专利名称：寡肽为骨架的聚乙二醇活性衍生物、其制备方法及与药物分子的结合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚乙二醇活性衍生物，尤其涉及一种寡肽为骨架的聚乙二醇活性衍生物，及其制备方法和所述衍生物与药物分子的结合物。
背景技术：
各种天然和重组的蛋白质和多肽都具有一定的医药可用性。对其纯化、分离后的各种制品，即可通过非经胃肠道途径给药来用于各种治疗适应症。然而，非经胃肠道途径给药的蛋白质可能具有免疫原性，也可能是相对不溶于水的，也可能具有很短的药理学半衰期。因此，如何提高并保持这些药物分子在患者体内的有效血药浓度，具有非常显著的实际意义。
同样，除蛋白质外的各种天然药物成分如黄酮类、萜类、醌类、甾体以及各种生物碱，在临床上也有对其性能作进一步改进的要求，如提高药物的药理学半衰期、增强其稳定性及到达靶部位的几率、提高水溶性、改变给药途径以及改善生物利用度等。
目前，聚乙二醇衍生物广泛地用于与蛋白质、多肽以及其他治疗药物结合以延长所述药物的生理半衰期，降低其免疫原性和毒性。在临床使用中，PEG及其衍生物作为制作药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用，而将PEG键合到药物分子的尝试在最近十年里也得到了长足的发展，在许多批准药品中被广泛使用，如
，一种α-干扰素与聚乙二醇的结合物，就表现出了更长的循环半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的结合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。它们在人体内的代谢过程已相当清楚，是一种安全的，无副作用的药物改性剂。
许多PEG的衍生物已被报道，例如第5672662号美国专利报道了线性PEG丙酸和丁酸以及它们的NHS酯。在第5643575号美国专利中披露了一种U形分支的聚乙二醇结构。在这种新的聚乙二醇衍生物中两个线性的聚乙二醇组分通过两个相同的官能团(比如两个氨基或两个羧基)连接在一个分子或一种结构上。在此公开的一个实施例中，发明人指出带分支的PEG是由线性的PEG与赖氨酸制得的，而赖氨酸是一种带有两个氨基的氨基酸。在中国专利(ZL03801105.0)中，展示了一种Y形分支的聚乙二醇衍生物。
虽然现有技术中已经提供了多种基于聚乙二醇的聚乙二醇活性衍生物，但这些衍生物用于结合某些药物时，尤其是对药物分子的定位修饰方面，难以起到其应有的作用。从实践中发现，部分定位修饰蛋白质由于所需修饰的官能团为非活性基团，呈化学反应惰性。现有的修饰用聚乙二醇衍生物存在修饰度低，结合稳定性差等不利因素。因此，本申请的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型的聚乙二醇活性衍生物。该技术增加了修饰度和转化率，产物的稳定性得到一定提高。
在现有技术中，已知“寡肽”是两个以上氨基酸形成的肽类分子。当其中至少有两个氨基酸是不相同时，就能形成多种多样的寡肽分子。本申请的发明人发现，当这些寡肽分子与两个以上的聚乙二醇链键连，同时还保留至少一个可活化的基团，就形成了一种独特的聚乙二醇衍生物。
本发明提供的就是这种新型的聚乙二醇与寡肽形成的具有多聚乙二醇链的活性衍生物，其制备方法以及与药物分子的结合物。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种由通式I表示的由聚乙二醇与寡肽形成的化合物
其中 PEGi是相同或不同的聚乙二醇链，所述的聚乙二醇链具有如下通式
其中 R为H或C1-12烷基； n为6～1300的任何整数； i为1，2，…，j； j为≥2的整数； Xi是相同的或不同的连接基团，所述的连接基团选自由-(CH2)mOCOO-、-(CH2)mOCONH-、-(CH2)mNHCOO-、-(CH2)mNHCONH-、-(CH2)mCOO-、-(CH2)mCONH-组成的组，其中，m为0-10的整数； A源自于寡肽，所述的寡肽包括2-20个氨基酸，其中至少有两个氨基酸是不相同的； Fp表示相同的或不同的活性基团，所述的活性基团选自由羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼基、马来酰亚胺基和吡啶二硫化物组成的组； p为1，2，…，q； q为≥1的整数。
在本发明的优选实施方案中，所述的聚乙二醇链中的R选自由氢、甲基、乙基、异丙基组成的组。所述的聚乙二醇链中的n为60-800。A源自于Gly-Lys，Gly-Lys(Gly)，Glu-Lys或者Gly-Lys(Gly)-Lys。
优选地，本发明提供一种由通式II表示的由聚乙二醇与寡肽形成的化合物
其中mPEG为CH3O-(CH2CH2O)n-。
在通式II的优选实施方案中，A源自于Gly-Lys，Gly-Lys(Gly)或者Glu-Lys。
