嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化cd33靶向性的nkt细胞及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受 体⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因和重组表达载体、工程化⑶33靶向性的NKT细胞 (CAR33-NKT细胞）及其应用。
【背景技术】
[0002] 急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML)包括所有非淋巴细胞来源的 急性白血病，是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病，是一个具有高度异质性 的疾病群，它可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化。
[0003] ⑶33在90 %以上的急性髓系白血病患者的原始细胞表面高表达，并且白血病干 细胞表面也表达⑶33,而仅在部分正常的造血干细胞表达低水平的⑶33。在炎症及免疫应 答过程中，CD33可调控白细胞的功能，故CD33成为治疗急性髓系白血病的理想靶点。
[0004] 目前，在治疗进展期CD33阳性的急性髓系白血病患者时，CD33的单克隆抗体与化 疗结合应用已经处于临床研究阶段，但是，临床结果表明，CD33的单克隆抗体与化疗结合应 用会引起一定的耐药性和化疗抵抗。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中采用CD33的单克隆抗体与化疗结合应用治 疗进展期CD33阳性的急性髓系白血病患者时引起的耐药性和化疗抵抗的缺陷，提供一种 嵌合抗原受体⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因和重组表达载体、工程化⑶33靶向性 的NKT细胞（CAR33-NKT细胞）及其应用，嵌合抗原受体⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3ζ修饰 的NKT细胞在治疗进展期CD33阳性的急性髓系白血病时，能够有效避免采用CD33的单克 隆抗体与化疗结合应用时引起的耐药性和化疗抵抗，对白血病细胞具有一定的特异杀伤活 性。
[0006] 本发明的发明人在研究中意外发现，本发明的嵌合抗原受体 ⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ对NKT细胞具有高的感染效率，且感染后得到的CAR33-NKT细 胞在体外有高效的杀瘤活性，同时采用CAR33-NKT细胞治疗进展期CD33阳性的急性髓系白 血病时，能够有效避免采用CD33的单克隆抗体与化疗结合应用时引起的耐药性和化疗抵 抗，对白血病细胞具有一定的特异杀伤活性。
[0007] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合 抗原受体为CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，由CD33ScFv、CD8的铰链区（hinge区）和跨膜区、 CD137的胞内信号结构域和CD3 ζ的胞内信号结构域串联构成。
[0008] 第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。
[0009] 第三方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
[0010] 第四方面，本发明提供了一种工程化⑶33靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上 述嵌合抗原受体CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞。
[0011] 第五方面，本发明提供了上述工程化⑶33靶向性的NKT细胞在制备用于治疗白血 病的制剂中的应用。
[0012] 在治疗进展期CD33阳性的急性髓系白血病时，本发明的嵌合抗原受体 ⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ对NKT细胞具有高的感染效率，且感染后得到的CAR33-NKT细 胞，即工程化CD33靶向性的NKT细胞，在体外具有高效的杀瘤活性，在体内能够不依赖于 白介素2而持续长久的存在，且能够特异性结合CD33抗原，明显延长免疫细胞在患者体内 的存活时间，增强免疫细胞靶向识别急性髓系白血病细胞表面CD33抗原的能力，释放细胞 因子并加强对急性髓系白血病细胞的特异杀伤活性，而且确实能够有效避免采用CD33的 单克隆抗体与化疗结合应用时引起的耐药性和化疗抵抗。本发明的工程化CD33靶向性的 NKT细胞具有较低的毒副作用，患者具有较好的耐受性，为治疗进展期CD33阳性的急性髓 系白血病提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。
[0013] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0014] 图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。
[0015] 图2为本发明的慢病毒表达载体pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的限制性内切酶MluI/ Sail双酶切片段的电泳鉴定图。
[0016] 图3为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性内切 酶BamHI/Sall双酶切片段的电泳鉴定图。
[0017] 图4为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的结构示意 图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。
[0018] 图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的病毒浓 缩液对NKT细胞的感染效率。
[0019] 图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修饰的NKT细 胞（CAR33-NKT细胞）表型鉴定的结果。
[0020] 图7为本发明的CAR33-NKT细胞对人髓系白血病细胞的杀伤作用的细胞毒性分析 图。
[0021 ] 图8为本发明的CAR33-NKT细胞对进展期CD33阳性的急性髓系白血病患者治疗 过程中体温和白细胞数目的变化趋势图。
[0022] 图9为本发明的CAR33-NKT细胞对进展期⑶33阳性的急性髓系白血病患者治疗 前后骨髓细胞学变化。
【具体实施方式】
[0023] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0024] 本发明提供了 一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为 CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，由CD33ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构 域和CD3G的胞内信号结构域串联构成。优选情况下，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0025] 本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，编码上述嵌合抗原受 体的基因的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0026] 本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病 毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞 如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修饰的NKT 细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0027] 对于慢病毒表达载体pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的制备方法没有特 别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体 pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3G的制备方法包括以下步骤：
[0028] (1)从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞 内信号结构域和CD3G的胞内信号结构域，并克隆至载体pWPT-GFP中，构建得到 pWPT-CD8-CD137-CD3G ;
[0029] (2)合成编码大鼠生长激素信号肽和⑶33ScFv的核苷酸序 列，并克隆至PWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ中，经测序验证后得到序列正确的 pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0030] 步骤（1)中，对于从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的 胞内信号结构域和CD3 ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的 各种方法，例如可以为RT-PCR法。其中，NKT细胞可以通过分离人静脉血中的单个核细胞， 然后进行培养获得。
[0031] 具体地，得到pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的方法可以包括：提取NKT细胞的总RNA， 逆转录获得NKT细胞cDNA，以得到的NKT细胞cDNA为模板，利用引物Pl (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)进行PCR扩增获得CD8基因的hinge区和跨膜区（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQