专利名称：一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及兽用生物制品制备领域，具体涉及一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起的一种急性上呼吸道传染病，主要特征为面部肿胀、鼻腔有浆液性或粘液性分泌物、结膜炎，发病率很高，可以引起育成鸡生长停滞和蛋鸡产蛋量显著下降(产蛋减少10 40% )，8 12周龄的鸡和蛋鸡最常发生。此病分布于全世界，使育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，蛋鸡产蛋量明显减少，给养鸡业造成巨大的经济损失。此病可采用敏感药物治疗，但极易产生耐药性，病情常反复发作，无法从根本上消除带菌状态。据调查，选用免疫原性较好的菌株制作疫苗进行积极预防是控制本病的有效途径。目前，国内外生物制品厂家生产的鸡传染性鼻炎疫苗均为油乳剂灭活疫苗，但油乳剂灭活疫苗存在粘度大难注射、矿物油难吸收、注射局部易发生肿胀、免疫产生时间长、 免疫持续期短等缺点，亟待需要寻求一种易吸收、无毒副作用、效果好的新型佐剂疫苗来防治该病。杨树皮类脂系从杨树皮中提取的一种橙黄色脂溶性物质，具有高度的天然生物学活性，富含大量的磷脂、留醇、不饱和脂肪酸、糖脂以及多种常量、微量元素、多种维生素、18 种必需氨基酸等。其中杨树皮类脂中含有的多糖类、有机酸、留醇、甙类、黄酮类物质在动物体内协调统一，可以大大提高动物体的免疫机能。多糖类具有促胸腺体液反应、刺激网状内皮系统，提高机体特异性免疫反应能力；有机酸具有增强机体免疫功能的作用，能够刺激和促进单核吞噬细胞功能，对抗免疫抑制对免疫器官的抑制作用；甙类能够加速抗体的产生、 促进淋巴细胞转化和增强网状内皮系统功能等作用。国内也有用类脂做为佐剂制备疫苗的报道，其中，专利号为ZL03142556. 9的发明专利公开了杨树皮类脂做为疫苗佐剂的使用方法，(1) 500 1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮类脂佐剂， 使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4 6% (W/V) ； ( 将上述混合物通过乳化压力为10 15MPa，剪切压力为45 60MPa的均质机内乳化，乳化温度在20 30°C之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。使用该方法制得的疫苗效果好，但类脂含量高、制造成本高， 且免疫持续时间不长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有灭活疫苗的缺陷，提供一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，采用本发明所制备的疫苗容易吸收、无毒副作用、免疫产生时间短、免疫持续期长、免疫效果好，能有效防控鸡传染性鼻炎，且制造成本低。本发明是这样实现的，一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤
(I)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，包括如下步骤一级菌种制备取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在(X)2体积含量为5%、温度为37°C环境中培养16 18h，挑选符合菌株特性的直径为Imm的3 5个典型菌落用IOml灭菌鸡肉汤稀释后接种到6 7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种 0. anl，在37°C条件下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种，置于-20°C以下保存，不得超过30天；二级菌种制备取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37°C条件下培养17 18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2-8°C保存，不得超过6 他；制苗用菌液的制备将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37-38°C温室中静止培养18 20h，期间每隔6 他摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活Mh，得到制苗用菌液；菌液的浓缩与灭活将纯粹检验合格的制苗用菌液进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积 1/10000的硫柳汞，混勻后在4°C条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液；( C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同；(3)疫苗的制备取上述制备的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1 1的比例混合后倒入乳化罐内，用混合机以750 850r/min的转速搅拌，同时再加入杨树皮类脂，加入杨树皮类脂速度不能快，使杨树皮类脂液在混合物中的最终体积百分比浓度为2. 0 3. 8%，然后将混合机的转速提高到2500 3000r/min继续乳化30 60分钟，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最终含菌量均为 10 亿 cfu/ml ；上述鸡肉汤琼脂板是这样制备的取鸡肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化钠0. 5g、琼脂粉1. 5g混合，用4mol/L NaOH溶液调节混合溶液的PH至7. 4，116°C灭菌30分钟，倒板前加入辅酶I (NADH)和过滤除菌的健康鸡血清混勻，使得混合溶液中辅酶I(NADH)的质量浓度为0. 05%、过滤除菌的健康鸡血清的体积百分比浓度为10%，然后将混合溶液倒入直径为90mm的平皿中，放平冷却即得到鸡肉汤琼脂板；所述鸡肉汁是取鸡胸脯肉泥1重量份加入蒸馏水4重量份，4°C浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤得到的；上述半合成培养基是这样制备的取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g，放入IOOOml纯化水中搅均，调节所得溶液的PH至7. 2 7. 4，116°C灭菌40分钟，临用前加入60ml的灭活健康鸡血清和IOml的浓度为0. 5%的辅酶 I (NADH)水溶液。在上述的菌液的浓缩与灭活中，浓缩采用高速离心方法、中空纤维过滤方法或超滤浓缩方法中的任意一种。本发明优选的浓缩采用超滤浓缩方法。上述副鸡嗜血杆菌菌株为A型C-Hpg-8株(编号为CVCC 254)和C型Hpg-668株(编号为CVCC 256)，均来源于中国兽医药品监察所；上述佐剂杨树皮类脂来源于美科尔 (河北)生物技术有限公司。用比浊法测定含菌量。纯粹检验，按《中华人民共和国兽药典》方法进行，纯粹、无杂菌生长为合格。