。
[0156] 结果如图5和6所示。其中，图5显示，使用实施例3制备得到的逆转录病毒感染T细 胞72小时后，GPC3-GC33-CAR+的表达效率达36%;图6显示，使用实施例3制备得到的逆转录 病毒感染Τ细胞72小时后，GPC3-GC33-tEGFR-CAR+的表达效率达23%。
[0157] 实施例6: CAR-T细胞与靶细胞共培养后INF- γ分泌检测
[0158] 1.取实施例4制备好的CAR-T细胞，重悬与Lonza培养基中，调整细胞浓度为IX 106/mL〇
[0159] 2.阳性对照组的培养板预先使用CD3单抗500ng/mL加 CD28单抗500ng/ml包被，培 养基中不添加 IL-2。充分混匀后加入24孔板中，每孔lmL细胞悬液。同时加入BD GolgiPlug (含BFA，每lml细胞培养基中加入ΙμL BD GolgiPlug)，充分混匀后，37°C孵育5-6小时。收集 细胞，作为CAR-T细胞阳性对照。
[0160] 3.实验组每孔含靶细胞(HepG2和Huh-7)或阴性对照细胞（SK-HEP-1)2X105个，实 施例4的CAR-T细胞2X105个，200μ1不含IL-2的Lonza培养基。充分混匀后加入96孔板中。同 时加入BD GolgiPlug(含BFA，每lml细胞培养基中加入ΙμL BD GolgiPlug)，充分混匀后，37 °C孵育5-6小时。收集细胞，作为实验组。
[0161] 4.每管用lmL的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟。仔细吸去或倒掉上清。
[0162] 5 . PBS洗细胞后，加入250μ1/ΕΡ管固定/渗透液，4°C孵育20分钟以固定细胞及破 膜。用1 X BD Perm/Wash?缓冲液清洗细胞2次，lmL/次。
[0163] 6.进行胞内因子染色，取适量IFN-γ、IL-2细胞因子荧光抗体或阴性对照，用BD Perm/Wash?缓冲液稀释至50μ1。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4°C避光孵育 30min，l XBD Perm/Wash?缓冲液lmL/次清洗细胞2次，然后用roS重悬。
[0164] 7.流式细胞仪检测。
[0165] 结果如图7和8所示。其中，图7显示制备3天的GPC3-GC33-CART细胞与靶细胞(31(-HEP-l、HepG2、Huh-7)共培养5小时INF-γ的分泌情况。图8显示制备3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART细胞与靶细胞(SK-HEP-1、!fepG2)共培养5小时INF- γ的分泌情况。
[0166] 实施例7 :CAR_T细胞与靶细胞共培养后检测肿瘤特异性细胞杀伤作用
[0167] 1. GPC3阳性的肿瘤细胞(HepG2和Huh-7)(含GPC3靶蛋白，为靶细胞）悬浮在含有 0 · 1 %BSA的PBS中，调整浓度为1 X 106/ml。
[0168] 2.加入荧光染料CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)至终浓度为ΙμΜ。
[0169] 3.混匀，37Γ 孵育 10min。
[0170] 4.孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的FBS，室温孵育2min以终止标记反应。 [0171] 5.清洗细胞并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度IX 106/ml。
[0172] 6.清洗实施例4的效应T细胞并悬浮在细胞毒性培养基中，调整浓度为5X 10%1。
[0173] 7.在所有的实验中，比较感染了实施例4的效应T细胞(CART)的细胞毒性和/或未 感染的阴性对照效应T细胞(NT细胞)的细胞毒性，并且这些效应T细胞来自同一个病人。
[0174] 8.对于感染实施例4获得的效应T细胞和阴性对照效应T细胞，按照T细胞:靶细胞 = 20:1或4:1(图9)，或2:1或1:2(图10)的比例，于5ml无菌试验管(BD Biosciences)进行培 养，每组设置两复孔。每一个共培养组中，靶细胞为50，000个（50μ1)，阴性对照细胞为50， 000个(50μ1)〇
[0175] 9.将共培养细胞置于37 °C孵育4h。
[0176] 10.孵育完成后，PBS清洗细胞，然后立即按照说明书推荐的浓度快速加入7-AAD (7-氨基放线菌素 D)，冰上孵育30min。
[0177] 不需清洗，直接进行流式上机检测，数据用Flow Jo进行分析。
[0178] 结果显示在图9和10中。图9显示制备3天的GPC3-GC33-CART细胞（"CART"）和阴性 对照效应T细胞（"NT"）与靶细胞(HepG2或Huh-7)共培养5小时后对肿瘤细胞的杀伤作用。图 10显示制备3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART细胞（"GPC3-tEGFR CART"）、GPC3-GC33-CART细胞 ("GPC3CART"）和阴性对照效应T细胞（"NT"）与靶细胞(HepG2)共培养5小时后对肿瘤细胞的 杀伤作用。
【主权项】
1. 一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自： (1) 含有依次连接的CD8抗原的前导肽的编码序列、抗GPC3单链抗体的编码序列、人CD8 α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3G胞内区的 编码序列和任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列的多核苷酸 序列;和 (2) (1)所述多核苷酸序列的互补序列。2. 