优选地，本发明提供一种由通式III表示的由聚乙二醇与寡肽形成的化合物
在优选的实施方案中，通式III中的A源自于Gly-Lys，Gly-Lys(Gly)，或者Glu-Lys。
本发明的另一个方面是提供一种制备由通式I表示的由聚乙二醇与寡肽形成的化合物的方法，所述方法包括在中性或碱性条件下，用聚乙二醇单甲醚酯与所述的寡肽反应，产物进行分离纯化，然后再进行根据Fp的类型活性基团改造。
优选地，所述的聚乙二醇单甲醚酯是聚乙二醇单甲醚-乙酸-N羟基丁二酰亚胺酯或者为聚乙二醇单甲醚-原碳酸-N羟基丁二酰亚胺酯。
本发明的再一个方面是提供由聚乙二醇与寡肽形成的化合物通过其活性基团Fp与药物分子所形成的结合物。
优选地，所述的药物分子选自由氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱组成的组。所述的药物分子可以是基因工程药物，选自由α-、β-或γ-干扰素，生长素，EPO，GCSF，白介素，溶菌酶，抗体和抗体片段组成的组。
图1是实施例9中双链聚乙二醇活性衍生物(3)与溶菌酶链接的结合物的GFC谱图。
具体实施内容 在本发明所提供的化合物中，所述的聚乙二醇应当包括乙二醇的均聚物和乙二醇与丙二醇等的共聚物。
以下用聚乙二醇为例，说明本发明具有新型的聚乙二醇与寡肽形成的具有多聚乙二醇链的活性衍生物的制备方法。
聚乙二醇链 聚乙二醇(PEG)链的结构通式如下所示
其中 R为H或C1-12烷基； n可以是任何整数，表征其聚合度。
当R为低级烷基时，R可以是含有1-6个碳原子的任何低级烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基或正己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)，其他聚乙二醇类似物或乙二醇与环氧丙烷等的共聚物也可用于此发明应用。
对聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～60,000道尔顿，这相当于n为大约6～1300。更优选为，n为78、112和450，这分别相应于分子量为3500、5000和20,000。由于通常由其平均分子量而非自重复单元限定的起始PEG化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数n表示PEG聚合物中的自重复单元。各种分子量的起始PEG化合物可以通过本领域中的已知方法制备或者可以从商业来源得到。
寡肽 一般所称的寡肽是两个以上氨基酸形成的肽类分子。寡肽分子可以是活性分子，也可以是非活性分子。有部分的活性分子寡肽分子在临床上得到了应用，如GHK(Gly-His-Lys)，His Tag(His-His-His-His-His-His)，KHG(Lys-His-Gly)，RGD(Arg-Gly-Asp)，TRH(Gly-His-Pro)，GSH(Glu-Cys-Gly)，TP-5(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)等，这些小分子寡肽所表现出的独特的生理活性一直是人们所关注的重点。它们在分子识别、信号传递、蛋白整合、淋巴细胞识别、癌细胞转移等方面都发挥重要的作用。如含RGD序列的多肽可以抑制多种细胞的粘合作用，具有明显的抗肿瘤转移的效果。而TP-5(胸腺五肽)，在淋巴细胞识别和激活上也表现突出。
本发明中所使用的寡肽是指包括2-20个氨基酸，例如，如下所列寡肽分子可以用于本发明 二肽GK(Gly-Lys)，(Lys-Glu)； 三肽(Gly-Lys(Gly))，GHK(Gly-His-Lys)，KHG(Lys-His-Gly)，RGD(Arg-Gly-Asp)，TRH(Gly-His-Pro)，GSH(Glu-Cys-Gly)； 四肽(Gly-Lys(Gly)-Lys)； 五肽TP-5(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)； 其他His Tag(His-His-His-His-His-His)，等等。
在本发明中所使用的寡肽优选自非活性寡肽，并且其中至少有两个氨基酸是不相同的
根据本发明的聚乙二醇与寡肽形成的具有多聚乙二醇链的活性衍生物可以通过对寡肽中的活性基团，如氨基、巯基、羟基和羧基，进行聚乙二醇化后获得。在本领域中可以采用很通用的合成和制备办法得到。根据不同的权利要求的结构化合物，需要采用相应的合成和制备办法，具体情况可以参考后面的实施例以及本领域的各种技术文献资料和专利成果。
活性基团 在根据本发明之聚乙二醇与寡肽形成的具有多聚乙二醇链的活性衍生物的应用中，活性基团Fp起着决定性的作用，不同活性基团的衍生物具有不同的用途。这些功能基团的引入，将决定该衍生物的应用领域和适用结构。最常用的活性基团是N-羟基丁二酰亚胺酯，如通式II和III式所示。
