聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种以聚乙二醇化磷脂为载体的胶束 多肽疫苗，及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 以纳米尺度材料作为载体设计的肿瘤治疗性疫苗是治疗肿瘤的新思路。已有的 研究表明，利用纳米尺度材料载体携带蛋白抗原，能够提高抗原的免疫原性，这种现象可能 与纳米尺度材料相对巨大的比表面积和复杂的结构有关；同时纳米尺度材料载体对蛋白 抗原能够起到一定程度的保护，防止蛋白抗原很快地被血液中的蛋白酶和内网系统降解， 有利于蛋白抗原发挥作用；另外，携带有蛋白抗原的纳米尺度材料载体易被抗原呈递细胞 (antigenpresentcells,APCs)，特别是树突状细胞（DendriticCells,DCs)，摄取和加 工，从而使DCs处理和呈递大量蛋白抗原，引发更为有效的免疫反应。使用特定的纳米尺度 材料包载肿瘤特异性抗原和免疫佐剂组成肿瘤治疗性疫苗，接种肿瘤患者能够刺激患者的 免疫系统，产生杀伤肿瘤细胞的免疫反应，减小甚至清除手术或放、化疗后体内残存的肿瘤 病灶。
[0003] 目前虽然已经出现多种以纳米尺度材料为载体的肿瘤疫苗设计方案，但都存在 一些关键性的技术障碍。以病毒（viruses)、病毒样颗粒（virus-likeparticles)或 病毒颗粒（virosomes)作为载体的肿瘤疫苗（LArlenPM,etal.Arandomizedphase IIstudyofdocetaxelaloneorincombinationwithPANVAC-V(vaccinia)and PANVAC-F(fowlpox)inpatientswithmetastaticbreastcancer(NCI05-C-0229) ? ClinBreastCancer. 2006 ；7:176 - 179. ；2.GulleyJL,etal.Immunologicand prognosticfactorsassociatedwithoverallsurvivalemployingapoxviral-based PSAvaccineinmetastaticcastrate-resistantprostatecancer.CancerImmunol Immunother. 2009)，虽然能够在使用初期刺激机体产生免疫反应，但由于病毒的蛋白成分 本身就是有效的抗原同时组成占优，因此引发的免疫反应主要是针对病毒载体本身的抗原 而非病毒载体携带的肿瘤特异性抗原，降低了免疫反应的效率，特别是在肿瘤特异性抗原 的抗原性比较弱的情况下，这种效应更为明显；而为了提高治疗性疫苗的免疫治疗效果，通 常要进行多次免疫，这种情况下前次免疫引发的针对病毒载体本身的免疫反应（主要是抗 体反应），会大大降低后续免疫治疗的效果；此外以常见病毒，例如腺病毒，痘病毒等为载 体设计的疫苗，往往因为患者可能的早期病毒感染产生的免疫保护而显著降低疫苗的免疫 治疗效果（HuangX，YangY.Innateimmunerecognitionofvirusesandviralvectors. HumGeneTher. 2009 ；20:293 - 301.)〇
[0004] 以脂质体为载体的纳米疫苗，载体本身不具有免疫原性，能够有效提高肿瘤特 异性抗原的免疫效率，但是，脂质体载体由于尺度和成分的原因，经过皮下接种后其颗粒 并不能有效地扩散入引流淋巴结，一部分疫苗成分长时间驻留在接种部位，随之而来的， 免疫产生的肿瘤抗原特异性的细胞毒性淋巴细胞（Cytotoxiclymphocytes,CTLs)会有 很大一部分迀移至疫苗接种部位而非肿瘤生长部位，大大降低了针对肿瘤的特异性免疫 反应(HailemichaelY，etal.Persistentantigenatvaccinationsitesinduces tumor-specificCD8+Tcellsequestration,dysfunctionanddeletion.NatMed. 2013 ； 19(4) :465-72.)。另外，由于脂质体制备的特点，得到的产物往往均一性较差，颗粒尺度跨 度很大，而且批次之间的重复性也一般，在质量控制上存在一定的难度。
[0005] 胶束载体，是一种由同时包含疏水嵌段和亲水嵌段的双亲性聚合物分子自组装成 的纳米颗粒，胶束纳米颗粒的组装是聚合物分子在水溶液中自发形成热力学稳定体系，这 个过程是由疏水片段从水溶液中撤出并自发堆积聚合引起的自由能降低推动的。与低分 子量表面活性剂相比，双亲性聚合物的临界胶团浓度（criticalmicelleconcentration， CMC)更低，这使得聚合物胶束更能对抗溶液的稀释，同时，疏水嵌段组成的胶束核结构紧 密，在生理环境中被大量体液稀释后，不容易解离，稳定性更好。双亲性聚合物分子的亲水 性嵌段大都选用聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG)，聚乙二醇水溶性良好，具有高度 水合特性，在胶束颗粒的外壳区域能够为胶束颗粒提供足够的空间位阻。此外，它的生物 相容性良好，是通过FDA认证的广泛使用的药用辅料。双亲性聚合物分子的疏水嵌段材料 比较丰富，是决定胶束载体载药效率和稳定性的主要因素。根据化学结构不同，疏水嵌段 中的亲脂基团可分为三类，聚酯（polyester)衍生物，聚氨基酸（poly(aminoacid))衍生 物和普郎尼克类（Pluronics)。聚酯类内核嵌段中，聚乳酸（poly(lacticacid),PLA)，聚 己内酬（poly(caprolactone)，PCL)和聚羟基乙酸（poly(glycolicacid))均为FDA认 可的具有良好生物相容性的材料。聚氨基酸类内核嵌段中，聚天冬氨酸（P〇ly(aspartiC acid)，PAsp)，聚谷氨酸（poly(glutamicacid)，PGlu)，聚赖氨酸（poly(L-Iysine)，PLys)， 聚组氨酸（poly(histidine),PHis)等材料已被普遍利用。Pluronics为聚环氧乙烧-聚环 氧丙烷-聚环氧乙烷组成的三嵌段共聚物，可以表示为PE0m-PP0n-PE0m。
