嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car20-nkt细胞及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CAR20-NKT细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的大鼠生长激素信号肽、CD20ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。采用本发明的CAR20-NKT细胞治疗进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤时，能够有效避免采用现有靶向CD20的药物时引起的耐药性，对肿瘤细胞具有一定的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者有一定的治疗效果。
【专利说明】
嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CAR20-NKT细胞 及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，设及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受 体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重组表达载体、工程化CD20祀向性的NKT细胞 (CAR20-NKT细胞）及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞（MT)是一种特殊类型的T淋己细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细 胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-Pl两种受体，在TCR和NKR介 导下，NKT细胞能够产生大量的比-4及INF 丫，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通 过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用 (ADCC，antibody-dependent cell-mediated 巧totoxicity)。但在抗体依赖的细胞介导的 杀伤作用过程中，由于抗体能与祀细胞上的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何 已与抗体结合的祀细胞，因此抗体与祀细胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对祀细 胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周 左右，有效期短暂，需要反复多次输注。而且，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足W在肿瘤 周围或者瘤巢中富集，制约了 NKT细胞对恶性肿瘤的祀向治疗。再者，研究表明，NKT细胞 并不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，且对部分肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待 提局。
[0003] CD20分子是一种B细胞分化抗原，仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面，表达于 95% W上的B细胞性淋己瘤，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达。重要 的是，CD20分子在膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不 会因为与抗体的结合而发生抗原调变，故成为治疗B细胞淋己瘤的理想祀点。
[0004] 目前，在治疗进展期CD20阳性B细胞淋己瘤患者时，抗CD20的药物治疗已经处于 临床研究阶段，但是，临床结果表明，仅部分进展期CD20阳性B细胞淋己瘤患者采用抗CD20 的药物（如CD20单克隆抗体）治疗有效，并且患者最终会产生一定的耐药性，从而影响药 物的疗效。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀 伤活性有待提高W及采用抗CD20的药物治疗进展期CD20阳性B细胞淋己瘤患者时引起的 耐药性的缺陷，提供一种嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重组表达 载体、工程化CD20祀向性的NKT细胞（CAR20-NKT细胞）及其制备方法和应用。
[0006] 本发明的发明人在研究中意外发现，采用本发明的嵌合抗原受体 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细胞治疗进展期CD20阳性B细胞淋己瘤时，对淋己 瘤细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗（如CD20单克隆抗体、放疗、化疗及 其他药物对症治疗等）但均无明显疗效的进展期CD20阳性B细胞淋己瘤患者有一定的治 疗效果。
[0007] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合 抗原受体为〔0205〇。￥-〔08-〔0137-〔03(，包括串联的大鼠生长激素信号肤、〔0205〇。￥、〔08 的较链区化inge区）和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3 C的胞内信号结构域。
[0008] 第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。
[0009] 第=方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