如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于， 所述CD8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示;和/或 所述抗GPC3单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所 示;和/或 所述抗GPC3单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO: 1第150-264位氨基 酸所示;和/或 所述人⑶8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第265-311位氨基酸所示;和/或 所述人⑶8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第312-333位氨基酸所示;和/或 所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第334-381位氨基酸所示;和/或 所述人⑶3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第382-492位氨基酸所示;和/或 所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或由EGFR的胞 外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组成;优选地，所述片段含有人EGFR的第310-646位 氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列组成；更优选地，所述片段的氨基酸序 列如SEQ ID NO:2第541-875位氨基酸所示。3. 如权利要求1或2所述的多核苷酸序列，其特征在于， 所述多核苷酸序列编码如SEQ ID NO:2第1-492位所述的氨基酸序列，或编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列;或 所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO: 1或其第1-1476位所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO: 1或其第1-1476位所示的核苷酸序列组成。4. 一种融合蛋白，所述融合蛋白选自： (1) 含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗GPC3单链抗体、人CD8a铰链区、人CD8跨膜区、 人41BB胞内区和人CD3G胞内区的融合蛋白；和 (2) 在（1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T 细胞活性的由（1)衍生的融合蛋白； 优选地，所述抗GPC3单链抗体为抗GPC3单克隆抗体GC33。5. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特 征： 所述⑶8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示； 所述抗GPC3单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所 示； 所述抗GPC3单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO: 1第150-264位氨基 酸所示； 所述人⑶8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第265-311位氨基酸所示； 所述人⑶8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第312-333位氨基酸所示； 所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第334-381位氨基酸所示； 所述人⑶3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第382-492位氨基酸所示;和 所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或由EGFR的胞 外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组成;优选地，所述片段含有人EGFR的第310-646位 氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列组成；更优选地，所述片段的氨基酸序 列如SEQ ID NO: 1第541-875位氨基酸所示;和 优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1第1-492位氨基酸所示。6. -种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸序列； 优选地，所述核酸构建物为载体； 更优选地，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3 ' LTR，5 ' LTR，以及 权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸序列。7. -种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有权利要求6所述的核酸构建物，优选含有所述 载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。8. -种基因修饰的T细胞或含该基因修饰的T细胞的药物组合物，其特征在于，所述细 胞含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸序列，或含有权利要求6所述的核酸构建物， 或感染了权利要求7所述的逆转录病毒，或稳定表达权利要求4-5中任一项所述的融合蛋白 和任选的EGFR的含胞外结构域III、胞外结构域IV和任选的跨膜区的片段。9. 权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求4-5中任一项所述的融合蛋 白、权利要求6所述的核酸构建物或权利要求7所述的逆转录病毒在制备活化的T细胞中的 应用。10. 权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求4-5中任一项所述的融合蛋 白、权利要求6所述的核酸构建物、权利要求7所述的逆转录病毒、或权利要求8所述的基因 修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗GPC3介导的疾病的药物中的用途； 优选地，所述GPC3介导的疾病为肝癌。
【文档编号】A61P35/00GK105949324SQ201610504698
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】黄飞, 王海鹰, 金涛, 何凤, 史子啸
【申请人】上海恒润达生生物科技有限公司