一种聚(L-谷氨酸)-b-聚乙二醇载药纳米胶束的制备
【技术领域】
[0001]—种聚(L-谷氨酸)-b-聚乙二醇载药纳米胶束的制备，属于生物材料与缓释技术领域。
【背景技术】
[0002]聚合物胶束特殊的核-壳结构可作为抗肿瘤药物的微存储器，是一种理想的药物释放体系。然而传统的聚合物胶束因缺乏对肿瘤细胞的识别和响应功能，因而在肿瘤部位不能快速及时释放药物，治疗效果不佳，能够应用到临床上的实例非常少。其本身还存在例如在应对周围环境的温度、pH因素变化时不能维持自身稳定等问题；同时该胶束经口服或注射进入体内被体液高倍稀释后，出现胶束纳米粒子解体等现象，从而造成药物的泄露。随着临床医学、生物化学以及纳米材料等交叉学科的快速崛起，一种具有交联结构的刺激响应性聚合物胶束体系的诞生使得上述问题迎刃而解，这种新型的胶束体系不仅涵盖传统聚合物胶束的优点，增强胶束纳米粒子的稳定性，同时还能依据肿瘤细胞与正常组织之间诸如温度、PH及氧化还原性的环境差异对其智能识别，达到定位、定时、定量释放药物的效果，实现对药物的安全运输和靶向释放的目的。目前对于这种具有交联结构的刺激响应性聚合物胶束用于抗肿瘤药物的包裹和触发释放的研宄尚处于初期阶段，但其必将为肿瘤等疾病的诊断和治疗带来新的突破。
[0003]为保证胶束纳米粒子安全无毒，通常人们选择良好生物相容性和可降解性的聚乙二醇和聚谷氨酸作为制备胶束的原材料。聚乙二醇因其较强的亲水性和低免疫原性，因此被用作胶束亲水性壳层的报道和研宄屡见不鲜；聚L-谷氨酸作为聚氨基酸庞大家族的一员，在体内易降解为L-谷氨酸单体和短肽而易被生物体吸收；此外，其侧链悬挂丰富具有活性的羧基基团，可通过化学手段进行功能化修饰，增强药物的负载能力的靶向性，在医药、日用化工、水处理以及药物缓释领域备受瞩目。
[0004]因此本发明选择聚乙二醇和L-谷氨酸为主要原料，设计并制备一种具有pH和还原双重刺激响应性交联胶束，用于阿霉素的高效负载和肿瘤细胞内的靶向释放。以胱胺为交联剂与γ_苄酯基团反应，同时在HBr/HAOc体系中将剩余γ -苄酯基团转为羧酸基团，利用静电结合的方式负载阿霉素。该方法制备的载药胶束具有较强的稳定性，药物不易泄露，具有较高的生物利用度；在模拟弱酸性还原条件下能快速触发药物的靶向释放，表现出明显的PH和还原双重响应性，在生物医药和药物缓释领域具有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种聚(L-谷氨酸)-b_聚乙二醇载药纳米胶束的制备方法，以L-谷氨酸为主要原料制备活性单体L-谷氨酸-γ -苄酯-N-羧酸酐(BLG-NCA);以巯基乙胺为引发剂引发BLG-NCA开环聚合得到端巯基聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)；以此为大分子链转移剂与活性单体聚乙二醇甲基丙烯酸酯(MAPEG，Mn= 475g/mol)反应，得到双亲性的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-b-聚乙二醇；再利用胱胺将其中的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)交联，同时在HBr/HAOc体系中将剩余γ -苄酯基团转化为羧酸基团，并静电负载阿霉素，在水溶液中形成纳米胶束。
[0006]本发明的有益成果:
[0007]I)、该方法制备载药交联胶束的过程中引入二硫键，同时采用静电结合的方式负载药物，具有显著的PH和还原响应性，能在肿瘤细胞内弱酸性和还原条件下快速触发药物的靶向释放。
[0008]2)、以胱胺为交联剂制备载药交联胶束，不仅赋予胶束纳米粒子还原响应的特性，同时胶束经胱胺交联后具有较强的耐盐性和耐稀释性，有效延长药物在体内的循环时间和维持药效，安全有效地将药物输送到靶向部位。
[0009]3)、本发明采用聚乙二醇和L-谷氨酸为主要原料，该方法制备的胶束在体内降解后，产物安全无毒，易被人体吸收，环境友好。
[0010]4)、本发明采用静电结合的方式负载阿霉素，药物参与胶束的组成，提高胶束纳米粒子的稳定性，降低药物泄露的几率，增强药物疗效。
【附图说明】