[0010] 第四方面，本发明提供了一种工程化CD20祀向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上 述嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细胞。
[0011] 第五方面，本发明提供了一种工程化CD20祀向性的NKT细胞的制备方法，所述方 法包括：包装携带pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得 到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0012] 第六方面，本发明提供了上述方法制备得到的工程化CD20祀向性的NKT细胞。 [001引第屯方面，本发明提供了上述工程化CD20祀向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤 的制剂中的应用。
[0014] 在治疗进展期CD20阳性B细胞淋己瘤患者时，本发明的嵌合抗原受体 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细胞，即工程化CD20祀向性的NKT细胞能够特异性 结合CD20抗原，明显的延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞祀向识别癌细 胞表面CD20抗原的能力，加强对CD20阳性祀细胞的特异杀伤活性，而且确实能够有效避免 采用现有抗CD20的药物治疗时引起的耐药性，对已经过多次治疗（如放疗、化疗及其他药 物对症治疗等）但均无明显疗效的进展期CD20阳性B细胞淋己瘤患者有一定的治疗效果。 本发明的工程化CD20祀向性的NKT细胞为治疗CD20阳性的肿瘤提供了一种新的选择，具 有良好的产业应用前景。
[0015] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
【附图说明】
[0016] 图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。
[0017] 图2为本发明的慢病毒表达载体pWP化-CD8-CD137-CD3 C的限制性内切酶MluI/ NdeI双酶切片段的电泳鉴定图。
[0018] 图3为本发明的慢病毒表达载体pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的限制性内 切酶BamHI/Ndel双酶切片段的电泳鉴定图。
[0019] 图4为本发明的慢病毒表达载体pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的结构示意 图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。
[0020] 图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的病毒浓 缩液对NKT细胞的感染效率。
[0021] 图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细 胞（CAR20-NKT细胞）表型鉴定的结果。
[0022] 图7为本发明的CAR20-NKT细胞对CD20阳性的B细胞淋己瘤细胞的杀伤作用的 细胞毒性分析图。
[0023] 图8为流式细胞术检测CAR20-NKT细胞回输至9例进展期CD20阳性的B细胞淋 己瘤患者中，CAR20-NKT细胞在患者外周血中的持续存在时间曲线图。
[0024] 图9为本发明的CAR20-NKT细胞对进展期CD20阳性的B细胞淋己瘤患者治疗前 与治疗后3个月阳T-CT的对比图。
【具体实施方式】
[0025] W下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0026] 本发明提供了 一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C，包括串联的大鼠生长激素信号肤、CD20单链抗体CD20ScFv、 CD8的较链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3 C的胞内信号结构域。
[0027] 优选情况下，嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C由大鼠生长激素信号肤、 CD20ScFv、CD8的较链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3 C的胞内信号结构域串 联构成。进一步优选地，嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更进一步优 选地，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0028] 本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，所述基因具有如SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，进一步优选地，编码上述嵌合抗原受体的基因的核巧酸序列如 沈QID NO. 2所示。
[0029] 本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病 毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞 如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3C修饰的 NKT细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0030] 对于慢病毒表达载体pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的制备方法没有特 别的限定，可W为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体 pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3C 的制备方法包括 W下步骤：
