专利名称：通过减少反应物比例制备聚乙二醇-血红蛋白缀合物的方法
技术领域：
本发明主要涉及通过减少反应物比例制备聚乙二醇(“PEG”)缀合的血红蛋白(“Hb”)的方法。更具体地说，本发明涉及制备提高产率和纯度的聚乙二醇缀合的血红蛋白(“ PEG-Hb，，)的方法。
背景技术：
能够用作氧治疗的氧载体(有时称作“携氧血浆扩容剂(expander)”)可以分为以下三类i)基于全氟化碳的乳剂，ii)脂质体包封血红蛋白，iii)修饰的血红蛋白。如下所述，尽管认为包含修饰的无细胞血红蛋白的产品是最有希望的，但均未完全成功。基于全氟化合物的乳剂溶解氧气，而不与其结合为配基。为了用于生物系统，全氟化合物必须被脂质、一般为蛋黄磷脂乳化。尽管全氟化碳乳剂制备成本低廉，但它们不能在临床耐受剂量下 携带足够有效的氧气。相反，已经表明脂质体包封血红蛋白是有效的，但其极为昂贵而无法广泛应用。(一般参见 Winslow,R. M. ,“Hemoglobin-based Red Cell Substitutes, ^JohnsHopkins University Press, Baltimore(1992))。最初的使用来自红血球溶血产物的游离血红蛋白作为红细胞替代物的尝试是不成功的。发现间质成分是有毒的，会引起凝血病和相关的肾衰竭。1967年，制备出了无基质血红蛋白(stroma-free Hb,“SFH”)溶液(Rabiner, S. F.等，1967, J. Exp. Med. 126 1127-1142)。然而，发现它们的输液(输血，transfusion)半衰期仅有大约100分钟。造成sra短暂的循环半衰期的原因归咎于蛋白质从其四聚体解离成二聚体的能力，二聚体通过肾脏的循环被快速的过滤了。因此，已经设计出多种交联血红蛋白的方法和其它通过缀合大分子来增加血红蛋白流体尺寸的方法来限制或阻止Hb的外渗。交联sra以形成聚-血红蛋白在美国专利4，001, 200和4，001, 401中被公开。可获得连接亚单元之间的氨基酸残基的内部交联的血红蛋白，其具有琥珀酰水杨酸(双-3，5- 二溴水杨酸二酯)(参见美国专利4，529，719)或2-N-2-甲酰-吡哆醛-5’ -磷酸酯和硼氢化物(Benesch，R. E.等，1975,Biochem. Biophys. Res. Commun. 62 :1123-1129)。分子内交联，其使得四聚体血红蛋白单元的亚基化学结合在一起以阻止二聚体的形成，参见美国专利5，296，465。另夕卜，Simon, S.R.和Konigsberg，W. H.揭示了采用二-(N-甲基马来酸)Bi ( “BME”)产生分子内交联血红蛋白(1966，PNAS 56 :749-56)，并报道了当其输入鼠或狗体内时半衰期提高到四倍(Bunn, H. F.等，1969，J. Exp. Med. 129 :909-24)。然而，通过BME交联血红蛋白会引起血红蛋白的氧亲和力的伴随提高，在当时它被认为会阻碍其用作潜在的基于血红蛋白的氧载体(“HBOC”)。SFH也与其它大分子交联，如右旋糖苷(Chang，J. E.等，1977，Can. J. Biochem. 55 398-403)，羟乙基淀粉(DE 2，161，086)，明胶(DE 2，449，885)，白蛋白(DE 2, 449, 885)和PEG (DE 3，026，398，美国专利 4，670，417，4，412，989 和 4，301，144)。这些携氧的溶液的某些生理效应尚未完全了解。其中，可能最有争议的是导致血管收缩的倾向，其可能表现为动物和人体中的高血压(Amberson, W. , 1947, Science 106 117-117) (Keipert，P.等，1993，Transfusion 33:701-708)。双二溴水杨基-延胡酸在 α链间交联的人体血红蛋白(“a aHb”)被美军开发出来作为模型红细胞替代物，但在其显示出剧烈增加肺及全身血管阻力之后被放弃了 (Hess, J.等，1991，Blood 78 :356A)。该产品的商品化形式也在令人失望的III期临床试验后被放弃了(Winslow，R.M. ,2000, VoxSang 79 1-20)。无细胞血红蛋白引起血管收缩的最常见的解释是，它易于结合内皮细胞来源的松弛因子(EDRF) —氧化氮(“NO”)。两种分子途径已经被发展尝试用于克服血红蛋白与NO之间的结合活性。第一种途径利用重组DNA，其通过诱使未梢血红素结合区(pocke t)的特定位点突变来降低NO与血红蛋白的结合(Eich，R. F.等，1996，Biochem. 35 =6976-83)。第二种途径采用化学修饰，其通过寡聚反应增大血红蛋白的尺寸，试图减少或可能完全抑制血红蛋白从血管空间向间质空间的渗出(Hess, J.R.等，1978，J. Appl. Physiol. 74 1769-78 ；Muldoon, S. Μ.等，1996，J. Lab. Clin. Med. 128 :579-83 ；Macdonal, V. ff.等，1994，Biotechnology 22:565-75 ；Furchgott, R.，1984, Ann.Rev. Pharmacol. 24 :175-97 ；和 Kilbourne, R.等，1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199 :155-62)。实际上，已经制备了 NO亲和力降低的重组血红蛋白，其在最高载量的大鼠实验中较少引起高血压(Doherty, D. H.等，1998, Nature Biotechnology 16 :672-676 和 Lemon,D.D.等，1996，Biotech 24:378)。但是，研究提示NO结合可能并非血红蛋白血管活性的唯一解释。已经发现，某些大的血红蛋白分子，例如由PEG修饰的血红蛋白分子，实际上没有高血压效应，即使其NO结合速率与严重高血压的a aHb相同(Rohlfs，R. J.等，1998，J Biol. Chem. 273 :12128-12134)。此外，发现在出血之前作为交换输液给予PEG-血红蛋白时，在防止出血后果方面格外有效(Winslow, R.M.等，1998，J. Appl. Physiol. 85 993-1003)。PEG与血红蛋白的缀合减少了其抗原性并且延长了它的循环半衰期。然而，已有报道称PEG的缀合反应会引起血红蛋白四聚体解离成α β-二聚体亚单元，在交换输血的鼠类身上接受了低于40，000道尔顿(“Da”)的PEG缀合血红蛋白单体单元会导致显著的血红蛋白尿(Iwashita 和 Ajisaka Organ-Directed Toxicity Chem. Indicies Mech. ,Proc.Symp. , Brown 等 1981, Eds. Pergamon, Oxford, England 97-101 页)。由 Enzon, Inc.(美国专利5，650，388)制备了聚环氧烷(“ΡΑ0”)缀合的血红蛋白具有大于84，OOODa的分子量，其可以携带10个PEG-5000链通过其α和ε _氨基连接血红蛋白的副本。该取代的程度被描述为可以避免临床上与哺乳动物血红蛋白尿有关的显著肾毒性。然而，缀合反应引起多样化的缀合群并且包含了其它不期望的反应物，它们必须通过柱状色谱去除。PEG缀合通常通过活化的PEG与生物分子表面的官能团反应来进行。最普遍的官能团是赖氨酸和组氨酸残基的氨基基团，和蛋白质的N末端；半胱氨酸残基的巯基；和丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基的羟基；以及蛋白质的C末端。PEG的活化通常是将羟基末端转化成能够与这些官能团在温和的水环境中进行反应的反应性基团。最普遍的用于医学生物药物的缀合的单官能团PEG中的一个是甲氧基-PEG( “mPEG”)，它只有一个官能团(即羟基)，因而将与双官能团PEG有关的交联和聚合问题最小化。然而，由于其生产过程，mPEG经常被高分子量的双官能团PEG(即“PEG 二醇”)污染，其范围可以达到10至15% (DustJ. M.等，1990,Macromolecule 23:3742-3746)。该双官能团PEG 二醇的大小约为期望的单官能团PEG的两倍。随着PEG分子量的增加，污染问题进一步加重。mPEG的纯度在PEG化的生物治疗剂的生产中是特别关键的，因为FDA要求生产过程的高度重现性和最终药品产物的高质量。在氧合和脱氧的状态下，均可使血红蛋白与PAOs缀合。美国专利6，844，317中描述了在氧合或“R”状态时缀合Hb，以增强生成的PEG-血红蛋白缀合物的氧亲和力。这是通过在缀合之前将血红蛋白与大气平衡来完成的。其它文献描述了关于在缀合前的脱氧步骤以减少氧亲和力和提高结构的稳定性使得血红蛋白能经受得住化学修饰中的物理应力，透析过滤和/或无菌过滤和灭菌过程(美国专利5，234，903)。对于Hb的分子内交联，建议在修饰过程之前对血红蛋白进行脱氧可能需要使α-链的赖氨酸99暴露于交联试剂中(美国专利 5，234，903)。Acharya等(美国专利7，501，499)研究了在Hb与PEG缀合之前通过亚氨基四氢噻吩(iminothiolane)对血红蛋白进行硫醇化的反应动力学。观察到将亚氨基四氢噻吩 的浓度从10倍(其引入了平均5个外来硫醇/四聚体)增加，增加到30倍几乎使相对血红蛋白的表在硫醇数量加倍。然而，甚至在双倍的硫醇数目时PEG缀合后观察到的尺寸增加也是微小的。这表明缀合反应在20倍摩尔过量的马来酰亚胺基(maleimidyl)PEG-5000存在时，活性较小的硫醇覆盖了血红蛋白的表面引起了空间干扰，阻挡了活性较大的硫醇对Hb的进一步修饰。因此，为了获得期望分子量的修饰血红蛋白(即6±1PEG/Hb分子)，Acharya等采用8_15倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩进行血红蛋白硫醇化，然后用16-30倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000与硫醇化Hb反应。然而,这些高摩尔倍数过量的反应物浓度在大规模生产时显著增加了制备HBOC的成本。而且，这样高的摩尔倍数过量的马来酰亚胺基PEG-5000导致了大量不需要的反应物的产生，得到了多种不同的产物。因此，需要一种低廉的、高效率的、更少杂质和更窄分子量范围的制备特定大小范围PEG缀合血红蛋白的方法。
发明内容
本发明主要涉及一种制备聚乙二醇缀合血红蛋白(PEG-Hb)的方法，包括如下步骤将血红蛋白(Hb)与2-亚氨基四氢噻吩(2-iminothiolane) (2-IT)在水稀释液中混合，其中在稀释液中2-IT的浓度相对于血红蛋白浓度为7-8倍摩尔过量，以形成硫醇化Hb ’然后在水性稀释液中，向硫醇化Hb加入聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺(Mal)，其中在稀释液中PEG-Mal的浓度相对于血红蛋白浓度为9-15倍摩尔过量以形成PEG-血红蛋白(PEG-Hb)缀合物，其中PEG-Mal具有4000-6000道尔顿(Da)的平均分子量；其中得到的PEG-Hb缀合物含有平均7. 1-8. 9PEG分子/Hb。在一个实施方案中，在稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7. 5倍摩尔过量，PEG-Mal的浓度相对血红蛋白浓度为12倍摩尔过量，和/或PEG-Mal具有5000道尔顿的平均分子量。根据本发明的示例性方法制备的PEG-Hb缀合物在血红蛋白50%饱和时的氧分压(P50)比在基本相同条件下测得的从同等来源得到的天然无基质血红蛋白的氧分压要低。在一个实施方案中，PEG-Hb缀合物的p50低于10毫米萊柱(mmHg),例如在4-8mmHg之间。
本发明的其它方面如说明书全文所述。
图I : β Cys93残基和硫醇化的血红蛋白赖氨酸被PEG化。R1, R2和R3表示血红蛋白的主链；R4是烷基，“η”表示5000Da的PEG的氧乙烯单元的平均数目。发明的详细说明本发明主要涉及通过使用降低的反应物比例制备聚乙二醇(“PEG”)缀合的血红蛋白(“Hb”)的方法。更特别的，本发明涉及制备提高产率和纯度的聚 二醇缀合的血红蛋白(“PEG-Hb”)的方法。在下文的描述中，广泛使用了许多分子生物学，免疫学和医学领域的术语。为帮助清楚和一致的理解说明书和权利要求书，包括这些术语的范围，下文提供了非限定性的定义。在公开内容中出现了术语“一个(one)”，“一(a)”，或“一(an) ”时，除非另外说明，它们表示“至少一个”或“一个或更多”。术语“活化的聚环氧烷”或“活化的ΡΑ0”在这里是指具有至少一个官能团的PAO
