专利名称：聚乙二醇功能性衍生物和制造方法
技术领域：
本发明涉及聚乙二醇功能性衍生物及其制造和纯化方法。
背景技术：
聚乙二醇(PEG)，或称为聚环氧乙烷(PE0)，是由重复的环氧乙烷亚单元 所组成的聚合物。因为无毒性，所以它广泛地应用在临床方面例如泻药，和日常用 品如牙膏的分散剂。最近，医疗科学家使用活化了的聚乙二醇衍生物与不同的生物 分子结合，从而使所述生物分子的半衰期延长。由此，研究人员着手研发活化了的 聚乙二醇衍生物，而Harris " a丄公开了聚乙二醇-酸(PEG-acid)的活化酯， 该聚乙二醇-酸与拥有一个有丙酸或丁酸半体的甲氧基和琥珀酸基活化酯 (_C02-NHS)分别结合在该聚乙二醇-酸的两端(美国专利号5,672,662)。 Sedaghat-Herati et s丄在Polymer Bulletin, 43， 35 - 41 (1999)记述了使 用丙烯腈以合成甲氧基聚环氧乙烷丙酸。
发明内容
基于前述背景，本发明的目的是提供替代选择的聚乙二醇功能性衍生物及 其制造方法。因此，本发明在一方面是一个分离和实质纯化的聚乙二醇-酸(PEG-acid) 如以下的结构(I) R-PEG-(CH2)k-C00H其中k是介乎1到5， R是氢，羟基，甲氧基，或其它烷氧基，而聚乙 二醇是以如下通式(II)所表示 (II) -C2H40—(C2H40) n- 其中n是介乎44到4000。在本发明的一个优选实施方案中，所述分离和实质纯化的聚乙二醇-酸的 纯度由95%到100%。在另一个优选实施方案中，所述聚乙二醇-酸是固体状态而 其纯度是由95%到100%。本发明的另一方面提供了一个分离和实质纯化的聚乙二醇-腈
(PEG-nitrile)并如以下的结构所表示
(III) R-PEG-(CH2)k-CN其中k是介乎1到5， R是氢，羟基，甲氧基，或其它垸氧基，而聚乙 二醇是以前述通式(II)所表示。在一个优选实施方案中，所述分离和实质纯化的聚乙二醇-腈的纯度由95% 到100%。在最优选的实施例中，所述聚乙二醇-腈是固体状态而其纯度是由95%到 100%。本发明的另一方面提供了一个如前述通式(I)所示的分离和实质纯化聚 乙二醇-酸的预备方法，所述方法包括将羟基聚乙二醇与氯磺酸(chlorosulfonate) 反应以形成聚乙二醇-磺酸酯，然后再将所述聚乙二醇-磺酸酯与金属氰化物反应以 形成聚乙二醇-腈。所述聚乙二醇-腈接着水解成聚乙二醇-酸，其中所产生的聚乙二 醇-酸是固体状态而其纯度是介乎95%到100%。在一个优选实施方案中，所述氯磺酸选自甲基磺酰氯，三氟甲烷磺酸基氯， 和对甲二氯甲烷磺酰氯。
8在一个上述方法的变体中，所述水解步骤进一步包含以一矿物酸水解所述 聚乙二醇-腈以形成聚乙二醇-酰胺，紧随以另一个水解步骤以碱水解所述聚乙二醇-酰胺。在一个优选实施方案中，所述酸是氢氯酸而所述碱是氢氧化钾。在上述方法的另一个实施方案中，提供一个采用水透析来纯化聚乙二醇-酸的额外步骤。在上述方法的另一个最优选实施方案中，在一个氩气环境下的冰浴混合溶 于二氯甲烷的羟基-甲氧基-聚乙二醇与三乙胺和甲基磺酰氯。如此取得甲氧基-聚乙 二醇-甲磺酸酯后，再与在氩气环境下溶于二甲基亚砜的氰化钾混合，而产生的甲氧 基-聚乙二醇-腈在一个干硅胶过滤柱纯化。所述纯化后的甲氧基-聚乙二醇-腈与氢 氯酸反应后得到的甲氧基-聚乙二醇-酰胺用水透析方法纯化；其后，所述纯化甲氧 基-聚乙二醇-酰胺与氢氧化钾反应并来酸化，从而形成甲氧基-聚乙二醇-酸。最后， 所述甲氧基-聚乙二醇-酸以另一个水透析工序和冷冻干燥来纯化而得到固态的纯化 甲氧基-聚乙二醇-酸。