[003。 （1)从NKT细胞CDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞 内信号结构域和CD3 C的胞内信号结构域，并克隆至载体pWP化-GFP中，构建得到 pWP化-CD8-CD137-CD3C ;
[0032] 似合成编码大鼠生长激素信号肤和CD20ScFv的核巧酸序列， 并克隆至pWP化-CD8-CD137-CD3C中，经测序验证后得到序列正确的 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0033] 步骤（1)中，对于从NKT细胞CDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的 胞内信号结构域和CD3 C的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可W为本领域常用的 各种方法，例如可W为RT-PCR法。其中，NKT细胞可W通过分离人静脉血中的单个核细胞， 然后进行培养获得。
[0034] 具体地，得到pWP化-CD8-CD137-CD3 C的方法可W包括：提取NKT细胞的总RNA， 逆转录获得NKT细胞cDNA，W得到的NKT细胞CDNA为模板，利用引物Pl (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)进行PCR扩增获得CD8基因的hinge区和跨膜区（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQID NO. 13)和P4(SEQID NO. 14)进行PCR扩增获得CD137基因的胞内信号结构域 (SEQID NO. 4);利用引物 P5(SEQID NO. 15)和 P6(SEQID NO. 16)进行 PCR扩增获得 CD3 C 基 因的胞内信号结构域（SEQID NO. 5)，将获得的PCR产物分别进行双酶切，然后与Mlul/Ndel 双酶切后的慢病毒表达载体pWP化-GFP连接。
[0035] 步骤（2)中，对于合成编码大鼠生长激素信号肤和CD20ScFv的核巧酸序列的方法 没有特别的限定，可W为本领域常用的各种方法，例如可W通过全基因合成技术合成。
[0036] 具体地，得到序列正确的pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的方法可 W包括：通过全基因合成技术合成编码大鼠生长激素信号肤和CD20ScFv融合基 因的核巧酸序列（SEQID NO. 8)，克隆至载体pGSI中，得到pGSI-CD20ScFv ;然后 将pGSI-CD20ScFv进行BamHI/MluI双酶切，与用BamHI/MluI双酶切后的步骤 (1)得到的重组质粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C连接，经测序鉴定，得到序列正确的 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。其中，大鼠生长激素信号肤的核巧酸序列如沈QID NO. 6所示，CD20ScFv核巧酸序列如沈QID NO. 7所示。
[0037] 本发明还提供了一种工程化CD20祀向性的NKT细胞，所述NKT细胞是由上述嵌合 抗原受体 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 修饰的 NKT 细胞（即 CAR20-NKT 细胞）。
[0038] 本发明还提供了一种工程化CD20祀向性的NKT细胞的制备方法，该方法包括：包 装携带pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓 缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0039] 对于包装携带pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒的方法没有特 别的限定，可W为本领域技术人员常用的各种方法，优选情况下，将慢病毒表达载体 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 与辅助质粒（如 PSPAX2、pMD2. G)共转染 293T 包装细 胞，转染48-7化时收集病毒上清，离屯、、过滤，在滤液中添加5 XPEGeooo-NaCl进行混匀，离 屯、后弃上清，沉淀用0-4°C预冷的无菌PBS溶解，获得病毒浓缩液。
[0040] 本发明的方法中，还包括通过如下方法制备NKT细胞：
[0041] (1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶 段培养；
[0042] (2)在白介素-2存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养。
[0043] 优选情况下，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一 NKT 细胞培养液中，所述第一 NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介 素-2和白介素-15 ;进一步优选地，第一 NKT细胞培养液中，所述CD3单克隆抗体的浓度为 30-70ng/mU和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mU和/或所述白介素-15的浓度为 3〇-70ng/mL。
[0044] 优选情况下，所述第二阶段培养的实施方式包括：将所述第一阶段培养的细胞培 养于第二NKT细胞培养液中，所述第二NKT细胞培养液中含有NKT细胞培养基和白介素-2 ; 进一步优选地，第二NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL。
[0045] 对于MT细胞培养基没有特别的限定，可W为本领域常用的各种用于培养MT细 胞的培养基，例如可W为GT-T551培养基。
[0046] 在制备NKT细胞时，对于第一阶段培养和第二阶段培养的条件没有特别的限定， 可W为本领域常用的各种条件，例如可W在30-37°C、饱和湿度为3-6%的C〇2培养箱中进 行培养。本领域技术人员可W对培养的时间进行适应性调整，此为本领域技术人员所公知， 在此不再寶述。
[0047] 本发明制备得到的NKT细胞中，CD3+细胞平均比率〉90%，CD3 +CD8+细胞占总CD3 + 细胞的平均比率〉7〇%仰3+〔056+细胞占总〔03+细胞的平均比率〉15%。
[004引对于感染NKT细胞的方法没有特别限定，可W为本领域常用的各种方法，优选情 况下，该方法包括：
[0049] (1)在病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2存在下，将NKT细胞进行第一阶段感染培 养；
[0050] (2)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将所述第一阶段感染培养 的细胞进行第二阶段感染培养。
[0051] 优选地，所述第一阶段感染培养的实施方式包括：将NKT细胞培养于第S NKT细 胞培养液中，所述第S NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介 素-2 ;进一步优选地，第S NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL。
[0052] 优选地，所述第二阶段感染培养的实施方式包括：将所述第一阶段感染培养的细 胞培养于所述第一 NKT细胞培养液中。第一 NKT细胞培养液的具体组成可参见前述相应内 容，在此不再寶述。
[0053] 在感染NKT细胞时，对于第一阶段感染培养和第二阶段感染培养的条件没有特别 的限定，可W为本领域常用的各种条件，例如可W在30-37°C、饱和湿度为3-6%的C〇2培养 箱中进行培养。本领域技术人员可W对培养的时间进行适应性调整，此为本领域技术人员 所公知，在此不再寶述。
[0054] 具体地，感染NKT细胞的方法包括：取IX IO7-SX IO7个NKT细胞，弃掉旧的培养 液，加入2-4血新鲜GT-l'SSl培养液，再加入200-400 y L病毒浓缩液、2-4 y L 1 X 10 Smg/ 血鱼精蛋白和终浓度为300-70011/血的比-2，置于30-37°(：、饱和湿度为3-6%的〇)2培养 箱中感染12-1化后，弃培养液，将细胞转至未包被的培养瓶中，加入20-50mL的GT-T551培 养基，再加入终浓度为300-700U/mL的IL-2、终浓度为30-7化g/ml的CD3单克隆抗体和终 浓度为30-7化g/mL的白细胞介素15,于30-37°C、饱和湿度为3-6%的C〇2培养箱中培养 12-1她，获得嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细胞。
[00巧]进一步优选地，感染NKT细胞的方法还包括：
[0056] (3)先在白介素-2存在下，将所述第二阶段感染培养的细胞进行体外诱导，待细 胞的密度为80-90%时，再在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将细胞进行 扩增培养。
[0057] 优选情况下，所述体外诱导的实施方式包括：将所述第二阶段感染培养的细胞培 养于所述第二NKT细胞培养液中，所述扩增培养的实施方式包括：将细胞培养于所述第一 NKT细胞培养液中。第一 NKT细胞培养液和第二NKT细胞培养液的具体组成可参见前述相 应内容，在此不再寶述。
[0058] 具体地，感染NKT细胞的方法还包括：将第二阶段感染培养后获得的慢病毒感染 的NKT细胞用IL-2的终浓度为300-700U/mL的GT-T551培养液进行体外诱导，待细胞的密 度为80-90%时将细胞转入细胞培养袋中，隔1.5-2.5天加入比-2的终浓度为300-70011/ mL、CD3单克隆抗体的终浓度为30-7化g/ml、白细胞介素-15的终浓度为30-7化g/mL的 新鲜GT-T551培养液进行扩增培养并将细胞扩增至总量为1 X 109-2X IO9个细胞。经过 本发明的慢病毒对祀向CD20抗原的嵌合抗原受体进行MT细胞感染，其感染效率高达 30 % -60 %，而获得的CAR20-NKT细胞，其CD3+CD56+细胞占总CD3 +细胞的比率在15 % -40 % 范围之内。
[0059] 嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细胞表达的嵌合抗原受体 的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本领域技术人员应该理解的是，嵌合抗原受 体前体蛋白由大鼠生长激素信号肤、CD20ScFv、CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信 号结构域和CD3 C的胞内信号结构域串联构成，蛋白质翻译后在细胞内粗面型内质网切除 信号肤后成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后并定位于NKT细胞的细胞膜上。该嵌合 抗原受体的蛋白氨基酸序列对应的基因编码序列如SEQID NO. 2所示。该嵌合抗原受体W 基因CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3 C的胞内信号结构域串联而成的结构为信号 传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，对应的基因编码序列如SEQID NO. 10所示。
[0060] 本发明还提供了上述方法制备得到的工程化CD20祀向性的NKT细胞。
[0061] 本发明还提供了工程化CD20祀向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的 应用。优选情况下，肿瘤是CD20阳性的恶性肿瘤，进一步优选地，所述肿瘤为进展期CD20 阳性的B细胞淋己瘤。
[0062] 本发明的应用中，本领域技术人员应该理解的是，进展期CD20阳性的B细胞淋己 瘤是指淋己瘤病灶进行性增大的B细胞淋己瘤，症状表现为：全身淋己结及结外病灶受累 等，优选为非霍奇金淋己瘤。
[0063] 本发明的应用中，对于用于治疗CD20阳性的肿瘤的制剂的组成没有特别的限 定，只要含有本发明所述CAR20-NKT细胞或是由CAR20-NKT细胞制备而成即可，制剂的具体 组成和制备方法为本领域技术人员所公知，在此不再寶述。
