Car-cd19抗原受体的人源化融合基因片段、其构建方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段、其构建方法及应用，属于生物技术和细胞治疗技术领域。一种CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段，为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。发明有效避免了鼠源CD19基因导致的人抗鼠抗体的产生。CAR-hCD19嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞在特异识CD19阳性的肿瘤细胞后，可以在短期内有效杀死肿瘤细胞，可用于治疗CD19阳性的B淋巴细胞白血病或B淋巴细胞瘤，且没有明显的毒副作用。
【专利说明】
CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段、其构建方法及 应用
技术领域
[0001] 本发明公开了一种CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段、其构建方法及应 用，属于生物技术和细胞治疗技术领域。
【背景技术】
[0002] 白血病，俗称"血癌"，是一种造血组织的恶性疾病，其主要原因是造血细胞的某一 系列、或者是某一白细胞系列的前体细胞失去分化成熟能力，在骨髓和其他造血组织中呈 恶性克隆性增生、积聚，并侵犯其他人体器官，比如:肝、脾、淋巴结，最终造成全身组织、器 官的破坏，使正常造血功能受到抑制。与固体肿瘤所不同的是，白血病不是生长在某个局部 器官，而是随着血液系统分布在全身，因此会影响到人体各个系统、器官和组织的恶性病。 白血病约占肿瘤总发病率的3%左右，是我国十大高发恶性肿瘤之一，其中男性多于女性。 在儿童和青年中最常见，是儿科恶性肿瘤发病率中排名第一。早期白血病治疗主要以化疗 为主，对于中晚期白血病患者，主要的治疗方法有化疗、骨髓移植。虽然骨髓移植是中晚期 白血病最为有效的治疗方法，但其亦存在着价格昂贵、骨髓源少的缺点。
[0003] 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞技术是近年来发展非常 迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术，效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均 较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。
[0004] 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是由抗原特异性的受体(如单 链抗体scFv)，间隔序列（spacer)，跨膜序列(TM Domain)和胞内共刺激信号分子组成。间隔 序列可以是111861、111864、1118〇、007或0)8等，跨膜序列可以是0)3(工04、007、0)8、？6￡1?1 Y、H2-Kb等。胞内共刺激信号分子可以是0)28、0)134、0)137、0)244^6￡1?1、（3)3(等。根据 胞内共刺激信号分子的组成的差异，CAR被分为三代。第一代CAR仅含有一个胞内的信号分 子，第二代含有两个共刺激信号分子，第三代含有三个共刺激信号分子。CAR修饰的T淋巴细 胞在体内能够通过其单链抗体特异的识别相关肿瘤表面抗原，然后通过胞内共刺激信号分 子将识别的信号传递到细胞内，激活T淋巴细胞的杀伤性，杀伤肿瘤细胞。
[0005] B淋巴细胞抗原⑶19,又称⑶19,是一种属于Ig超家族成员的穿膜糖蛋白，其广泛 分布于不同时期B细胞表面，包括前B细胞，不成熟B细胞，成熟B细胞，活化B细胞。另外，CD19 被大部分B细胞恶性肿瘤(例如，慢性淋巴性白血病，急性淋巴性帕血病和弥漫性大B细胞 淋巴癌等)所表达，但并不分布于骨髓中干细胞上，因此B细胞恶性肿瘤的理想肿瘤靶点。目 前CAR-T技术中所应用的CD 19抗原受体是采用鼠源基因，例如鼠源单克隆抗体FMC63，但是 此类鼠源基因片段在治疗人类疾病过程中有引起人抗鼠抗体(HAMA，Human anti-mouse antibodies)的产生的可能性，因此人源化整个基因片段就显得非常重要。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种CAR-CD19抗原受体的人源化融合基 因片段。
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是提供上述融合基因片段及含有该片段的载体 的构建方法。
[0008] 本发明要解决的第三个技术问题是提供上述融合基因片段及含有该片段的载体 的用途。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] -种CAR-抗原受体的人源化融合基因片段，由氮端到碳端顺次拼接人源化的抗原 scFv序列、CD28链接区序列、CD28跨膜蛋白区序列和信号结构域序列。
