专利名称：昆明山海棠总生物碱的提取方法及该提取物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物提取技术与药物研究领域，具体为昆明山海棠植物中提取总生物碱的方法及该提取方法所得提取物的应用。
背景技术：
癌症对人类的健康和生存构成重大威胁，当前和今后相当长的时期内抗肿瘤药物仍是癌症治疗的最主要手段之一。现有的绝大部分肿瘤化疗药物存在选择性低、毒性大的缺点。发现高选择性、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。我国人口世界第一、肿瘤发病率高，抗肿瘤新药开发也是我国新药研究和开发的
^^点ο新型抗肿瘤药物的发现面临着化学实体来源以及如何筛选两个关键问题。在抗肿瘤新药来源问题方面，天然产物是我国新药研究和开发的宝贵资源和很好的切入点。昆明山海棠(Tripterygium Hypoglaucum Hutch (THH))是卫矛科雷公藤属植物，主要分布于我国长江以南各省区、西南区以及台湾省，主产于云南省。临床上主要作为免疫抑制剂用来治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、肿瘤等，并具有镇痛、抗炎、抗雄性生育和致突变作用。实验证明THH的毒性作用远小于同属植物雷公藤。THH的主要成份有生物碱、萜类、甙类、糖类、 有机酸、多糖等，其中生物碱在临床上的疗效最好且毒副作用最小。传统的昆明山海棠总生物碱(Total alkaloids of THH(THHta))提取方法药物浸泡时间过长(加入有机溶剂浸泡时间长达6天，如文献[敖琳，曹佳，徐颖等，昆明山海棠总生物碱诱发HL60细胞凋亡的观察.第三军医大学学报.2001，23 (11) :1273-1275])且得到的总生物碱杂质较多，不易分离提纯。本发明克服了以往提取方法存在的问题，一是利用超声提取技术，提高了 THHta的得率，缩短了浸泡时间从而提高了提取效率；二是在超声萃取的基础上，利用C18的亲脂性进行固相萃取，在减少氯仿用量的同时提高了总生物碱的纯度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从昆明山海棠中提取总生物碱的方法，并将其应用于肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。本发明利用超声提取技术，将超声提取、溶剂萃取和固相萃取相结合，确定了具体的提取条件对昆明山海棠中的总生物碱进行提取，该提取物经体内外抗肿瘤活性实验表明 THHta可以抑制M0LT-4、HCT116和PC3等肿瘤细胞增殖活性，对HCT116细胞裸鼠移植瘤生长也具有明显的抑制作用，具有显著的体内抗肿瘤活性。本发明通过以下方法实现发明目的。昆明山总生物碱的提取方法步骤如下(1)昆明山海棠去皮根粉碎后过5-15目筛；(2)加昆明山海棠去皮根10-40倍量61-69%乙醇在超声条件下多次提取；
(3)合并提取液，浓缩后加入30-45 %的浓盐酸调节pH值至酸性，充分混合后过滤；(4)滤液用氯仿萃取3-5次，所得萃余相用Na2CO3调节pH值至9-11，再用氯仿萃取3-5次，合并萃取相；(5)40-50°C条件下，旋转蒸发萃取相回收氯仿后得总生物碱；或(1)昆明山海棠去皮根粉碎后过5-15目筛；(2)加昆明山海棠去皮根10-40倍量61-69%乙醇在超声条件下多次提取；(3)合并提取液，浓缩后加入30-45%的浓盐酸调节pH值至酸性，充分混合后过滤；(4)滤液用氯仿萃取3-5次，所得萃余相用Na2CO3调节pH值至9_11，将该萃余相通过含C18的固相萃取装置，先用蒸馏水冲洗30分钟，再用30-45%乙醇冲洗，收集该冲洗液经旋转蒸发回收乙醇后得总生物碱。其中步骤O)的超声提取采用济宁金百特电子有限责任公司生产的智能控制连续多功能超声波提取机完成。
具体实施例方式1.实验目的检测本专利方法所得昆明山海棠总生物碱(THHta)体内外抗肿瘤活性，为抗肿瘤药物开发提供实验依据。2.实验材料2. 1供试样品=THHta经由本专利所述方法得到。2. 2实验细胞株肿瘤细胞株HL60、MOLT-4、HCTl 16及PC3 (购自上海细胞生物研究所细胞库)。2. 3实验动物BALB/c-nu裸小鼠18只，4周龄，体重14. 2士0. 9g，雌性鼠，由中国医学科学院实验动物所提供，SPF级，实验动物生产许可证号(京)2009-0004。3.实验方法与结果3. ITHHta对肿瘤细胞的增殖抑制作用用不同浓度(5、10、25、50、100μg/ml)的 THHta 处理 HL60、M0LT_4、HCT116 及 PC3 等4种肿瘤细胞，并于药物处理后4 进行MTT实验。结果显示THHta能够抑制HL60、MOLT-4、HCTl 16及PC3四种肿瘤细胞的增殖活性，且与剂量呈明显的依赖关系，结果见表1。