同样的，也可通过在本领域可以很容易的获得相关的合成方法进行改性，进而获得醛基活性基团
同样的，也可通过在本领域可以很容易的获得相关的合成方法进行改性，进而获得马来酰亚胺功能基团
许多药物成分中都含有活性的氨基、羧基、羟基等官能团，它们在生物体内通常都与单糖、多糖、核苷、多聚核苷、磷酰基等成分结合，以形成在生物体中有活性的药理结构。
因此官能团改进后的聚乙二醇衍生物可以通过相同的方式和这些药物分子结合，以替代生物有机分子，克服生物有机分子在生物体内生理半衰期短、药效持续时间短的毛病。
本发明的聚乙二醇与寡肽形成的具有多聚乙二醇链的活性衍生物使用适当的活性基团提供与药物分子的结合物，所述的活性基团使蛋白质、多肽或者其他天然药物中的游离氨基、羟基、硫羟基等与PEG衍生物连接起来。对大分子的蛋白质或多肽，可以键合上一个到多个所述的活性衍生物，以改善药物分子在体内的生理作用；对小分子的天然药物活性成分，可以通过适当的活性基团在一个所述的活性衍生物中连接一个到多个药物分子，以保证适当的药物浓度和提供缓释功能。
以上各种应用领域只是对该PEG衍生物的医药应用提供一个可能参考的模式，具体的使用和选择需要根据动物药理、毒理和临床等必须的环节予以确认。
在本发明的结合物中，药物分子选自由氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱组成的组。其中，所述的蛋白质药物分子选自由干扰素类药物，EPO类药物，生长素类药物，抗体类药物组成的组。
本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似用途的试剂进行。因此，采用的给药方式可选择通过口、鼻内、直肠、透皮或注射给药方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，例如，片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂等，优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。
通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1至约99重量％的本发明结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。
优选的给药途径是注射给药，采用常规日剂量方案，该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的结合物或其药学上可接受的盐也可配制成注射用剂，例如使用约0.5至约50％的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中，实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。
可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物(约0.5至约20％)和选择性存在的药用辅剂溶解、分散于载体中，载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。
如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的，例如可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。无论如何，按照本发明的技术，所使用的组合物将含有治疗有效量的本发明结合物，以用于治疗相应的疾病。
实施例 下面结合实例描述本发明的结合物及其制备方法，它不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。
实施例1 合成聚乙二醇乙酸与Gly-Lys二肽形成的双链聚乙二醇活性衍生物(1)
将20克分子量为20,000的聚乙二醇单甲醚乙酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(mPEG-SCM)溶于含1克Gly-Lys二肽的磷酸盐缓冲液中，pH＝8.5，室温下搅拌三小时。盐酸调pH＝3，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，真空蒸出溶剂，加入200毫升异丙醇沉淀。沉淀过滤，真空干燥。分支型的PEG酸性产物可进一步用离子交换色谱柱纯化。产率8克(40％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，3个氢)，4.15(t，2个氢)。