分子。官能团是活性基团，它与分子上的自由氨基、巯基或羧基反应使得分子与PAO缀合。举例来说，与自由巯基反应的这样一种官能团是马来酰亚胺基团。相应的，与自由氨基反应的官能团是琥珀酰亚胺基团。术语“大约”在这里是指实际值在所指数值的一个范围之内。一般而言，实际值在所指数值的10%上下(即加或者减)范围。术语“血红蛋白”或“Hb”在这里一般是指红细胞内包含的输送氧的蛋白质。每个血红蛋白分子具有4个亚基，两条α链亚基和两条β链亚基，组成四聚体结构。每个亚基还包含一个血红素基团，它是结合氧的含铁中心。因而每个血红蛋白分子可结合4个氧分子。术语“MalPEG-Hb”在这里是指已经缀合了马来酰亚胺基活化的PEG的血红蛋白。该缀合的实施是通过将MalPEG与血红蛋白的表面巯基(在较小粒度上与氨基)反应以形成MalPEG-Hb。巯基存在于Hb的氨基酸序列的半胱氨酸残基中，也可以通过修饰表面氨基引入疏基。术语“高铁血红蛋白”或“metHb”在这里是指包含三价态铁的氧化形式的血红蛋白。MetHb不能起氧载体作用。术语“高铁血红蛋白在这里是指在全部血红蛋白中氧化的血红蛋白的百分比。术语“甲氧基-PEG”或“mPEG”在这里是指PEG羟基末端的氢被甲基(-CH3)所取代的PEG。术语“混合物”或“混合”在这里指两种或更多的物质混合在一起，而不发生会导致它们丧失各自性质的反应。术语“溶液”是指液体混合物，术语“水溶液”是指包括一些水的溶液，可能还包括一种或更多种其它液体物质，与水形成多组分溶液。术语“修饰血红蛋白”或“修饰Hb”在这里指，但不限于通过化学反应改造的血红蛋白，例如分子内或分子间交联、重组技术，从而这种Hb不再是它的“天然”状态。此处所用术语“血红蛋白”或“Hb”本身是指天然未修饰的血红蛋白以及修饰的血红蛋白。
术语“氧亲和力”在这里是指氧载体(例如血红蛋白)结合分子氧的亲和力。该特征由关于血红蛋白分子氧饱和度(Y轴)与氧分压(X轴)的氧平衡曲线定义。该曲线的位置由氧载体被氧半饱和时的氧分压P50值表示，它与氧亲和力逆相关。因此，P50越低，氧亲和力越高。可以利用本领域已知的多种方法测定全血(以及全血的组分诸如红细胞和血红蛋白)的氧亲和力。(参见例如 Winslow，R.M.等，J. Biol. Chem. 1977，252 :2331-37)。也可使用市售的ΗΕΜ0Χ 分析仪(TCS Scientific Corporation,New Hope,PA)测定氧亲和力。(参见例如 Vandegriff 和 Shrager 的“Methods in Enzymology”(Everse 等编著)232 :460(1994))。术语“全氟化碳”在这里是指包含氟原子的合成的惰性分子，以及完全由卤素(Br，F，C1)和碳原子组成的惰性分子。其乳剂形式比等量的血浆或水能够多溶解很多倍的氧气，因而正开发为血液物质。 术语“聚乙二醇”或“PEG”在这里是指具有化学通式H(0CH2CH2)n0H(也称为α-氢-ω-羟基-聚(氧-1，2-亚乙基))的液体、固体或聚合物，其中“η”大于或等于4。该术语包括任何PEG试剂、取代或未取代的形式。市售PEG有多种形式(例如，Carbowax (DowChemical, Midland, MI)，Poly- (ArchChemicals, Norwalk, CT),和 Solbase)。术语“聚乙二醇缀合血红蛋白”或“PEG-Hb缀合物”在这里是指血红蛋白上面共价结合有PEG。术语“无基质血红蛋白”或“sra”在这里是指已经从中去除所有红细胞膜的血红蛋白。术语“表面修饰血红蛋白”在这里指已经连接化学基团(通常为聚合物)的血红蛋白，诸如葡聚糖或聚环氧烷的血红蛋白。术语“表面修饰氧合血红蛋白”是指表面修饰时处于“R”状态的血红蛋白。有机聚合物在之前的研究中，发现了表面修饰血红蛋白的分子应足够大以避免被肾脏清除并达到理想的循环半衰期。Blumenstein, J.等人确定,分子量为84，000道尔顿(“Da”)或以上能够达到以上目的(“Blood Substitutes and Plasma Expanders”，Alan R. Liss,editors, NewYork, N. Y.，205_212页(1978))。在该研究中，作者将血红蛋白与不同分子量的葡聚糖缀合。他们报道了，血红蛋白(分子量64，OOODa)和葡聚糖(分子量20，OOODa)的缀合物“被缓慢从循环中清除、由肾脏清除的几乎可忽略”。此外，还观察到提高分子量至84，OOODa以上并未明显改变这些清除曲线。本发明提供了缀合PAO到Hb的方法，其中可以得到至少84，OOODa的分子量。适合的聚环氧烷聚合物包括，聚环氧乙烷(-(CH2CH2O)n-)、聚环氧丙烷(-(CH(CH3)CH2O)n-)和聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物(-(CH2CH2O)n-(CH (CH3) CH2O) n-)。适于实施本发明的其它直、支链以及任意取代的合成聚合物为医学领域所公知。因为其药物可接受性以及商业可利用性，最常见的用于修饰血红蛋白表面的PAO是PEG。另外，PEG根据其分子中环氧乙烷(即-OCH2CH2-)亚单元的重复的数目可以得到多种分子量。PEG试剂通常后接一个对应其平均分子量的数字。例如，PEG-200的平均分子量为200Da，可能的分子量范围是190-210Da。血红蛋白的修饰