[0064] 实施例
[0065] W下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0066] W下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所 用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：
[0067] NKT细胞培养基GT-T551购自TaKaRa公司。
[0068] 淋己细胞分离液购自T抓公司。
[0069] CD3单克隆抗体、重组纤维连接蛋白（retronectin)均购自TaKaRa公司。
[0070] 重组人蛋白干扰素-丫、重组人白介素2、重组人白介素15均购自protech公司。
[007U 总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶（PHmeSTA民K HS DNA Polymerase)、T4DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司。
[0072] Reve;rtAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 购自 F'ermentas 公司。
[0073] Bgl II、EcoRI、MluI、BamHI、NdeI、EcoR V购自 Fermentas 公司。
[0074] 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天 根生化科技有限公司。
[00巧]pWP化-GFP、PSPAX2、pMD2. G 均购自 Addgene 公司。
[0076] pGSI购自北京天一辉远生物科技有限公司。
[0077] Transl-Tl Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公 司。
[0078] Lipofectamine?2000 Transfection Reagent 转染试剂购自 Invitrogen 公司。
[0079] 293T包装细胞购自美国ATCC。
[0080] 阳Geooo-NaCl中阳G6000终浓度为25. 5质量％，化Cl终浓度为1. 2M，阳G6000 和化Cl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。
[0081] 胎牛血清购自德国PAA公司。
[008引 CD20阳性的B细胞淋己瘤细胞系Raji购自美国ATCC公司。
[0083] 5-簇基巧光素班巧酷亚胺醋购自上海谱振生物科技有限公司。
[0084] 膜联蛋白V-R阳试剂盒购自美国抓公司。
[0085] 所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
[0086] 实施例1NKT细胞的制备
[0087] (1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋己细胞分离液，通过密度梯度离屯、方 法分离获得单个核细胞（PBMCs)。
[0088] 似PBMCs洗；次后，采用含有0. 6体积％的人自体血清的NKT细胞培养基 GT-巧51调整细胞终浓度为2 X IO6个细胞/mL ;将细胞接种于预先经过终浓度为10 y g/mL 的retronectin包被的75cm2细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为500U/mL的重 组人白介素 2、50ng/ml CD3单克隆抗体和50ng/mL的重组人白介素 -15,在37°C、饱和湿度 为5 %的C〇2培养箱中培养。
[0089] (3)培养第4天，将细胞转移至未包被的培养瓶中，每2天按照细胞生长数量加入 NKT细胞培养基GT-T551，控制细胞浓度为1 X IO8个细胞/mU并加入终浓度为500U/ml的 重组人白介素2 ;培养至第12天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。结 果见图 1，其中 CD3+:95. 04% ;CD3+CD8+:90. 99% ;CD3+CD56+:24. 12% ;CD8+CD56+:24. 63%。
[0090] 实施例2慢病毒表达载体pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的构建
[0091] (1) NKT 细胞 cDNA 的制备
[0092] 离屯、沉淀实施例1培养得到的NKT细胞，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent提 取细胞的总RNA，-80°C保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevedAid?First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录得MT细胞cDNA，-20 °C保存备用。
[0093] (2)慢病毒质粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的制备
[0094] 会成了引物!皮方Il r甘出了书Il純*完。电化拍芯成昔古祐电而白切位点）.
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107] W步骤（I)中MT细胞cDNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR扩增，得到长28化P 的CD8的hinge区和跨膜区，核巧酸序列如SEQID NO. 3所示，两端分别含有MluI和Bgl II 酶切位点和保护碱基；用引物P3和P4进行PCR扩增，得到长146bp的CD137胞内信号结构 域，核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，两端分别含有Bgl II和EcoRI酶切位点及保护碱基；用 引物P5和P6进行PCR扩增，得到长359bp的CD3 C的胞内信号结构域，核巧酸序列如SEQID NO. 5所示，两端分别含有EcoRI和NdeI酶切位点及保护碱基。各步PCR扩增反应体系相 同，W扩增CD137胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照班6沒了冷裝? 服DNA Polymerase的说明书，反应体系巧OyL)如下：
