一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种SCFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病病 毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种以破坏鸡免疫中枢器官一法氏 囊为特征的急性、高度接触性传染病，具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的 特点。该病目前已遍布全球各地，是危害养鸡业的主要疫病之一，并且因免疫失败而造成的 经济损失巨大。
[0003] IBDV可在雏鸡法氏囊中的淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞中迅速繁殖，导致免疫抑 制，从而可增强机体对其它病原体的易感性并且降低对其它疫苗的反应性。抗体药物目前 是有效的治疗药物，高免血清和卵黄抗体在发病早期均可起到良好的效果，但是由于工业 化生产可控性差和存在水平传播疾病等原因而受到限。本发明利用抗原-抗体共表达的细 菌展示技术筛选获得了具有较高中和活性的scFv抗体。抗体药物抗病毒的中和活性与治 疗效果成正比，中和活性越高，其治疗效果越好。本发明提供的scFv抗体的中和活性明显 提高，将具有较好的治疗效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应 用。该scFv抗体的中和活性比已授专利权的scFv-A抗体(专利"scFv抗体、其编码基因及 其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用"中的scFv抗体在此专利中命名为 scFv-A抗体）高10倍以上，在预防及治疗IBD将具有更好的效果。该scFv抗体与scFv-A 抗体的核苷酸的同源性为88. 71%，氨基酸的同源性为78%，说明两株scFv是完全不同的两 种抗体。
[0005] 本发明提供了一种单链抗体，命名为scFv-GD抗体，包括由重链可变区、轻链可变 区以及它们之间的连接区组成； 所述重链可变区为如下（a)或（b): (a)由序列表中序列1自N末端第1-128位氨基酸 残基组成的蛋白质；（b)将（a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有相同活性的由其衍生的蛋白质； 所述轻链可变区为如下（c)或（d): (c)由序列表中序列1自N末端第144-249位氨基 酸残基组成的蛋白质；（d)将（c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
[0006] 所述单链抗体具体可为如下（e)或（f):(e)由序列表中序列1所示的蛋白质；（f) 将（e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍 生的蛋白质。
[0007] 编码所述单链抗体的基因也属于本发明的保护范围。
[0008] 所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1)或（2)或（3) : (1)序列 表的序列2自5'末端第1-384位核苷酸所示的DNA分子；（2)在严格条件下与（1)限定的 DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3 )与（1)限定的DNA序列至少具有 90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0009] 所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（4)或（5)或（6) : (4)序列 表的序列2自5'末端第430-747位核苷酸所示的DNA分子；（5)在严格条件下与（4)限定 的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)与（4)限定的DNA序列至少 具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0010] 所述基因具体可为如下（7)或（8)或（9)或（10): (7)序列表的序列2自5'末端 第1-747位核苷酸所TK的DNA分子；（8)序列表的序列2所TK的DNA分子；（9)在严格条件 下与（7)或（8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)与（7) 或（8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0011] 上述严格条件可为在6 X SSC，0.5% SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2 X SSC、 0· 1% SDS 和 1XSSC、0. 1% SDS 各洗膜一次。
[0012] 含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。
[0013] 基于所述单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的 抗体可为Fab形式的抗体、IgG形式的抗体等。
[0014] 本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用；所述产 品的功能为如下（I )、（II)或(III)或（IV) :( I )检测鸡传染性法氏囊病病毒；（II)辅助鉴 定鸡传染性法氏囊病病毒；（III)预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（IV)预防和/或治疗 由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
[0015] 含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述 产品的功能为如下（I )、（ II)或(ΠΙ)或(IV) : ( I )检测鸡传染性法氏囊病病毒；（II)辅助 鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（III)预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（IV)预防和/或治 疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
[0016] 本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定鸡传染性法氏囊 病病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。
[0017] 本发明提供了一种单链抗体（即ScFv-GD抗体)，ScFv-GD抗体具有与VP2蛋白及 多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生CPE且其中和活性 比已授专利权的scFv-A抗体高10倍以上。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁 琐、生产成本高、效果不稳定、工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发 明提供的scFv-⑶抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好，工业化生产质量可 控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点。
【附图说明】
[0018] 图1为scFv-⑶抗体溶液的SDS-PAGE图谱。
[0019] 图2为scFv-⑶抗体溶液的SEC-HPLC图谱。
[0020] 图3为ELISA检测scFv-GD抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力的结果。
[0021] 图4为ELISA检测scFv-GD抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力的结果。
【具体实施方式】
[0022] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0023] pET_27b (+)载体：购自 Novagen 公司，Cat. No. 69337-3。大肠杆菌 Rosetta :购 自Novagen公司，Cat. No. 71403-4。DFl细胞(鸡成纤维细胞）：购自中国科学院上海生命 科学研究院细胞资源中心，Cat. No. 3131C0001000400030。SPF雏鸡：购自哈尔滨兽医研究 所。鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株)，购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。
[0024] 鸡传染性法氏囊病活疫苗（Gt株):哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染 性法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株）：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传 染性法氏囊病活疫苗（1-65株):Shafit InterGumboro,编号S20651010A。鸡传染性法氏囊 病活疫苗（BJ836株）：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活 疫苗（MB株）：ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）：湖南省中岸生物 药业有限公司，编号180022026。
[0025] 质粒pHisSUMO:参考文献：姜媛媛，尹成凯，李晋南，任桂萍，张薇，李德 山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报，2008， 39(10): 57-62;李璐，尹成凯，李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体-- pHisSUMO.生物技术，2009，19(3): 11-14·。
[0026] 包被液（pH9. 6):取 Na2CO3 0. 15g、NaHC03 0 . 29 3g，溶于水并用水定容至 100mL。
[0027] PBS 缓冲液：取 NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4. 12H20 3. 58g、KH2PO4 0· 24g，溶于 IL 水。
[0028] 实施例1、scFv-GD抗体(单链抗体）及其编码基因的发现 1、抗体库的构建 取IBDV免疫后的鸡脾脏，提取RNA后反转录成cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设 计出克隆抗体可变区的基因引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。将VH 与VL片段分别插入到pTlinker载体的Linker的上游和下游，构建出scFv抗体库。将scFv 抗体库进行酶切并与细菌展示载体pBFD-Ab-VP2进行连接，构建抗IBDV抗原抗体共表达的 细菌表面展示文库。VH 约 380bp、VL 约 320bp，VH-Tlinker-VL 约 740bp。
[0029] 2、抗体库的筛选 收集转化后全部克隆，经I