0.5克分支型的PEG酸(由上步制得)，溶于5毫升二氯甲烷，向溶液中加入7毫克N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和13毫克二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌6小时，过滤除去沉淀，真空蒸出溶剂，剩余物加入20毫升异丙醇(IPA)中，过滤收集沉淀并在真空中干燥。产率0.48克(96％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，6个氢)2.81(s，4个氢)，3.96(s，2个氢)，4.07(s，2个氢)，4.48(t，2个氢)。
实施例2 合成聚乙二醇与Gly-Lys二肽形成的双链聚乙二醇活性衍生物(2)
将20克分子量为20,000的聚乙二醇单甲醚原碳酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(mPEG-SC)溶于含1克Gly-Lys二肽的硼酸盐缓冲液中，pH＝10.2，室温下搅拌过夜。盐酸调pH＝3，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，真空蒸出溶剂，加入200毫升异丙醇沉淀。沉淀过滤，真空干燥。分支型的PEG酸性产物可进一步用离子交换色谱柱纯化。产率8克(40％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，3个氢)，4.32(t，2个氢)。
0.5克分支型的PEG酸(由上步制得)，溶于5毫升二氯甲烷，向溶液中加入7毫克N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和13毫克二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌6小时，过滤除去沉淀，真空蒸出溶剂，剩余物加入20毫升异丙醇(IPA)中，过滤收集沉淀并在真空中干燥。产率0.48克(96％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，6个氢)2.81(s，4个氢)，4.15(s，2个氢)，4.07(t，2个氢)，4.48(t，2个氢)。
实施例3 合成聚乙二醇与Gly-Lys(Gly)三肽形成的双链聚乙二醇活性衍生物(3)
将20克分子量为20,000的聚乙二醇单甲醚原碳酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(mPEG-SC)溶于含1.2克Gly-Lys(Gly)多肽的硼酸盐缓冲液中，pH＝10.2，室温下搅拌过夜。盐酸调pH＝3，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，真空蒸出溶剂，加入200毫升异丙醇沉淀。沉淀过滤，真空干燥。分支型的PEG酸性产物可进一步用离子交换色谱柱纯化。产率8克(40％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，3个氢)，4.32(t，2个氢)。
0.5克分支型的mPEG酸(由上步制得)，溶于5毫升二氯甲烷，向溶液中加入7毫克N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和13毫克二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌6小时，过滤除去沉淀，真空蒸出溶剂，剩余物加入20毫升异丙醇(IPA)中，过滤收集沉淀并在真空中干燥。产率0.48克(96％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，6个氢)，2.81(s，4个氢)，4.15(s，2个氢)，4.07(t，2个氢)，4.48(t，2个氢)。
实施例4 合成聚乙二醇与Gly-Lys-Lys三肽形成的三链聚乙二醇活性衍生物(4)
将20克分子量为20,000的聚乙二醇单甲醚原碳酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(mPEG-SC)溶于含1.5克Gly-Lys-Lys多肽的硼酸盐缓冲液中，pH＝10.2，室温下搅拌过夜。盐酸调pH＝3，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，真空蒸出溶剂，加入200毫升异丙醇沉淀。沉淀过滤，真空干燥。分支型的PEG酸性产物可进一步用离子交换色谱柱纯化。产率8克(40％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，3个氢)，4.32(t，2个氢)。
