气量为5~6L/分 钟，培养期间搅拌2~3次，搅拌速度控制在100~200转/分，37°C培养18~20h，收获菌 液，置2~8°C保存备用。
[0035] 四、纯粹检查和活菌计数
[0036] 菌液培养完成后，取样用适宜培养基按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应 纯粹；同时取样进行活菌计数，每mL副鸡禽杆菌菌液菌数应多2.OX109CFU。
[0037] 五、浓缩
[0038] 用中空纤维过滤将灭活合格的菌液进行浓缩，使最终菌悬液含菌数应 彡 6.OXlO9CFlVmL0
[0039] 六、灭活
[0040] 按菌液总量的0. 01 %缓慢加入1 %硫柳汞溶液，充分混合后，置2_8°C灭活7日，每 日搅拌4次。灭活结束后，取样接种含60μg/mlNADH和10%鸡血清的鸡肉汤琼脂平板，置 37°C培养24h，应无菌生长。
[0041] 七、疫苗成品完成
[0042] 实施例1
[0043] (1)量取13000mL所需的副鸡禽杆菌WF株浓缩液，浓缩后菌数为I. 6XIOiqCFU/ mL，量取16700mL副鸡禽杆菌YT株浓缩液，浓缩后菌数为I. 2XIOwCFlVmL;
[0044] ⑵按照每毫升疫苗中含蜂胶干物质Smg的标准量取蜂胶乙醇浸出液，浸出液的 蜂胶干物质含量须多32g/mL，缓慢加入乳化罐中，2000rpm搅拌5min;
[0045] (3)用注射用水补充至lOOOOOmL，置于配苗乳化罐中，2000rpm搅拌15-20min，充 分乳化，获得所述鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗。
[0046] 八、二价蜂胶灭活疫苗的无菌检验
[0047] 实施例2
[0048] 分别在分装前、中、后随机取各批四价蜂胶灭活疫苗5瓶样品，按照《中华人民共 和国兽用生物制品规程》附录448页进行无菌检验，结果均无菌生长。
[0049] 九、二价蜂胶灭活疫苗的安全检验
[0050] 实施例3
[0051] 随机抽取各批次疫苗5瓶样品，各批次样品混匀后取样分别皮下注射2-3月龄的 健康易感鸡8只，每只皮下注射l.OmL，观察14d，全部健活。
[0052] 十、二价蜂胶灭活疫苗的效力检验
[0053] 实施例4
[0054] 取5批二价疫苗检样，每批注射20只健康易感鸡，每只皮下注射0. 5mL，另取20只 健康易感兔作为对照。免疫后28日，取免疫鸡10只和对照鸡10只分别眶下窦内注射一个 最小发病感染剂量的副鸡禽杆菌WF菌株强毒菌液0. 2mL(含活菌数约为2. 0XIO4CFU);取 免疫鸡10只和对照鸡10只分别眶下窦内注射一个最小发病剂量的副鸡禽杆菌YC菌株强 毒菌液0. 2mL(含活菌数约为2. 0XIO5CFU)，观察14日。各对照组应至少8只发病，各免疫 组应至少8只保护。（见表1、表2)
[0055] 表1二价蜂胶灭活疫苗对WF株攻毒保护结果
[0056]
[0057] 表2二价蜂胶灭活疫苗对YC株攻毒保护结果
[0058]
[0059] 从上述实施例可以看出，鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗对副鸡禽杆菌WF株、YC 株具有良好的免疫保护力。
【主权项】
1. 一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述抗原 为副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌株的抗原浓缩灭活，配苗时每毫升疫苗中各菌株的菌数 多2.OXIO9CFU,所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8mg。2. 根据权利要求1所述的二价蜂胶灭活疫苗，其特征在于，所述副鸡禽杆菌WF株和YC 株的菌株抗原液灭活前活菌数彡3.OX109CFU/mL。3. 根据权利要求1所述的二价蜂胶灭活疫苗，其特征在于，所用佐剂为优质蜂胶，经乙 醇浸提获得。4. 一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 蜂胶乙醇浸出液制备：蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15°C冷冻24-48h， 再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4的比例加入95 %乙醇，在37°C浸提48-72h，冷却、过滤，即 得纯净蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量多32g/mL; (2) 制备生产用菌种：将副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌种进行繁殖制备生产用菌种，并 对该生产用菌种进行纯粹检验； (3) 制备抗原液：将步骤（2)的生产用菌种分别接种到相应的制苗用培养基培养，制备 抗原液；并进行纯粹检验； (4) 活菌计数：分别从步骤（3)所获得的两种抗原液中取样，对副鸡禽杆菌WF株和YC 株的菌株进行活菌计数，以确定培养的菌数； (5) 浓缩：将上述两种抗原液分别用中空纤维滤器浓缩，制得抗原浓缩液； (6) 灭活：两种抗原液经硫柳汞灭活制得灭活抗原液，并进行灭活检验； (7) 疫苗成品完成：根据各菌株菌液活菌计数结果，每毫升疫苗中各菌株菌数含量 2.OXIO9CFU的配苗标准，分别量取所需量的副鸡禽杆菌WF株、YC株浓缩液，按照每毫升 疫苗中含蜂胶干物质8mg的标准量取蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量须多32g/ mL，用注射用水补充至10万毫升；2000rpm搅拌5分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，继 续2000rpm搅拌15~20分钟，使其充分混合乳化，制得所述鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫 苗。5. 根据权利要求4所述的一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在 于，所述步骤（5)中制得抗原浓缩液含菌数应彡6.0X109CFU/mL。6. 根据权利要求4所述的一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在 于，所述步骤（5)中抗原浓缩液为副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌种抗原液的3-4倍浓缩。7. 根据权利要求5所述的一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在 于，所述的步骤（7)的佐剂为蜂胶乙醇浸出液，所选蜂胶经乙醇浸提，制备蜂胶乙醇浸出液 干物质含量彡50%。
【专利摘要】本发明提供了一种鸡传染性鼻炎二价蜂胶灭活疫苗及其制备方法，属于动物疫苗制备技术领域，其采用副鸡禽杆菌WF株和YC株的菌液浓缩抗原，经蜂胶原液制备、生产用菌种制备、抗原液制备、活菌计数、浓缩、灭活、疫苗配制，从而完成二价蜂胶灭活疫苗的制备。本发明的二价蜂胶灭活疫苗具有免疫效果好，疫苗保护期长等特点，且蜂胶佐剂的使用不会出现副反应。
【IPC分类】A61P31/04, A61K39/116, A61K39/02, A61K39/39
【公开号】CN105194664
【申请号】CN201510622187
【发明人】李玉坤, 王晓丽, 王永明, 于海光, 牛卫卫
【申请人】山东华宏生物工程有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月25日