[0006] 聚乙二醇化磷脂是一种新型的双亲性聚合物分子。其亲水嵌段为聚乙二醇，疏水 嵌段为磷脂分子。聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合。目前，聚乙二醇 化磷脂作为包载材料主要是用于包载小分子化疗药物，其优点如下：1)疏水内核磷脂可以 包载难溶性药物，大大提高药物的溶解能力；2)亲水外壳聚乙二醇可以保护胶束内部的药 物分子不被外界吸附或降解，能够帮助药物逃逸网状内皮系统的摄取，延长药物循环时间； 3)控制药物的释放，优化药物的体内分布以达到更好的治疗效果（不会引发免疫反应）。但 是，有关聚乙二醇化磷脂胶束对蛋白或多肽的包载研究极少，有关聚乙二醇化磷脂制备的 胶束作为载体系统开发的肿瘤治疗性疫苗的研究国内外均未见报道。
[0007] 单磷酰脂A(MonophosphorylLipidA,MPLA)是一类较为常见的免疫佐剂（结构 见图9)，其是通过化学修饰来源于沙门氏菌R595的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS)而 得到的新型的免疫佐剂。与LPS相比，MPLA基本保留了免疫刺激能力，但是内毒素毒性大 大降低，因此成为了一种更加安全且有效的免疫佐剂，并已被美国FDA批准作为免疫佐剂 进入临床。与LPS发挥作用的分子机制相似，MPLA也是通过与Toll样受体（Toll-like receptor，TLR) 4相作用，激活其下游与天然免疫相关的信号通路，激活天然免疫反应，促进 干扰素Y和肿瘤坏死因子a的表达；与此同时活化树突状细胞，进而进一步激活获得性免 疫反应。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及一种能够预防和治疗肿瘤的胶束多肽疫苗。
[0009] 本发明所述的胶束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂（PEG-PE)和抗原多肽自组装形 成，所述的聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇（亲水嵌段）通过共价键和磷脂分子（疏水嵌段） 上的含氮碱基结合形成的化合物。
[0010] 本发明所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段为分子量500~10000 的PEG分子，优选为PEG1500~3000,最优选为PEG2000。
[0011] 本发明所述的胶束疫苗的粒径为10~l〇〇nm，优选为10~50nm，最优选为20nm。
[0012] 本发明所述的抗原多肽为长度为5~100个氨基酸的多肽，优选为10~50个氨 基酸的多肽，更优选为20~30个氨基酸的多肽，最优选为E7多肽或OT-I多肽。
[0013] 本发明所述的E7抗原多肽为来源于人16型乳头瘤病毒（HPV16)肿瘤的相关抗 原，在N端连接一个棕榈酸分子，S卩E743 62序列：棕榈酸-GQAEroRAHYNIVTFCCKCD;
[0014] 本发明所述的OT-I多肽为来源于卵清蛋白（OVA)的17个氨基酸的多肽，包 含OVA蛋白在H-2Kb分型小鼠特异性CTL表位0VA257-264,氨基酸序列结构为棕榈 酸-EQLESIINFEKLTEWKD。
[0015] 本发明所述的胶束多肽疫苗还可以包含调节机体免疫功能的免疫佐剂，所述的免 疫佐剂包括弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、单磷酰脂A佐剂，优选为单磷酰脂A(MPLA)佐剂。
[0016] 本发明所述的胶束多肽疫苗中，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、抗原多肽、免疫佐剂 的用量摩尔比例范围720 :4~160 :3~80,最优选摩尔比180 :4 :3。
[0017] 本发明所述的胶束多肽疫苗制剂为溶液形式或冻干形式。
[0018] 本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法为：
[0019] (1)以易挥发有机溶剂溶解PEG-PE载体分子、抗原多肽分子、佐剂分子，制备载体 分子溶液、抗原多肽溶液、佐剂溶液；
[0020] (2)按照特定比例将步骤（1)所获得的载体分子溶液、抗原多肽溶液、佐剂溶液混 匀；
[0021] (3)除去步骤（2)所获得的混合溶液中的全部有机溶剂，使载体分子、抗原多肽分 子和佐剂分子形成分布均勾的混合脂膜；
[0022] (4)以一定量的去离子水或生理盐水溶解步骤（3)所获得的混合脂膜，温育条件 下使脂膜水化均匀，随后室温静置一定时间，获得胶束疫苗溶液；
[0023] (5)将步骤（4)所获