[010引 双蒸水：32. SliL
[0109] 5 X 反应 buffer : IOy L
[0110] dNTP 混合物（每种 2. 5mM) :4 y L [01川 P3 (IOmM)=Iy L
[0…]P4 (IOmM)=Iy L
[0113] NKT 细胞 cDNA (200ng/ul) : 1 y L
[0114] PnmeSTA民'1、HS DNA Polymerase :0. 5 Ji L
[0115] 将上述PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进 行DNA片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒 回收备用。
[0116] 慢病毒表达载体pWP化-GFP用Mlul/Ndel双酶切，酶切产物经1 %的琼脂糖凝胶进 行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、CD137、 CD3 C片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化Transl-Tl Phage Resistant化学感受 态细胞，37°C培养1化后挑取单克隆，37°C，250巧m培养1化后用质粒小提试剂盒提取质 粒。提取的质粒经限制性内切酶MluI和NdeI双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2,其中，Ml : DNA分子量标记D15000 ;1泳道：质粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的未酶切片段；2泳道：质粒 pWP化-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（75化P) ;M2 :DNA分子量标记D2000。将鉴定正确的质 粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的 重组质粒命名为pWP化-CD8-CD137-CD3C，其中，CD8的hinge区和跨膜区的核巧酸序列如 SEQID NO. 3所示，CD137的胞内信号结构域的核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，CD3 C的胞 内信号结构域的核巧酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0117] (3)慢病毒质粒 pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 的制备
[0118] 全基因合成编码大鼠生长激素信号肤和CD20ScFv融合基因的核巧酸序列，序列 如SEQID NO. 8所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5'端含有BamHI、kozak序 列，3'端含有MluI酶切位点，将前述融合基因克隆在质粒pGSI中，命名为pGSI-CD20ScFv。 质粒经BamHI/MluI双酶切，酶切产物经I %琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒回收目的片段备用。
[0119] pWP)(L-CD8-CD137-CD3 C质粒经限制性内切酶BamHI/MluI酶切，酶切产物经1 % 琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收的含 有大鼠生长激素信号肤和CD20 ScFv的DNA片段通过T4DNA连接酶进行连接，具体方法见 说明书。将连接产物转化化ansl-Tl Phage Resistant化学感受态细胞，37°C培养1化后 挑取单克隆，37°C，250巧m培养1化后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制 性内切酶BamHI/Ndel双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，其中，其中，Ml :DNA分子量标记 D15000 ;1 泳道：质粒 pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 未酶切片段（1119化P) ;2 泳道： 质粒 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3C 的酶切片段（1300bp) ;M2:DNA 分子量标记 D2000。 将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将 测序结果正确的重组质粒命名为pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C，其结构示意图如图4 所示，其中包括大鼠生长激素信号肤（核巧酸序列如SEQID NO. 6所示）、抗CD20单链抗体 (核巧酸序列如SEQID NO. 7所示）、CD8的hinge区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和 CD3 C的胞内信号结构域，其中，该嵌合抗原受体W基因CD8的hinge区和跨膜区及CD137 和CD3 C的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，对应的基因编码序列如SEQID NO. 10所示。
[0120] 实施例3嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细胞的制备
[0121] (1)慢病毒的包装和浓缩