[0011] 所述抗原scFv序列的"抗原"包括但不限于CD 10，CD 19，CD20，CD22，CD24，CD30， CD33，CD38，CD39，CD133，CD138，本发明优选 CD19。
[0012] 所述"信号结构域序列"包括但不限于CD3_zeta序列、FC ε RI γ，CD28,4_1BB (CD137)，0X-40(CD134)中的一种或几种，安全自杀基因，如FKBPCasp9等。该信号结构域序 列可以任意组合。本发明选用⑶3-zeta序列。
[0013] -种CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段，由氮端到碳端顺次拼接人源化的 ⑶19scFv序列、⑶28链接区序列、⑶28跨膜蛋白区序列、⑶28细胞质内蛋白区序列和⑶3-zeta序列。
[0014] 所述CAR-⑶19抗原受体的人源化融合基因片段（即CAR-h⑶19融合基因片段)为序 列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0015] 本发明为了减小载体质粒的大小，进而增加转染和病毒的生产效率，人源化融合 基因片段中的某些位点被人为的进行了删减，这样既有效的缩短了整个基因的序列，同时 保持了完整的融合蛋白的二级和三级结构，保留了其有效的抗原识别性、同时提高了细胞 毒性。
[0016] 含有并表达所述的CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体。所述载体是 指能把所携带的基因片段在细胞内表达的各种病毒及质粒，既包括永久性整合进细胞基因 组中的，也包括在细胞内只能短暂表达的载体。所述载体包括但不限于病毒、质粒或RNA;所 述病毒为慢病毒、腺病毒、腺联病毒或反转录病毒或其他本领域常用病毒载体。
[0017] -种含有CAR-⑶19抗原受体的人源化融合基因片段的载体的构建方法，包括以下 步骤：
[0018] (1)利用PCR及重叠延伸技术分别设计包含BsmI和Notl酶切位点及至少两个随机 碱基的引物，将BsmI和Notl引入hCD19抗体人源编码基因的两端，并将包含h⑶19的PCR片段 产物克隆入pGEM-T easy载体，得到pGEM-T-hCD19;
[0019] ⑵用步骤（1)同样的方法分别扩增CD28链接区序列、CD28跨膜蛋白区序列、CD28 细胞质内蛋白区序列和CD3zeta片段，按顺序整合进pGEM-T-hCD19载体中，得到包含CAR-h⑶19融合基因片段的载体；
[0020] (3)通过BsmI和Sail将整个CAR-hCD19融合基因片段插入到pHIV-EGFP真核表达载 体中，得到pcHIV-CAR-hCD19表达载体。
[0021] 所述步骤（1)中的引物为序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸 序列；步骤(2)中CAR-h⑶19融合基因片段为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0022]含有上述的CAR-h⑶19抗原受体的人源化融合基因片段的宿主细胞。
[0023] 含有CAR_hCD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体的宿主细胞。
[0024] -种治疗癌症的药物，含有CAR_hCD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体的 宿主细胞，作为活性成分制备而成的。
[0025] 所述宿主细胞为淋巴细胞。本发明携带有融合基因的载体，通过其特有的方式整 合进T淋巴细胞的基因组中，融合基因得到正确表达，形成具有识别癌症细胞所表达的特异 性抗原的scFv部分、跨膜蛋白部分及两个协同信号结构域。此时，T淋巴细胞被构造成CAR-T 淋巴细胞，因此具有特异杀伤表达某特定抗原的癌症细胞。
[0026] 所述的CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段用于制备治疗癌症的药物的用 途。
[0027] 含有CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体用于制备治疗癌症的药物 的用途。
[0028] 含有CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体的宿主细胞用于制备治疗 癌症的药物的用途。
[0029]所述癌症为⑶19阳性的B淋巴细胞白血病或B淋巴细胞瘤。
[0030] 本发明可用于治疗⑶19阳性的白血病和B淋巴细胞瘤，提供了一种新型的CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）细 胞治疗方法。
[0031] 细胞实验表明，本发明构建的含有CAD_hCD19融合基因的真核表达载体，在培养条 件下快速增值，经逆转录病毒整合到T淋巴细胞的基因组中，在T淋巴细胞表面进行表达，特 异性识别B淋巴细胞表面所表达的⑶19蛋白，进而有效杀死B淋巴细胞。经过7-10天培养后， CAR-T淋巴细胞的数量被成百上千倍地增殖，且细胞毒性达到最高。从培养环境中分离纯化 得到的CAR-hCD19 T淋巴细胞可以被冻存，在合适的时机下回输到患者体内。