0.5克分支型的PEG酸(由上步制得)，溶于5毫升二氯甲烷，向溶液中加入7毫克N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和13毫克二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌6小时，过滤除去沉淀，真空蒸出溶剂，剩余物加入20毫升异丙醇(IPA)中，过滤收集沉淀并在真空中干燥。产率0.48克(96％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，6个氢)2.81(s，4个氢)，4.15(s，2个氢)，4.07(t，2个氢)，4.48(t，2个氢)。
实施例5 合成聚乙二醇与Lys-Glu二肽形成的双链聚乙二醇活性衍生物(5)
将20克分子量为20,000的聚乙二醇单甲醚原碳酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(mPEG-SC)溶于含1.2克Lys-Glu二肽的硼酸盐缓冲液中，pH＝10.2，室温下搅拌过夜。盐酸调pH＝3，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，真空蒸出溶剂，加入200毫升异丙醇沉淀。沉淀过滤，真空干燥。分支型的PEG酸性产物可进一步用离子交换色谱柱纯化。产率8克(40％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，3个氢)，4.32(t，2个氢)。
实施例6 合成具有醛基的聚乙二醇与Gly-Lys(Gly)三肽形成的 双链聚乙二醇活性衍生物(6)
将10克分子量为40,000聚乙二醇与Gly-Lys(Gly)三肽形成的双链聚乙二醇活性衍生物(3)溶解在50毫升二氯甲烷中，加入0.1毫升2，2-二乙氧基乙胺，氮气保护下搅拌过夜。减压浓缩溶液，加入100毫升乙醚。过滤收集沉淀真空干燥，产率9.5克(95％)。
9克双链聚乙二醇二乙缩醛(由上步制得)溶解在pH＝5的磷酸盐缓冲溶液中，室温下反应48小时。加30克氯化钠溶解，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，减压浓缩，乙醚沉淀，过滤收集沉淀，乙醚洗涤。产率7.2克(80％)。NMR(D2O)1.80(q，1个氢)，2.72(t，1个氢)，3.29(s，3个氢)，3.61(s，PEG中氢)，5.06(t，1个氢)。熔点56-58℃。
实施例7 合成对硫羟基具有活性的聚乙二醇与Gly-Lys(Gly)三肽形成的 双链聚乙二醇活性衍生物(7)
将10克分子量为40,000聚乙二醇与Gly-Lys(Gly)三肽形成的双链聚乙二醇活性衍生物(3)溶解在50毫升二氯甲烷中，加入0.1克N-(2-氨基乙基)-3-马来酰亚胺基-丙酰胺，氮气保护下搅拌过夜。减压浓缩溶液，加入100毫升乙醚。过滤收集沉淀真空干燥，产率9.5克(95％)。
实施例8 合成具有双活性基团的聚乙二醇与Gly-Lys(Gly)-Lys四肽形成的 双链聚乙二醇活性衍生物(8)
将10克分子量为40,000聚乙二醇与NH2-Gly-Lys(Gly)-OH三肽形成的双链聚乙二醇活性衍生物(3)溶解在50毫升二氯甲烷中，加入0.2克NH2-Lys(Boc)-OH，室温下搅拌反应18小时，加入20毫升三氟乙酸处理1小时，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次，无水硫酸钠干燥，过滤，氮气保护下，减压浓缩，加入200毫升异丙醇沉淀，沉淀过滤，真空干燥。
将上一步所得产物溶于20毫升二氯甲烷中，加入0.15克，3-马来酰亚胺基-丙酸-(N-羟基-丁二酰亚胺)酯，室温下反应过夜，过滤除去沉淀，氮气保护下减压浓缩，加入100毫升异丙醇沉淀，沉淀过滤，真空干燥。
将上一步所得的1克双链聚乙二醇酸(由上步制得)，溶于20毫升二氯甲烷，向溶液中加入20毫克N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和0.2克二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌6小时，过滤除去沉淀，真空蒸出溶剂，剩余物加入20毫升异丙醇(IPA)中，过滤收集沉淀并在真空中干燥。产率0.98克(98％)。NMR(DMSO)3.50(br m，PEG中的氢)，3.24(s，6个氢)，2.81(s，4个氢)，4.15(s，2个氢)，4.07(t，2个氢)，4.48(t，2个氢)。
实施例9 双链聚乙二醇活性衍生物(3)与溶菌酶(Lysozyme)链接的结合物 将1毫克溶菌酶溶解在1毫升50毫摩尔/升，pH＝7.0的磷酸缓冲液中。将27.8毫克双链聚乙二醇活性衍生物(3)加入溶菌酶溶液中。蛋白质与PEG的摩尔比例为1∶10。室温震荡反应3小时。GFC检测取代率，双PEG取代溶菌酶4.8％，单PEG取代溶菌酶48.0％，溶菌酶47.2％。