[0122] 用分光光度计分别测定慢病毒表达质粒pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C和 辅助质粒PSPAX2、PMD2.G的浓度，S种质粒W 4:2:1的质量比用Lipofectamine?2000 Transfection Reagent转染试剂共转染293T包装细胞。分别在转染4她、7化时收集病毒 上清于50血EP管中，4°C，2000g离屯、lOmin，转移两次得到的上清至新EP管中，用4. 5 y m 滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5X阳Geooo-NaCl按照4:1的体积比混匀，4°C静置 2h，然后4°C，1000 Og离屯、20min，弃上清，沉淀用1血的4°C预冷的无菌PBS溶解，即得嵌合 抗原受体的病毒浓缩液，按每管100 y L进行分装，-80°C保存备用。
[0123] 按照上述方法，利用慢病毒表达质粒pWP化-GFP和辅助质粒PSPAX2、pMD2. G共转 染293T包装细胞，收集病毒上清，浓缩，获得表达GFP绿色巧光蛋白的慢病毒浓缩液。
[0124] (2)慢病毒感染NKT细胞及感染后细胞的扩增培养
[01巧]取实施例1的在75cm2培养瓶中培养的IX 10 7个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入 2血新鲜NKT细胞培养基GT-T551、200 y L步骤（1)得到的病毒浓缩液、2 y L 1 X 10 6mg/mL 鱼精蛋白，终浓度为500U/mL的重组人白介素2,置于37°C、饱和湿度为5 %的C〇2培养箱中 感染12小时后，弃培养液。同时用表达GFP绿色巧光蛋白的慢病毒浓缩液对NKT细胞进行 同步感染（得到的NKT细胞称为CART-GFP细胞），用于计算该病毒的感染效率。将感染后 的细胞转至未经CD3和retronectin包被的75cm2培养瓶中，加入20血的NKT细胞培养基 GT-T551，再加入终浓度为500U/mL的重组人白介素2、终浓度为50ng/ml的CD3单克隆抗体 和终浓度为50ng/mL的重组人白介素15,于37°C、饱和湿度为5%的C〇2培养箱中培养1她， 得到的NKT细胞称为CAR20-NKT细胞。用相同的方法制备CAR20-T细胞灯细胞的制备方法 参貝胥文南犬：Yajin邑 Zhan邑，et al. Autologous CIK Cell Immunotherapy in Patients with Renal Cell Carcinoma after Radical Nephrectomy. Clinical Study, 2013 中 2. 4 部分 CIK细胞的制备方法）。用流式细胞术检测该病毒的感染效率，结果如图5所示，CAR20-NKT 细胞的感染效率为54. 13%。
[0126] (3)体外诱导扩增CAR20-NKT细胞群
[0127] 将上述培养后的NKT细胞用重组人白介素2的终浓度为500U/mL的NKT细胞培 养基GT-T551进行体外诱导，待细胞的密度为85%时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加 入重组人白介素2的终浓度为500U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为50ng/ml、重组人白介 素15的终浓度为50ng/mL的新鲜NKT细胞培养基GT-T551进行扩增培养，待细胞扩增到总 量为1. 5X109个细胞左右后，采用流式细胞仪对感染的细胞群体进行鉴定，细胞表型一般 达到CD3阳性细胞比例> 90% ;CD3CD8双阳性细胞比例〉70% ;CD3CD56双阳性细胞比例 〉15%，结果见图 6，CD3+:96. 9%;CD3 +CD4+:39. 37%;CD3 +CD8+:72. 85%;CD3 +CD56+:16. 22%; CD8+CD56+:6. 62%。
[0128] 实施例4 CAR20-NKT细胞对CD20阳性的B细胞淋己瘤细胞杀伤作用的细胞毒性 分析
[0129] 分别取实施例3中制备的CAR20-NKT细胞、CAR20-T细胞和实施例1中培养的NKT 细胞接种于96孔板，用5-簇基巧光素班巧酷亚胺醋（WS巧进行染色，与CD20阳性的B细 胞淋己瘤细胞Raji细胞W效祀比（杀伤细胞：祀细胞）5:1，10:1，20:1，40:1的比率进行共 培养，经过24小时的共培养后，将细胞用膜联蛋白V-R阳试剂盒染色，同时设置对照组分别 为未加入免疫细胞杀伤处理的Raji细胞，并将细胞用膜联蛋白V-R阳试剂盒染色。流式细 胞术对细胞调亡进行检测，细胞调亡的量根据下面的公式计算：调亡率=(对照-样品）/ 对照X100%，对照为未加免疫细胞杀伤处理的细胞存活数目；样品为加入相对应的效祀 比（杀伤细胞：祀细胞）的免疫细胞杀伤处理的细胞存活数目，见图7。由图7可知，嵌合 抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修饰的NKT细胞对CD20阳性的B细胞淋己瘤细胞具 有特异杀伤活性，且CAR20-NKT细胞的特异杀伤活性明显优于CAR20-T细胞和NKT细胞。
[0130] 实施例5 CAR20-NKT细胞对进展期CD20阳性B细胞淋己瘤患者的治疗效果
[013U 取 5 X IO8个 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 修饰的 NKT 细胞（即 CAR CD20-NKT 细 胞），经过100mL生理盐水稀释后，连续=天静脉回输到进展期CD20阳性的恶性B细胞淋 己瘤患者（在利用本发明的CAR20-NKT细胞进行祀向免疫治疗前，已经过多次治疗（如放 疗、化疗及其他药物对症治疗等），但均无明显疗效）体内，回输后对患者的治疗状况进行 评估。
[0132] 图8为流式细胞术检测CAR20-NKT细胞回输至9例进展期CD20阳性的B细胞淋 己瘤患者中，CAR20-NKT细胞在患者外周血中的持续存在时间曲线图。图8结果显示，9例 患者经过CAR20-NKT细胞祀向免疫治疗后，CAR20-NKT细胞在患者的外周血中均呈现高水 平的拷贝数，并在1个月内持续存在（转基因拷贝数在100/ y g曲NA W上），甚至能够在长 达270天的时间内持续存在，说明CAR20-NKT细胞能够在进展期CD20阳性的B细胞淋己瘤 患者体内大量的增殖来发挥杀伤活性。