无菌检验，按《中华人民共和国兽药典》方法进行，无杂菌生长为合格。本发明的有益效果是，本发明将具有高度生物学活性的杨树皮类脂作为佐剂制备鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗，给鸡注射后在机体内能够被很好的吸收，无残留，对注射局部无任何不良反应。因注射应激小，产蛋高峰期注射不会影响产蛋率。与现有技术相比，本发明的鸡传染性鼻炎制备疫苗时减少了杨树皮类脂的用量，降低了疫苗生产成本，采用混合机制备疫苗，减化了生产工艺流程，提高了疫苗的物理稳定性，延长了疫苗的保存期。另外由于本疫苗中含有大量的Ve等可提高产蛋率的营养成分，注射后会不同程度地提高产蛋鸡的产蛋率。与传统的油乳剂疫苗相比，用本发明所制备的疫苗的免疫持续期由原来的120 天左右延长到180天左右，免疫持续期延长了 50% ；与依照ZL03142556. 9的发明公开的类脂使方法制备的疫苗相比，本发明所制备的疫苗的免疫持续期延长了 80天，免疫持续期延长了 80%，使用本发明所制备的鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗可以减少疫苗接种次数，拉长接种时间间距，减少了接种疫苗的开支，可大大节约养殖业生产成本。采有超滤浓缩方法可最大程度的降低对菌体的损伤和减少菌体的损失。以矿物油为佐剂加入鸡传染性鼻炎抗原按常规方法制备油乳剂疫苗、依照 ZL03142556. 9的方法制备的鸡传染性鼻炎疫苗，与本发明制备的鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗进行对比试验，对比项目及结果如下表所示
权利要求
1.一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，包括如下步骤一级菌种制备取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在C02体积含量为5%、温度为37°C环境中培养16 18h，挑选符合菌株特性的直径为Imm的3 5个典型菌落用IOml灭菌鸡肉汤稀释后接种到6 7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0. ^iil，在 37°C条件下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种，置于-20°C以下保存，不得超过30天；二级菌种制备取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37°C条件下培养17 18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2-8°C保存，不得超过6 8h ；制苗用菌液的制备将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37-38°C温室中静止培养18 20h，期间每隔6 他摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活Mh，得到制苗用菌液；菌液的浓缩与灭活将纯粹检验合格的制苗用菌液进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50 亿cfu/ml，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/10000 的硫柳汞，混勻后在4°C条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液；(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同；(3)疫苗的制备取上述制备的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1 1的比例混合后倒入乳化罐内，用混合机以750 850r/min 的转速搅拌，同时再加入杨树皮类脂，加入杨树皮类脂速度不能快，使杨树皮类脂液在混合物中的最终体积百分比浓度为2. 0 3. 8%，然后将混合机的转速提高到2500 3000r/ min继续乳化30 60分钟，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最终含菌量均为10亿 cfu/ml ；所述鸡肉汤琼脂板是这样制备的取鸡肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化钠0. 5g、琼脂粉 1. 5g混合，用4mol/L NaOH溶液调节混合溶液的PH至7. 4，116°C灭菌30分钟，倒板前加入辅酶I (NADH)和过滤除菌的健康鸡血清混勻，使得混合溶液中辅酶I(NADH)的质量浓度为0. 05%、过滤除菌的健康鸡血清的体积百分比浓度为10%，然后将混合溶液倒入直径为 90mm的平皿中，放平冷却即得到鸡肉汤琼脂板；所述鸡肉汁是取鸡胸脯肉泥1重量份加入蒸馏水4重量份，4°C浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤得到的；所述半合成培养基是这样制备的取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g，放入IOOOml纯化水中搅均，调节所得溶液的PH至7. 2 7. 4，116°C灭菌40分钟，临用前加入60ml的灭活健康鸡血清和IOml的浓度为0. 5%的辅酶 I (NADH)水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于， 在所述的菌液的浓缩与灭活过程中，浓缩采用高速离心方法、中空纤维过滤方法或超滤浓缩方法中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，浓缩采用超滤浓缩方法。
全文摘要
本发明提供了一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品制备领域。本发明是这样实现的，制备好A型和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液，取上述制备的A型和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混合后倒入乳化罐内，用混合机搅拌，同时再加入杨树皮类脂，加入杨树皮类脂速度不能快，使杨树皮类脂液在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0～3.8％，继续搅拌、乳化30～60分钟，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最终含菌量均为10亿cfu/ml。疫苗容易吸收、无毒副作用、免疫产生时间短、免疫持续期长，免疫效果好，能有效预防鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体病。
文档编号A61P27/02GK102406934SQ20101028958
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月25日 优先权日2010年9月25日
发明者姚奋卯, 孟照洁, 杨灵芝, 王娟, 王秀云, 郝圣峰 申请人:山东滨州博莱威生物技术有限公司