[0032] 本发明的优点是:本发明设计的人源化的CAD_hCD19融合基因序列，有效避免了鼠 源CD19基因导致的人抗鼠抗体的产生。将该嵌合抗原受体转入表达载体，实现了在人淋巴 细胞表面的高效表达，将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别人CD19从而介导CD19阳 性的肿瘤细胞进行靶向杀伤的特异性淋巴细胞。其中特别优选的融合基因序列使得嵌合性 抗原受体更好地发挥作用。CAR-hCD19嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞在特异识CD19阳性的 肿瘤细胞(B淋巴细胞)后，可以在短期内有效杀死肿瘤细胞，并在患者体内长时间存在，能 有效防止病情的复发，可用于治疗CD19阳性的B淋巴细胞白血病或B淋巴细胞瘤，且没有明 显的毒副作用。
[0033]以下结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步说明，并非对本发明的限制。根 据本领域公知常识，本发明的实现方式并不仅限于实施例所公开的内容，因此凡依照本发 明技术启示所进行的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【附图说明】
[0034]图1为本发明原理图
[0035]图2为CAR-h⑶19融合基因片段设计图
[0036] 图3为CAR-h⑶19融合基因在T淋巴细胞表面的表达量图
[0037]图4为表达CAR-h⑶19融合基因的T淋巴细胞的杀伤实验结果图
【具体实施方式】
[0038]实施例1:质粒载体构建
[0039]以下实验中的DNA基因片段均由体外扩增合成，并由基因测序确定其正确序列。 [0040] 1、利用PCR及重叠延伸技术分别设计包含BsmI和Notl酶切位点及至少两个随机碱 基的引 物5 '-GGGCATTCCTCCTGATCCAGACATCCAG ( SEQ ID 1^0.2^5: AGTCAGTGGCAGAGGAGTCGCCGGCGTGG(SEQ ID No · 3)。将BsmI和Notl 引入hCD19抗体人源编码 基因的两端，并将包含hCD19的PCR片段产物克隆入pGEM-T easy载体(载体购于Promega公 司），得到 pGEM-T-hCD19;
[00411 2、用步骤（1)的方法分别扩增⑶28链接区序列、CD28跨膜蛋白区序列、⑶28细胞质 内蛋白区序列和⑶3zeta片段，按顺序整合进pGEM-T-hCD19载体中，得到包含CAR-h⑶19抗 原受体的人源化融合基因片段的载体；
[0042] 3、通过BsmI和Sail酶切位点将整个CAR-h⑶19抗原受体的人源化融合基因片段插 入到慢病毒质粒载体pHIV-EGFP(https: //www · addgene · org/21373/，addgene公司产品， Plasmid#21373)的EF-Ια启动子之后，得到pcHIV-CAR-hCD19表达载体。
[0043] 得到的CAR-hCD19核心基因片段由人源化的⑶19scFv开始，紧接其后的是⑶28链 接区、CD28跨膜蛋白区、CD28细胞质内蛋白区和由CD3-zeta组成的一级和二级信号结构域 (见图2)，CAR-h⑶19核心基因片段为序列表SEQ ID No.l所示的核苷酸序列。
[0044]实施例2:慢病毒制备
[0045]实施例1得到的载体质粒同其他慢病毒包装质粒，如包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev及包膜蛋白质粒pMD2 .G按照1 : 1 : 1 : 0.5的比例，采用转染试剂，如磷酸钙或 1^卩(^6(^3111；[116(1'1161'1]1〇?181161')等，按照具体试剂操作说明共同转染密度达到60%-70% 的293T细胞株。
[0046] 293T细胞经过转染后，在24-72小时之内，通过收集细胞上清液的形式开始收集慢 病毒载体，之后经过离心、过滤的方式浓缩、纯化慢病毒载体，最后在-80 °C条件下长期冷冻 保存。
[0047]实施例3: CAR-T细胞的制备及模型试验
[0048] 通过白细胞除去法获得的外周血细胞产品，采用密度梯度离心的方式分离外周血 单个核细胞(主要包含⑶3+的T淋巴细胞，CD19+的B淋巴细胞及少量的树突状细胞、巨噬细 胞等），培养在不含牛血清的细胞培养基中。
[0049] T淋巴细胞在体外经过⑶3/⑶28 Dynabeads(购于Thermo Fisher公司）激活和慢 病毒（1:1 -1:50的转化浓度)转导后，在合适的培养条件下快速增值。取不同时间段的细胞， 稀释浓度到 1E6细胞/100μ1 PBS，采用抗体CD3-FITC，CD19-PE(购于Becton Dickinson)根 据厂家操作建议的浓度，在冰上染色30分钟，清洗后在浓度0.5 %的多聚甲醛溶液中重新悬 浮，最后在Accuri C6流式细胞仪（购于BD公司）上进行定量分析。慢病毒所携带的CAR-hCD19融合基因经过逆转录后被永久性的整合进T淋巴细胞的基因组中，并在T淋巴细胞表 面进行表达(见图3)，并能特异性识别B淋巴细胞表面所表达的CD19蛋白，进而杀死B淋巴细 胞(见图4)。
