专利名称：聚乙二醇人生长激素缀合物及其制备方法及其药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质与聚乙二醇PEG缀合物，以及其制备方法和药物用途。
背景技术：
Ross Clark等于1996年，The Journal of Biological Chemistry 27121969-21977，1996，首次公开了用PEG偶联人生长激素的方法和药理活性的研究结果，他们应用的PEG的分子量为5kDa，PEG-GH缀合物的半衰期明显延长，可以每5天注射一次，使患者使用更方便。但此缀合产物的每个GH分子上偶联了1-7个PEG分子，缀合物产物是一种混合物，偶联位点不确定，每种成分无法定量，也无法完全分离，使得批与批之间缀合物的产品成分差异性较大，无法应用于临床。
各种天然的和重组的蛋白质都具有医药用途。一旦将它们纯化、分离并配成药品，可以将它们经非肠道途径进行给药，而用于不同的医疗适应症，然而，非肠道途径给予的蛋白质可以是免疫原性的、可以是相对不溶于水的且可以具有较短的药理半衰期。因此，难以使所述的蛋白质在患者体内达到有治疗作用的血药浓度。
通过将所述的蛋白质与聚合物如PEG偶联后可以克服这些难题。Davis等在美国专利4179337中公开了将PEG与蛋白质如酶和胰岛素偶联以获得具有低于原始蛋白质的免疫原性作用并仍可保持其基本比例的药理活性的缀合物的技术方案。Katre等在美国专利4766106和4917888中还公开了通过聚合物偶联使蛋白质增溶的技术方案。同样，可以将PEG和其它聚合物与蛋白质偶联以便降低免疫原性并延长半衰期。
随着生物医学及基因工程技术的发展和深入，大量的药用PEG化蛋白质被制备、生产并应用于临床。现在已应用于临床的药用PEG化蛋白质有PEG-干扰素、PEG-粒细胞集落刺激因子等。
人生长激素是人脑垂体分泌的一种蛋白类激素，能促进人体充分利用各方面的能量和原料合成蛋白质，促进营养中的钙沉积在骨骼，增加身体细胞的大小和数量，使骨骼和内脏器官成比例增长。1958年国外科学家就从人脑垂体中提取出生长激素用以治疗侏儒症，人类垂体重约0.5g，含GH量极微，每个垂体仅含GH5-10mg。由于垂体来源的限制，临床应用和研究进展极其缓慢。1979年，DNA生物技术使得人类GH的DNA顺序密码在大肠杆菌中的表达成为可能，从而生产了用DNA重组技术人工合成的重组人生长激素rhGH。随着生产技术的不断提高，rhGH产品的质量及产量均有很大提高。1985年，用基因工程技术人工合成的重组人生长激素开始应用于临床，给患者带来福音。由于rhGH在体内的半衰期短，患者必须每天注射一次，使用非常不方便。
发明内容
根据hGH的N端暴露的特点，选择性的将PEG分子偶联到hGH的N端，而不与hGH蛋白上的其它自由氨基反应，此方法生产的PEG-hGH为每个hGH分子与单一PEG分子偶联，最终产物成分单一，易于分离纯化，收率高。PEG-hGH的半衰期可达5-7天，减少用药频率，每5-7天注射一次，方便患者使用。
本发明是一种被连接到一种聚乙二醇上的人生长激素，该PEG的分子量为15kDa到50kDa，其中每个hGH分子与单一PEG分子偶联；本发明不限于特定分子量的PEG分子，但它们都具有一个单一的具有反应活性的醛基。在一个实施方案中，所述的聚乙二醇是PEG40000。在一个优选的实施方案中，用尿烷键使所述的hGH与所述的PEG40000分子连接。
本发明制备聚乙二醇人生长激素缀合物的方法(a)烷基化反应向pH为3-9的4℃溶液中加入hGH和已活化的PEG醛，hGH与PEG醛摩尔比为1∶0.1到1∶1，PEG醛的平均分子量为15kDa到50kDa；(b)反应产物的分离和纯化在该反应过程中，蛋白质改性的程度用分子筛凝胶色谱进行监测，用含有0.1M氯化钠、pH为6.5的50mM磷酸钠在0.4毫升/分钟的流速下进行洗脱；5小时后，经分子筛凝胶色谱法的分析表明所有的hGH已经基本上转化成为N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式；随后用无菌水将该反应混合物总共稀释五倍，并且将其加到一个离子交换柱上，再用pH为7.0的50mM磷酸钠缓冲溶液饱和该柱；在1毫升/分钟的流速下向该柱中装填反应混合物，并且用三倍柱体积的同样的缓冲溶液洗脱未反应的PEG的醛；采用线性梯度洗脱N-末端聚乙二醇化的hGH，该线性梯度采用从0％至100％的50mM磷酸钠，其pH为7.5、含0.2M氯化钠，进行100分钟，含有该hGH缀合物的部分被合并、浓缩并且无菌过滤。
通过烷基化的聚乙二醇化作用通常涉及在有一种还原剂存在下将PEG的一种醛的衍生物与hGH反应，通常生成的是多个PEG与hGH上的多个氨基酸偶联的缀合物。但人们可以通过控制该反应条件，从而基本上只使hGH的N-末端α-氨基上发生该聚乙二醇化反应，即一个单聚乙二醇化的物质，从而达到单一PEG分子连接到单一hGH分子上的效果。
通过还原性烷基化作用生产一种单聚乙二醇化产物的衍生化作用，利用了不同类型伯胺基的赖氨酸与hGH的N-末端不同的反应性能，该伯胺基是在hGH的衍生化作用中可以利用的基团。上述反应是在pH值3-9下进行的，而该PH值可以让人们利用赖氨酸残基的ε-氨基与hGH的N-末端残基α-氨基间pKa值的差异。通过这种选择性的衍生化作用，向一种多肽上连接含有一个活性基团的PEG是可以控制的。hGH与该PEG的结合作用主要地发生在hGH的N-末端上，而其它具反应活性的基团如赖氨酸侧链氨基，不发生明显的改性作用。在一个重要的方面，本发明提供了一种基本上均一的单PEG/hGH的结合物的分子制剂，而这表明hGH仅在一个单一的位置上被连接到一个聚合物分子上。更具体地讲，如果使用聚乙二醇的话，本发明也提供聚乙二醇化的hGH，其可能缺少抗原连接基因并且含有被直接偶联到该hGH多肽上的聚乙二醇分子。
另外一个重要的考虑为聚合物与hGH的分子比。一般说来，该聚合物与hGH的分子比越低，可以连接到hGH上的聚合物分子的数目也越少。一般说来，对于此处所计划的聚乙二醇化反应而言，该聚合物优选的平均分子量为从15kDa至50kDa。特别优选40kDa。hGH与聚乙二醇的比值通常在1∶0.1至1∶1的范围内，优选1∶0.15至1∶0.6。
pH值也影响待用的聚合物与hGH之间的比值。一般说来，如果pH值较低，则需要聚合物hGH的比值量较大，即N-末端α-氨基的反应活性较差，则需要更多的聚合物来实现最佳反应条件。如果该pH值较高，则PEG∶hGH的比值不需要如此之大，即有较多的反应活性基团可以利用，于是需要较少的聚合物分子。对于本发明的目的而言，该pH值通常落在3-9的范围内，优选4.5-7。
通过采用如上所示的条件，按照本发明的还原性烷基化作用提供了一种连接方法，其中该连接为将PEG选择性地连接到任意一种在氨基末端处具有一个α-氨基的hGH的多肽蛋白质上，并且提供了制备一种基本上为均一的单PEG-hGH缀合物。该PEG-hGH缀合物含有一个在N-末端定位的PEG分子，而在hGH分子其它赖氨酸的侧链基团都不反应。上述制剂优选为生产出大于60％的PEG-hGH缀合物，并且更优选生产出大于70％的PEG-hGH缀合物，同时还伴有未反应的PEG及未反应的hGH分子。下面的实施例提供了一种至少有大约70％的PEG-hGH缀合和与大约70％的未反应的hGH的制剂。该PEG-hGH缀合物是具有生物学活性的。
对于本还原性烷基化作用而言，还原剂在液体状态下应当是稳定的，并且优选该还原剂能够仅还原在还原性烷基化作用的初期步骤中所形成的席夫碱Schiff’s base。优先的还原剂可以选自氢化钠、氰基硼氢钠，二甲胺甲硼烷三甲胺甲硼烷与吡啶甲硼烷所组成，特别优选的还原剂为氰基硼氢钠。
本发明也涉及聚乙二醇人生长激素缀合物在制备、治疗儿童或成人生长激素缺乏症的药物中的应用。
如上述所提及的，与本发明相应的PEG-hGH缀合物能够用于所有已知的天然hGH相同的用途，但注射频率由每天一次改为每5-7天一次。已有的临床应用已经表明hGH的临床效果，例如能促进人体充分利用各方面的能量和原料合成蛋白质，促进营养中的钙沉积在骨骼，增加身体细胞的大小和数量，使骨骼和内脏器官成比例增长，从而促进儿童身高的线性增长。
对于治疗用途而言，本发明的PEG-hGH缀合物可以配制于并且可以溶在任意一种无菌的生物相容的药用载体包括盐水，缓冲盐水及水中进行使用。在治疗疾病中发挥效用的hGH聚合物的用量依赖于上述疾病或状况的实质，并且该用量可以通过临床试验进行测定。当有可能时，人们首先在有用的动物体模型内测定本发明的PEG-hGH缀合物的疗效。注射的方法包括皮下，肌内给药。
使用剂量为6mgPEG-hGH/kg体重/次，每5-7天注射一次。
PEG-hGH缀合物进行实际应用时，要保证它们在一段时间期限内的稳定性，并且还要便于患者使用，这就要加一些保护剂和稳定剂来保护PEG-hGH并制成特定的制剂。对PEG-hGH我们研究了液体剂型和冻干剂型两种剂型。
液体剂型的中各物质含量为每毫升含30mg PEG-hGH，10mM柠檬酸钠，4mg吐温20，17.4mg氯化钠，苯酚5mg，pH6.0。
冻干剂型先配成各物质含量为每毫升含30mg PEG-hGH，甘氨酸120mg，甘露醇12mg，乳酸12mg，碳酸氢钠100mg的溶液，之后用冷冻干燥法制成冻干剂型，患者使用前加注射用水溶解。
在一个药效试验的实验例中，该方法包括将再溶解PEG-hGH的溶液引入生长激素缺乏动物体内的步骤。在该实验例中，所述的动物是大鼠，生长激素缺乏的大鼠是去垂体大鼠。
附图名称是各组实验动物累计增重与时间关系曲线。 阴性对照组 hGH组 40KGH组 60KGH-30组 60KGH-70组
具体实施例方式根据本发明的具体的hGH的制备及其生理学与生物学特性显示在下文中。所给出的这些实施例更为详尽地描述了本发明，但是并不打算用于限制本发明。在这些实施例中，hGH均来源于基因重组技术。
实施例1连接位点在N-末端α-氨基处的PEG40kDa-hGH缀合物的制备向溶于50mM磷酸钠，该溶液pH为5.5且含有20mMNaCNBH3，的2.5毫克/毫升hGH的一个冷却4℃并搅拌的溶液中加入0.3倍摩尔的活化聚乙二醇的醛，该醛的平均分子量为40000道尔顿，即40kDa。hGH来自大肠杆菌表达技术生产。
在该反应过程中，蛋白质改性的程度用分子筛凝胶色谱进行监测，该色谱使用一个Superose 6HR 10/30柱，Pharmacia，用含有0.1M氯化钠、pH为6.5的50mM磷酸钠在0.4毫升/分钟的流速下进行洗脱。5小时后。经分子筛凝胶色谱法的分析表明所有的hGH已经基本上转化成为N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式。
随后用无菌水将该反应混合物总共稀释五倍，并且将其加到一个HiLoad 16/10S Sepharose HP离子交换柱上，Pharmacia，再用pH为7.0的50mM磷酸钠缓冲溶液饱和该柱。在1毫升/分钟的流速下向该柱中装填反应混合物，并且用三倍柱体积的同样的缓冲溶液洗脱未反应的PEG的醛。采用线性梯度洗脱N-末端聚乙二醇化的hGH，该线性梯度采用从0％至100％的50mM磷酸钠，其pH为7.5、含0.2M氯化钠，进行了100分钟，含有该hGH衍生物的部分被合并、浓缩并且无菌过滤。
实施例2连接位点在N-末端α-氨基处的PEG20kDa-hGH结合物的制备向溶于50mM磷酸钠，该溶液pH为4.5且含有20mM NaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一个冷却4℃并搅拌的溶液中加入0.6倍摩尔的活化聚乙二醇的醛，该醛的平均分子量为20000道尔顿，即20kDa。hGH来自哺乳动物表达技术生产。其余步骤重复实施例1的步骤。