[0133] 图9为本发明的CAR20-NKT细胞对第4例进展期CD20阳性的B细胞淋己瘤患者 治疗前与治疗后3个月PET-CT的对比图。图9结果显示，肿大淋己结消失（具体见箭头所 示）。说明CAR20-NKT细胞能够对进展期CD20阳性的B细胞淋己瘤患者发挥有效的治疗效 果。
[0134] W上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可W对本发明的技术方案进行多种简单变型，运 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0135] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可W通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0136] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可W进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ， 包括串联的大鼠生长激素信号肽、⑶20ScFv、⑶8的铰链区和跨膜区、⑶137的胞内信号结 构域和CD3G的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO. 1所示的氨 基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因，优选地，所述基因具有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列，进一步优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. 含有权利要求2所述的基因的重组表达载体，优选地，所述重组表达载体为慢病毒 表达载体，进一步优选地，所述慢病毒表达载体为PWPXL-⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。4. 一种工程化CD20靶向性的NKT细胞，其特征在于，所述NKT细胞是由权利要求1所 述的嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。5. -种工程化⑶20靶向性的NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括： 包装携带PWPXL-⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的 病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法还包括通过如下方法制备NKT细胞： (1) 在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段 培养；优选地，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一 NKT细胞培养 液中，所述第一 NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介素-2和白介 素-15 ;进一步优选地，第一 NKT细胞培养液中，所述⑶3单克隆抗体的浓度为30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mL，和/或所述白介素-15的浓度为30-70ng/ mL ； (2) 在白介素-2存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养；优选地，所 述第二阶段培养的实施方式包括：将所述第一阶段培养的细胞培养于第二NKT细胞培养液 中，所述第二NKT细胞培养液中含有NKT细胞培养基和白介素-2 ;进一步优选地，第二NKT 细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT细胞的方法包括： (1) 在病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2存在下，将NKT细胞进行第一阶段感染培养； 优选地，所述第一阶段感染培养的实施方式包括：将NKT细胞培养于第三NKT细胞培养液 中，所述第三NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2 ;进 一步优选地，第三NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL ; (2) 在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将所述第一阶段感染培养的细 胞进行第二阶段感染培养；优选地，所述第二阶段感染培养的实施方式包括：将所述第一 阶段感染培养的细胞培养于所述第一 NKT细胞培养液中。8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT细胞的方法还包括： (3) 先在白介素-2存在下，将所述第二阶段感染培养的细胞进行体外诱导，待细胞的 密度为80-90%时，再在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将细胞进行扩增 培养；优选地，所述体外诱导的实施方式包括：将所述第二阶段感染培养的细胞培养于所 述第二NKT细胞培养液中，所述扩增培养的实施方式包括：将细胞培养于所述第一 NKT细胞 培养液中。9. 权利要求5-8中任意一项所述方法制备得到的工程化CD20靶向性的NKT细胞。10.权利要求4或9所述的工程化CD20靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制 剂中的应用，优选地，所述肿瘤是CD20阳性的恶性肿瘤，进一步优选地，所述肿瘤为进展期 ⑶20阳性B细胞淋巴瘤。
【文档编号】A61K39/00GK105924530SQ201510671924
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2015年10月13日
【发明人】伍志强, 韩为东, 王晓慧, 王瑶, 郭业磊, 代汉仁, 张文英
【申请人】中国人民解放军总医院