[0050] 图3显示，分别取第5天和细胞收获之前的细胞，按照上述方法，染色细胞，并在流 式细胞仪上进行分析，显示CAR-hCD19在T淋巴细胞表面进行表达，表达细胞含量随着培养 时间增加而增高。
[0051 ]图4显示，采用密度梯度离心的方式分离外周血单个核细胞后，在第0天，第3天，第 6天，分别取细胞，按照上述方法，对⑶3+Τ细胞和⑶19+Β细胞进行流式分析。其中，Mock组为 对照组(不加病毒进行改造，不表达CAR)，Vect 〇r组为实验组(经过慢病毒改造，表达CAR+)， 1和2为两个不同人的样本组。对照组Ι-Mock和2-Mock显示，未经过慢病毒改造、不表达CAR+ 的T细胞不具有杀伤CD19+B细胞的功能，从第0天到第6天一直存在CD19+的B细胞;而实验组 Ι-Vector和2-Vector显示经过慢病毒改造、表达CAR+的T细胞具有杀伤⑶19+B细胞的功能， 从第3天开始检测不到CD19+的B细胞。
[0052]经过7-10天的培养后，T淋巴细胞的数量被成百上千倍的增值，并且细胞毒性达到 最高。最后，混合培养中的⑶3/⑶28 Dynabeads被分离出，纯化后的CAR-hCD19 T淋巴细胞 被冻存，并在合适的时机被回输到病人体内。
[0053]本发明携带有融合基因的载体，通过其特有的方式整合进T淋巴细胞的基因组中， 融合基因得到正确表达，形成具有识别癌症细胞所表达的特异性抗原的scFv部分、跨膜蛋 白部分及两个协同信号结构域。此时，T淋巴细胞被构造成CAR-T淋巴细胞，因此具有特异杀 伤表达某特定抗原的癌症细胞。
【主权项】
1. 一种CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段，其特征在于：由氮端到碳端顺次拼 接人源化的⑶19 scFv序列、⑶28链接区序列、CD28跨膜蛋白区序列、CD28细胞质内蛋白区 序列和CD3_zeta序列。2. 根据权利要求1所述的人源化融合基因片段，其特征在于:所述的基因片段为序列表 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3. 含有并表达权利要求1或2所述的CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体。4. 根据权利要求3所述的载体，其特征在于:所述载体为病毒、质粒或RNA;所述病毒为 慢病毒、腺病毒、腺联病毒或反转录病毒。5. -种含有CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体的构建方法，其特征在于 包括以下步骤： (1) 利用PCR及重叠延伸技术分别设计包含BsmI和NoU酶切位点及至少两个随机碱基 的引物，将BsmI和NotI引入h⑶19抗体人源编码基因的两端，并将包含h⑶19的PCR片段产物 克隆入pGEM-T easy载体，得到pGEM-T-hCD19; (2) 用步骤（1)的方法分别扩增CD28链接区序列、CD28跨膜蛋白区序列、CD28细胞质内 蛋白区序列和CD3zeta片段，按顺序整合进pGEM-T-hCD19载体中，得到包含CAR-hCD19融合 基因片段的载体； (3) 通过BsmI和Sail将整个CAR-hCD19融合基因片段插入到pHIV-EGFP真核表达载体 中，得到pcHIV-CAR-hCD19表达载体。6. 根据权利要求5所述的一种含有CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段的载体的 构建方法，其特征在于:所述步骤（1)中的引物为序列表SEQ ID NO.2和序列表SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列；步骤(2)中CAR-hCD19融合基因片段为序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列。7. 含有权利要求1或2所述的CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段和/或权利3或4 所述的载体的宿主细胞;所述宿主细胞为淋巴细胞。8. -种治疗癌症的药物，其特征在于:含有权利要求1或2所述的融合基因片段、或含有 权利要求3或4所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞。9. 权利要求1或2所述的CAR-CD19抗原受体的人源化融合基因片段和/或权利3或4所述 的载体和/或权利要求7所述的宿主细胞用于制备治疗癌症的药物的用途。10. 根据权利要求9所述的制备治疗癌症的药物的用途，其特征在于:所述癌症为CD19 阳性的B淋巴细胞白血病或B淋巴细胞瘤。
【文档编号】C12N5/10GK105950645SQ201610014730
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年1月11日
【发明人】荆东辉
【申请人】灏灵赛奥（天津）生物科技有限公司