实施例10 双链聚乙二醇活性衍生物(3)与生长素(hGH)链接的结合物 生长素用50毫摩尔/升的pH＝7.0磷酸缓冲液稀释到1毫克/毫升。将1 8.0毫克双链聚乙二醇活性衍生物(3)加入1毫升生长素溶液中。蛋白质与PEG的摩尔比例为1∶10。室温震荡反应3小时。经离子交换色谱分离纯化得到不含有游离的hGH的产物。
实施例11 双链聚乙二醇活性衍生物(6)与GCSF链接的结合物 GCSF用50毫摩尔/升的pH＝7.0磷酸缓冲液稀释到1毫克/毫升。将21.3毫克双链聚乙二醇活性衍生物(3)加入1毫升GCSF溶液中。蛋白质与PEG的摩尔比例为1∶10。室温震荡反应3小时。经离子交换色谱分离纯化得到不含有游离的GCSF的产物。
实施例12 本实施例说明代表性非胃肠道给药的药物组合物的制备过程，所述组合物包含本发明的结合物。
成分 实施例8的结合物2克 0.9％盐水溶液 至100毫升 将实施例8的结合物2克溶解于0.9％盐水溶液，得到100毫升的静脉注射用溶液，将其通过0.2μm的膜过滤材料过滤，在无菌条件下包装。
权利要求
1.一种由通式I表示的由聚乙二醇与寡肽形成的化合物
其中
PEGi是相同或不同的聚乙二醇链，所述的聚乙二醇链具有如下通式
其中
R为H或C1-12烷基；
n为6～1300的任何整数；
i为1，2，…，j；
j为≥2的整数；
Xi是相同的或不同的连接基团，所述的连接基团选自由-(CH2)mOCOO-、-(CH2)mOCONH-、-(CH2)mNHCOO-、-(CH2)mNHCONH-、-(CH2)mCOO-、-(CH2)mCONH-组成的组，其中，m为0-10的整数；
A源自于寡肽，所述的寡肽包括2-20个氨基酸，其中至少有两个氨基酸是不相同的；Fp表示相同的或不同的活性基团，所述的活性基团选自由羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼基、马来酰亚胺基和吡啶二硫化物组成的组；
p为1，2，…，q；
q为≥1的整数。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的聚乙二醇链中的所述的R选自由氢、甲基、乙基、异丙基组成的组。
3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的聚乙二醇链中的所述的n为60-800。
4.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的A源自于
Gly-Lys；
Gly-Lys(Gly)；
Glu-Lys；或者
Gly-Lys(Gly)-Lys。
5.如权利要求1或4所述的化合物，其中，所述的化合物如通式II所示
其中mPEG为CH3O-(CH2CH2O)n-。
6.如权利要求5所述的化合物，其中，所述的化合物如通式III所示
7.如权利要求5所述的化合物，其中，所述的化合物如通式IV所示
8.如权利要求6所述的化合物，其中，所述的化合物选自由如下通式表示的化合物组成的组之一
9.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物选自由如下通式表示的化合物组成的组之一
其中k为1-10的整数。
10.一种制备如权利要求1所述的由聚乙二醇与寡肽形成的化合物的方法，所述方法包括在中性或碱性条件下，用聚乙二醇单甲醚酯与所述的寡肽反应，产物进行分离纯化，然后再进行根据Fp的类型活性基团改造。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述的聚乙二醇单甲醚酯是聚乙二醇单甲醚-乙酸-N羟基丁二酰亚胺酯或者为聚乙二醇单甲醚-原碳酸-N羟基丁二酰亚胺酯。
12.如权利要求1-9之一所述的化合物通过其活性基团Fp与药物分子所形成的结合物。
13.如权利要求12所述的结合物，其中，所述的药物分子选自由氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱组成的组。
14.如权利要求12所述的结合物，其中，所述的药物分子是基因工程药物。
15.如权利要求14所述的结合物，其中，所述的基因工程药物选自由α-、β-或γ-干扰素，生长素，EPO，GCSF，白介素，溶菌酶，抗体和抗体片段组成的组。
全文摘要
一种由通式I表示的由聚乙二醇与寡肽形成的化合物其中，i，j，p，q为整数，i＝1，2，…，j；j≥2；p＝1，2，…q；q≥1；PEGi是聚乙二醇链；Xi是连接基团；A源自于寡肽，包含2-20个氨基酸，且至少有两个氨基酸是不相同的；Fp是活性基团。所述的化合物可以通过Fp键合上大分子的蛋白质或多肽或者小分子的天然药物活性成分，以改善药物分子在体内的生理作用，或者保证适当的药物浓度并提供缓释功能。
文档编号C08G65/48GK101168594SQ20061015001
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者宣 赵, 强 顾 申请人:北京键凯科技有限公司