[0011]图1聚(L-谷氨酸)-b-聚乙二醇载药纳米胶束的制备示意图
[0012]图2各物质的红外光谱图
[0013]图3载药纳米胶束PLS-1，PLS-2和PLS-3的粒径分布
[0014]图4载药纳米胶束的扫描电镜图:其中a，b, c,分别代表PLS-1，PLS-2和PLS-3
[0015]图5载药纳米胶束PLS-2在1mM的谷胱甘肽溶液中不同时间下的粒径变化
[0016]图6载药纳米胶束在不同条件下的药物释放曲线
【具体实施方式】
[0017]结合【附图说明】和实施例对本发明的【具体实施方式】进行详细说明，下列实施例旨在描述本发明，但并不用来限制其使用范围。
[0018]实施例1:端巯基聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)的制备
[0019]在预先用氮气置换过的三口烧瓶中依次加入摩尔投料比为1:40的巯基乙胺(AET)和BLG-NCA，二者溶解在二氯甲烷溶剂中，使反应物总浓度为10w%，在氮气氛围中常温下磁力搅拌72h，浓缩反应液，并将其滴入到过量乙酸丁酯中，冰浴半小时得絮状沉淀，离心分离得淡黄色沉淀，35°C下真空干燥得端巯基聚(L-谷氨酸-γ -苄酯)，简称PLT。
[0020]实施例2:聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-b-聚乙二醇的制备
[0021]将PLT与聚乙二醇甲基丙烯酸酯(MAPEG) —起共溶于DMF溶液中，所用聚乙二醇甲基丙烯酸酯的分子量为Mn= 475g/mol，PLT与聚乙二醇甲基丙烯酸酯的投料摩尔比为1:1?1:1.5，二者溶解在DMF溶剂中，反应物总浓度为15w%，以反应物总重量1%的AIBN为引发剂，在60°C条件下进行自由基聚合，24h后将反应液逐滴加入到超纯水中得乳白色浑浊液体，将其转移到截留分子量为3500的透析袋内透析72h，12h换一次水，最后将产物冷冻干燥得淡黄色固体聚(L-谷氨酸-γ -苄酯)-b-聚乙二醇，简称:PLE ;
[0022]实施例3:胶束的交联
[0023]将实施例2所得PLE与将胱胺混合加入到DMF溶剂中，胱胺与PLE分别按摩尔比1: 1、2:1、4:1投料，二者溶解在DMF溶剂中的总浓度为12w%，在30°C温度下磁力搅拌5h后冷却至室温，取反应液，向其中逐滴加入超纯水中搅拌直到有明显丁达尔效应为止，用截留分子量为3500的透析袋透析72h后冷冻干燥，再配成浓度为0.8w%胶束溶液备用；按上述比例制备一系列不同交联程度的交联胶束。合成路线见图1。
[0024]实施例4:载药交联胶束的制备
[0025]取实施例3所得胶束溶液10克，加入到0.7克三氟乙酸(TFA)和4.8克HBr/HOAc的混合溶液中(HBr占HOAc的5wt% )，在0°C下磁力搅拌Ih后，取2克反应液，向其中加入盐酸阿霉素(DOX -HC1)粉末10mg，搅拌Ih后再向其中逐滴加入蒸馏水，直到溶液呈淡红色且有明显丁达尔效应为止，避光磁力搅拌12h，将溶液转移到透析袋(截留分子量3500)中避光透析24h后，转入到容量瓶中定容避光保存。
[0026]实施例5:红外光谱分析
[0027]采用傅里叶红外光谱仪在4000?δΟΟαιΓ1的范围内对上述产物进行测定，得到红外光谱图如图2，曲线PLT中3330011^17500^^7700^1及691CHT1处分别对应聚合物PLT中链段重复单元的氨基吸收峰、其侧链悬挂的苄酯羰基吸收峰及苯环的单取代吸收峰；结合曲线PLT与PLE曲线对比发现，曲线PLE不仅保留了曲线PLT的特征峰，而且在2950CHT1、1190CHT1处的吸收峰明显增强，其分别对应为PEG主链骨架上的C-H吸收峰和侧链重复单元的乙氧基吸收峰，说明聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)聚合物PLE成功合成。对比曲线PLS和曲线PLE发现二者无明显区别，这可能是PLE经胱胺交联后其所占比例太少的缘故，与曲线PLE和PLS比较，可以看出曲线PLS-DOX中位于3330cm_l处的氨基吸收峰等均有所保留，而1750011'77001^1和691cm <的吸收峰消