在本发明方法中使用的血红蛋白不限来源并且可以从人或动物身上获得，或从基因重组技术中得到。它可以是天然(未修饰)的或修饰过的，或经过重组改造的。人α-和β -球蛋白基因均已克隆并测序(Liebhaber S. Α.等，PNAS，1980，77 :7054-7058 ；Marotta,C.A.等，J. Biol. Chem. 1977，353 :5040-5053 ( β -球蛋白 cDNA))。此外，如今使用定位诱变已经制备了许多重组的修饰血红蛋白，尽管据报道这些“突变”血红蛋白变体具有并不理想的高氧亲和力(参见例如Nagai，K.等PNAS1985，82 :7252-7255)。优选的，血红蛋白是无基质和无内毒素的。用于增加血红蛋白上可缀合位点的数目的方法是通过引入巯基(“-SH”)，巯基比自由氨基更易于与PEG-Mal反应。本领域已知有多种方法可以对蛋白质硫醇化。它们包括，例如，通过与琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯反应以硫醇化蛋白质中含自由氨基的残基，然后用二硫苏糖醇(“DTT”)或三(2-羧乙基)磷酸(“TCEP”)还原3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基缀合物。氨基也可以直接通过与琥珀酰亚胺乙酰硫代乙酸酯反应进行硫醇化，接着用50mM羟胺或联胺在近中性pH下去除乙酰基。此外，2-亚氨基四氢噻吩(2-IT)可以用于将自由氨基转换为巯基。
天然人体血红蛋白具有固定数量的氨基酸残基侧链，可以硫醇化后与马来酰亚胺活化的PAO分子进行缀合。这些在下表中列出
权利要求
1.一种制备聚乙二醇缀合血红蛋白(PEG-Hb)的方法，包括如下步骤 a)将血红蛋白(Hb)与2-亚氨基四氢噻吩(2-IT)在水稀释液中混合，其中在稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7-8倍摩尔过量，以形成硫醇化血红蛋白；以及 b)在硫醇化血红蛋白的水稀释液中加入聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺(Mal)，其中在释释液中PEG-Mal的浓度相对血红蛋白浓度为9-15倍摩尔过量以形成PEG-Hb缀合物，其中PEG-Mal具有4000-6000道尔顿(Da)的平均分子量； 其中PEG-Hb缀合物含有平均7. 1-8. 9PEG分子/Hb。
2.根据权利要求I的方法，其中稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7.5倍摩尔过量。
3.根据权利要求I的方法，其中稀释液中PEG-Mal的浓度相对血红蛋白浓度为12倍摩尔过量。
4.根据权利要求I的方法，其中PEG-MaI具有5000道尔顿的平均分子量。
5.根据权利要求I的方法，其中PEG-Hb缀合物在血红蛋白50%饱和时的氧分压(p50)低于基本相同条件下测得的从同等来源得到的天然无基质血红蛋白的氧分压。
6.根据权利要求5的方法，其中PEG-Hb缀合物的p50低于10毫米汞柱(mmHg)。
7.根据权利要求5的方法，其中PEG-Hb缀合物的p50在4和8mmHg之间。
8.根据权利要求5的方法，其中步骤a)在pH7-9进行。
全文摘要
本发明主要涉及通过减少反应物比例制备聚乙二醇(“PEG”)缀合血红蛋白(“Hb”)的方法。更具体地说，本发明涉及制备增加产率和纯度的PEG缀合Hb(“PEG-Hb”)的方法。
文档编号G01N33/72GK102859364SQ201180011267
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月23日 优先权日2010年2月25日
发明者A·马拉瓦立, K·D·梵德格里夫 申请人:桑格特公司