实施例3连接位点在N-末端α-氨基处的PEG15kDa-hGH结合物的制备向溶于50mM磷酸钠，该溶液pH为7.0且含有20mM NaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一个4℃并搅拌的溶液中加入0.15倍摩尔的活化聚乙二醇的醛，该醛的平均分子量为15000道尔顿，15kDa。hGH来自哺乳动物表达技术生产。其余步骤重复实施例1的步骤。
实施例4连接位点在N-末端α-氨基处的PEG50kDa-hGH结合物的制备向溶于50mM磷酸钠，该溶液pH为6且含有20mM NaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一个4℃并搅拌的溶液中加入0.2倍摩尔的活化聚乙二醇的醛，该醛的平均分子量为50000道尔顿，即50kDa。hGH来自大肠杆菌表达技术生产。其余步骤重复实施例1的步骤。
实施例5连接位点在N-末端α-氨基处的PEG(30kDa)-hGH结合物的制备向溶于50mM磷酸钠，该溶液pH为5.0且含有20mMNaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一个4℃并搅拌的溶液中加入0.4倍摩尔的活化聚乙二醇的醛，该醛的平均分子量为30000道尔顿，即30kDa。hGH来自大肠杆菌表达技术生产。其余步骤重复实施例1的步骤。
实施例6液体剂型的制备将实施例1方法制备的PEG-hGH 1000mg溶解于330ml液体剂型母液中，其中含10mM柠檬酸钠，4mg吐温20，17.4mg氯化钠，苯酚5mg，pH6.0，无菌过滤后分装至330个2ml安瓶中，每瓶1ml。
实施例7冻干剂型将实施例2方法制备的PEG-hGH 1000mg溶解于330ml冻干剂型母液中，每ml母液中含有甘氨酸120mg，甘露醇12mg，乳酸12mg，碳酸氢钠100mg的溶液，无菌过滤之后，分装至330个2ml安瓶中，用冷冻干燥法制成冻干剂型，注射前加注射用水溶解。
实验例利用摘除脑垂体的大鼠对PEG-hGH缀合物体内活性的评价测定人生长激素产品活性的最经典方法之一是未成年去垂体大鼠的体重增加法(Body Weight Gain，BWG)，已载入欧洲药典。
实验方法实验用药hGH原始样品每瓶含0.5克重组人生长激素，3.0克赋形剂。用Sephadex G25脱盐柱缓冲体系变更为磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)。首次给药前用载体稀释至10mg/ml。
60KGH60KGH为PEG40000-hGH，原始浓度0.088毫克/毫升。首次给药前用载体稀释到70毫克/毫升。
40KGH40KGH为PEG20000-hGH，原始浓度0.16毫克/毫升。首次给药前用载体稀释至70微克/毫升。
纯度hGH符合《中华人民共和国药典2000版》要求。
60KGHPEG40000-hGH缀合物占95％。
40KGHPEG20000-hGH缀合物占95％。
实验动物Wister品系大鼠(白求恩医科大学动物实验部)，雄性，六周龄时将其脑垂体摘除。在脑垂体摘除后二周时，筛除体重增加速率超过标准差一倍的大鼠，共53只去垂体大鼠用于本研究，按照以下数量进行抽签分组。
阴性对照组大鼠10只；阳性对照组大鼠10只；60KGH(70微克)给药组大鼠11只；60KGH(30微克)给药组大鼠11只；40KGH(70微克)给药组大鼠11只。
年龄脑垂体摘除时为6周龄，开始给药时为8周龄。
接收时体重范围为85.5克至111.6克。
编号方法每笼2只大鼠，用苦味酸饱合溶液在其中一只大鼠背部做标记，有标记者为1号码，无标记者为0号码，附加在笼号后面。示例第3笼的大鼠编号为30(无标记)和31号(有标记)，第10笼大鼠编号为100(无标记)和101(有标记)。
给药剂量和给药程序载体每次给予1毫升/大鼠，每天给予一次，连续给予14天。
hGH 每次给予10微克/大鼠，每天给予一次，连续给予14天。
40KGH每次给予70微克/大鼠，首日和第8日各给予一次。
