一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体的说，是关于一种鸡传染性鼻炎二价蜂 胶灭活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的一种急性呼吸系统传染病，主要特征为眼 和鼻粘膜发生不同程度炎症，发病率很高，可以引起幼鸡生长停滞和蛋鸡产蛋量显著下 降，8-12周龄的鸡和产蛋母鸡最常发生。此病分布于全世界，由于感染的产蛋鸡产蛋减少 10 % -40 %，生长鸡增重停滞及淘汰鸡数增加，常造成严重经济损失。
[0003] 鸡传染性鼻炎可采用敏感药物治疗，但无法从根本上消除带菌状态。而选用免疫 原性较好的菌株制作疫苗进行积极预防是控制鸡传染性鼻炎的有效途径。目前市场上流行 的鸡传染性鼻炎灭活疫苗添加油佐剂的疫苗抗体持续时间长，但有副反应，添加铝胶佐剂 的无副反应但抗体持续时间短，因此，需要开发一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗以解决上述问 题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的提供一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗及其制备方法，该疫苗免 疫保护率高，疫苗保存期长，且蜂胶佐剂的使用不会出现副反应，同时有效的简化免疫程 序、节省劳动力，降低免疫成本。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] -种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述抗原 为副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌株的抗原浓缩灭活，配苗时每毫升疫苗中各菌株的菌数 多2. 0XIO9CFU,所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8mg。
[0007] 进一步地，所述副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌株抗原液灭活前活菌数在 彡 3.OXlO9CFlVmL
[0008] 进一步地，所用佐剂为优质蜂胶，经乙醇浸提获得。
[0009] -种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0010] (1)蜂胶乙醇浸出液制备：蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15°C冷冻 24-48h，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4的比例加入95%乙醇，在37°C浸提48-72h，冷却、 过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量多32g/mL;
[0011] (2)制备生产用菌种：将副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌种进行繁殖制备生产用菌 种，并对该生产用菌种进行纯粹检验；
[0012] (3)制备抗原液：将步骤（2)的生产用菌种分别接种到相应的制苗用培养基培养， 制备抗原液；并进行纯粹检验；
[0013] (4)活菌计数：分别从步骤（3)所获得的两种抗原液中取样，对副鸡禽杆菌WF株 和YC株的菌株进行活菌计数，以确定培养的菌数；
[0014] (5)浓缩：将上述两种抗原液分别用中空纤维浓缩，制得抗原浓缩液；
[0015] (6)灭活：两种抗原液经硫柳汞灭活制得灭活抗原液，并进行灭活检验；
[0016] (7)疫苗成品完成：根据各菌株菌液活菌计数结果，每毫升疫苗中各菌株菌数含 量2.OXIO9CFU的配苗标准，分别量取所需量的副鸡禽杆菌WF株、YC株浓缩液，按照每毫升 疫苗中含蜂胶干物质8mg的标准量取蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量须多32g/ mL，用注射用水补充至10万毫升；2000rpm搅拌5分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，继 续2000rpm搅拌15~20分钟，使其充分混合乳化，制得所述鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫 苗。
[0017] 进一步地，所述步骤（5)中制得抗原浓缩液含菌数应彡6. 0X109CFU/mL。
[0018] 进一步地，所述步骤（5)中抗原浓缩液为副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌种抗原液 的3-4倍浓缩。
[0019] 进一步地，所述的步骤（7)的佐剂为蜂胶乙醇浸出液，所选蜂胶经乙醇浸提，制备 蜂胶乙醇浸出液干物质含量多50%。
[0020] 本发明的有益效果是：二价蜂胶灭活疫苗免疫保护率高，疫苗保存期长，且蜂胶佐 剂的使用不会出现副反应，能减少免疫注射产生的应激性，省时省力，且能获得优良的免疫 保护率，结合实际生产带来很大的便利。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例，对本发明的鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗的制备方法作进一 步详细说明。
[0022] 菌种：副鸡禽杆菌WF株和YC株菌种，由山东华宏生物工程有限公司实验室王永 明、王晓丽分离提供。
[0023] 培养基：含60 y g/mL NADH和10%鸡血清的鸡肉汤琼脂平板及斜面，由实验室自 制。
[0024] 试验动物：2_3月龄的健康易感鸡由实验动物房提供。
[0025] 主要试剂：氯化钠（分析纯）、硫柳汞、甲醛溶液、蜂胶乙醇提取液由山东华宏生物 工程有限公司提供。
[0026] -、蜂胶乙醇浸出液制备
[0027] 蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15°C冷冻24_48h，再用冷冻粉碎机磨碎 过筛，按1:4的比例加入95 %乙醇，在37°C浸提48-72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出 液（透明栗色溶液），浸出液的蜂胶干物质含量多32g/mL。
[0028] 二、制备生产用菌株
[0029] ①一级种子繁殖与鉴定
[0030] 取副鸡禽杆菌WF株和YC株菌种分别划线接种于含60yg/mL NADH和10 %鸡血 清的鸡肉汤琼脂平板，置含5%~10% 0)2培养箱中37°C培养16~18h后，挑选数个荧光 性强的典型菌苔（菌落），用鸡肉汤培养基悬浮后，分别接种于5-6日龄SPF鸡胚卵黄囊 内，置37°C继续孵育，收集24-30h内死亡的鸡胚卵黄液，经纯检合格后，作为一级种子液。 置-20°C以下保存，保存期应不超过1个月，否则要再通过鸡胚复壮，但不应超过6代。
[0031]②二级种子繁殖
[0032] 取感染的鸡胚卵黄液一级种子，分别划线接种含60yg/mlNADH和10%鸡血清的 鸡肉汤琼脂平板，置含5%~10% 0)2培养箱，37°C培养16~18h，选荧光性强的典型菌苔 (菌落）接种于含15ug/mLNADH和2. 5%鸡血清的鸡肉汤培养基中，置37°C培养16~20h， 经纯检合格后，即为二级种子。在2~8°C保存，不得超过6~8h。
[0033] 三、制备抗原液
[0034] 采用微生物发酵罐分别培养副鸡禽杆菌菌液。按发酵罐容积总量的70%加入生产 用半合成培养基，116°C灭菌40分钟，待培养基温度冷却至37°C左右时，加入终浓度15yg/ mLNADH和2. 5%鸡血清，按培养基总量的2~3%接入副鸡禽杆菌二级种子液，混合均匀 后，37°C培养。开始小气量通气，逐渐增大通气量，pH值7. 2~7. 6,通