THHta作用HL60、M0LT-4、HCT116及PC3细胞 48h 对应的 IC50 值为 1. 59,8. 77、18. 86,49. 34 μ g/ml。3. 2THHta对HCT116裸鼠移植瘤生长的抑制作用将HCT116细胞接种于裸鼠皮下，当肿瘤形成且瘤块体积达到IOOmm3左右时，按肿瘤体积将裸鼠随机分为对照组、THHta治疗组(50mg/kg组、100mg/kg组)。给药方案腹腔注射给药，每周给药5天，间歇两天，连续给药M天。对照组给予体重相应的等体积溶剂 (含0. 2% DMSO的生理盐水)。实验期间每三天测量一次移植瘤体积参数并计算瘤体积，各组平均瘤体积见表2。根据每次测量的移植瘤体积计算相对瘤体积(RTV)，并进一步计算相应的相对肿瘤增殖率(T/C% )，见表3。结果显示治疗组HCT116裸鼠移植瘤的平均体积与对照组相比，在给药第6天后，100mg/kg组瘤体积小于对照组，具有显著的统计学差异(P < 0. 01)；在给药第9天至实验结束，THHta两治疗组瘤体积均显著小于对照组(P < 0. 01)。实验结束时，对照组、 THHta低剂量、高剂量组移植瘤的平均体积分别是分组给药时肿瘤体积的9. 39倍、1. 93倍和0. 83倍。THHta50mg/kg组在给药后第12天开始相对肿瘤增殖率(T/C% )小于40% ； THHtal00mg/kg组在给药后第9天开始T/C值小于40%。实验期间各时间点T/C值说明 THHta能抑制HCT116移植瘤在裸鼠体内的增殖生长，且与时间和剂量呈依赖关系。表1. MTT法法测定THHta作用4 对以下4种肿瘤细胞的抑制率(％，n = 8j±s)
权利要求
1.一种昆明山海棠总生物碱的提取方法，其特征在于提取过程包含以下步骤(1)昆明山海棠去皮根粉碎后过5-15目筛；(2)加昆明山海棠去皮根10-40倍量61-69%乙醇在超声条件下多次提取；(3)合并提取液，浓缩后加入30-45%的浓盐酸调节pH值至酸性，充分混合后过滤；(4)滤液用氯仿萃取3-5次，所得萃余相用Na2CO3调节pH值至9_11，再用氯仿萃取3_5 次，合并萃取相；(5)40-50 0C条件下，旋转蒸发萃取相回收氯仿后得总生物碱；或(1)昆明山海棠去皮根粉碎后过5-15目筛；(2)加昆明山海棠去皮根10-40倍量61-69%乙醇在超声条件下多次提取；(3)合并提取液，浓缩后加入30-45%的浓盐酸调节pH值至酸性，充分混合后过滤；(4)滤液用氯仿萃取3-5次，所得萃余相用Na2CO3调节pH值至9_11，将该萃余相通过含C18的固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE)装置，先用蒸馏水冲洗30分钟，再用 30-45%乙醇冲洗，收集该冲洗液经旋转蒸发回收乙醇后得总生物碱。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤2中的乙醇用量为昆明山海棠粉重量的15倍。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤2中的乙醇浓度为65%。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤2中的多次提取为3次，第一次为3小时，第二次为2小时，第三次为1小时。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤3中的pH值为2-3。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤4中的pH值为10。
7.根据权利要求1所述提取方法所得提取物在抗肿瘤及抗自身免疫性疾病中的应用， 其特征在于一定量总生物碱中加入适量药用辅料制成各种常用制剂，包括片剂、胶囊剂、注射剂。
8.根据权利要求7所述提取方法所得提取物在抗肿瘤及抗自身免疫性疾病中的应用， 其特征在于所得制剂为片剂，处方为总生物碱、淀粉、7% -15%淀粉浆、硬脂酸镁。
全文摘要
本发明是一种昆明山海棠总生物碱的提取方法及该提取物的应用。取一定量昆明山海棠去皮根粉碎后加入一定量一定浓度的乙醇溶液在超声设备辅助下多次提取，合并提取液后浓缩，向所得浓缩液加入一定浓度的浓盐酸调节pH值充分混合一定时间后过滤，所得滤液用氯仿萃取多次后保留萃余相，调节该相pH值至碱性，对该碱性溶液用氯仿多次萃取后合并氯仿相，蒸发回收氯仿得总生物碱，或将该碱性溶液通过C18柱进行固相萃取得总生物碱。本发明所得提取物可用于治疗肿瘤及自身免疫性疾病。
文档编号A61P37/02GK102406670SQ20101028919
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者刘晋祎, 姜晓, 敖琳, 曹佳, 杨录军, 黄晓春 申请人:中国人民解放军第三军医大学