60KGH每次给予70微克/大鼠，首日和第8日各给予一次。
60KGH每次给予30微克/大鼠，首日和第8日各给予一次。
给药途径皮下注射。
体重测量频率给药前每2-3天测量一次。从首次给药起每天测量一次。
方法使用电子台秤测量大鼠体重。
实验结果与结论给药前大鼠体重日平均增长速率为0.72g±0.36g各组大鼠的平均体重为载体109.76g±6.60ghGH 110.86g±5.00g40KGH 107.85g±8.87g60KGH(30μg)112.78±7.24g60KGH(70μg)108.10g±5.73g给药后各组大鼠体重每日平均累积增重(n天体重-0天体重)显示在图1中。
实验结果显示(1)阴性对照组(Vehicle)给药前后体重变化趋势一致，阴性对照成立；
(2)阳性对照组(hGH)给药前体重变化与阴性对照组和其他给药组一致；给药后日平均累积增重基本成直线上升，日体重增长速率均匀。因此阳性对照成立；(3)70μg PEG-hGH给药组(40KGH和60KGH)的日平均
权利要求
1.一种聚乙二醇人生长激素缀合物，其特征是一种被连接到一种聚乙二醇(PEG)上的人生长激素(hGH)，该PEG的分子量为15kDa到50kDa，其中每个hGH分子与单一PEG分子偶联。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇人生长激素缀合物，其特征在于聚乙二醇(PEG)有一个单一的具反应活性的醛基。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇人生长激素缀合物，其特征在于人生长激素(hGH)通过N端α氨基被连接到PEG上。
4.根据权利要求1中所述的聚乙二醇人生长激素缀合物，其特征在于PEG的分子量为20kDa到40kDa。
5.根据权利要求1中所述的聚乙二醇人生长激素缀合物，其特征在于人生长激素指基因工程表达的人生长激素分子。
6.一种制备聚乙二醇人生长激素缀合物的方法，其特征在于(a)烷基化反应向pH为3-9的4℃溶液中加入hGH和已活化的PEG醛，hGH与PEG醛摩尔比为1∶0.1到1∶1，PEG醛的平均分子量为15kDa到50kDa；(b)反应产物的分离和纯化在该反应过程中，蛋白质改性的程度用分子筛凝胶色谱进行监测，用含有0.1M氯化钠、pH为6.5的50mM磷酸钠在0.4毫升/分钟的流速下进行洗脱；5小时后，经分子筛凝胶色谱法的分析表明所有的hGH已经基本上转化成为N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式；随后用无菌水将该反应混合物总共稀释五倍，并且将其加到一个离子交换柱上，再用pH为7.0的50mM磷酸钠缓冲溶液饱和该柱；在1毫升/分钟的流速下向该柱中装填反应混合物，并且用三倍柱体积的同样的缓冲溶液洗脱未反应的PEG的醛；采用线性梯度洗脱N-末端聚乙二醇化的hGH，该线性梯度采用从0％至100％的50mM磷酸钠，其pH为7.5、含0.2M氯化钠，进行100分钟，含有该hGH缀合物的部分被合并、浓缩并且无菌过滤。
7.根据权利要求6中所述的制备聚乙二醇人生长激素缀合物的方法，其特征在于在烷基化反应时，hGH∶PEG范围摩尔比为1∶0.15到1∶0.6，pH范围为4.5到7。
8.一种聚乙二醇人生长激素缀合物在制备治疗儿童或成人生长激素缺乏症的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种聚乙二醇人生长激素缀合物及其制备方法及药物用途，本发明为每个hGH分子与单一PEG分子偶联的缀合物，防止hGH在体内的迅速降解，形成的聚合物比hGH具有更好的稳定性，及明显延长体内的半衰期。
文档编号C07K14/435GK1468863SQ0213261
公开日2004年1月21日 申请日期2002年7月15日 优先权日2002年7月15日
发明者王思勉 申请人:王思勉