本发明的另一方面提供了一个如通式(III)所示的分离和实质纯化聚乙 二醇-腈的预备方法，所述方法包括将羟基聚乙二醇与氯磺酸反应以形成聚乙二醇-磺酸酯，然后再将所述聚乙二醇-磺酸酯与金属氰化物反应以形成聚乙二醇-腈。所 产生的聚乙二醇-酸是固体状态而其纯度是介乎95%到100%。在一个优选实施方案中，所述氯磺酸选自甲基磺酰氯，三氟甲烷磺酸基氯， 和对甲二氯甲烷磺酰氯。在上述方法的另一个方案中，提供了一个用色谱柱过滤来纯化所述聚乙二 醇-腈的额外步骤。在上述方法的另一个最优选实施方案中，在一个氩气环境下的冰浴混合溶 于二氯甲烷的羟基-甲氧基-聚乙二醇与三乙胺和甲基磺酰氯。如此取得甲氧基-聚乙 二醇-甲磺酸酯后，再与在氩气环境下溶于二甲基亚砜的氰化钾混合，而产生的甲氧 基-聚乙二醇-腈在一个干硅胶过滤柱纯化，然后再以冷乙醚沉淀以得到固态的纯化 甲氧基-聚乙二醇-腈。根据本发明另一方面，提供了一个分离和实质纯化聚乙二醇-琥珀酰亚胺酸 酯(PEG-succinimidyl ester)的制备方法，所述方法包括将羟基-聚乙二醇与氯磺酸 反应以形成聚乙二醇-磺酸酯，然后再将聚乙二醇-磺酸酯与金属氰化物反应以形成 聚乙二醇-腈。所述聚乙二醇-腈接着水解成聚乙二醇-酸，并在有N-(3-二甲氨基丙 基)-N，-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)的环境下将所述聚乙二醇-酸与N-羟基琥 珀酰亚胺(NHS)结合以形成聚乙二醇-琥珀酰亚胺酸酯。在一个优选实施方案中，所述氯磺酸选自甲基磺酰氯，三氟甲烷磺酸基氯， 和对甲二氯甲垸磺酰氯。在一个上述方法的变体中，所述水解步骤进一步包含以一矿物酸水解所述 聚乙二醇-腈以形成聚乙二醇-酰胺,紧随以另一个水解步骤以碱水解所述聚乙二醇-酰胺。在一个优选实施方案中，所述酸是氢氯酸而所述碱是氢氧化钾。在上述方法的另一个方案中，提供了一个用乙醚沉淀来纯化所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺酸酯的额外步骤，其中所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺酸酯是由冷乙醚中的原 始混合物中沉淀得来的，而所述结果的沉淀物经过过滤和在真空室温下干燥48小 时。本发明有多项优点。例如，纯化聚乙二醇-酸与聚乙二醇-腈乃稳定的化合 物，所以并不需要非常有惰性的环境来储存这两种聚乙二醇衍生物。本发明的另一个优点，就是纯化聚乙二醇-酸已经可以在原位(insitu)直 接与其它生物分子例如蛋白聚乙二醇化。因此，不需要先将活化后的聚乙二醇-琥珀 酰亚胺酸酯分离。
图l是一个'H-NMR谱图以从其它甲氧基聚乙二醇-成品中区别出甲氧基聚 乙二醇-腈。图2是一个'H-^!R谱图以从其它甲氧基聚乙二醇-成品中区别出甲氧基聚 乙二醇-丙酸。
具体实施例方式如本发明及本权利要求书所用，"包含"是指包括下述的要素但不排除其 它。如前述，聚乙二醇(PEG)，等同于聚环氧乙垸或聚氧化乙烯(两者皆简称PE0)， 是一种拥有如(IV)的重复氧化乙烯单位为共同结构的聚合物 (IV) H0-(C2H40)n-H普遍来说，聚乙二醇这名称能用于不同的地方，例如当使用在化学名称的 一部份如聚乙二醇-酸，聚乙二醇是由前述的通式(II)来表示(II) _C2H40—(C2H40) -在另一方面，例如当使用在化学名称的一部份如聚乙二醇-羧(PEG-C00H), 聚乙二醇是由(V)的结构来表示(V)- (C2H4-0-) - —个官能团或者是一组官能团可以与聚乙二醇的C-末端结合，形成一个加 盖的聚乙二醇。例如，当甲氧基(CH:i0-)加进聚乙二醇的C-末端，形成甲氧基聚 乙二醇(mPEG)并有下列化学通式(VI)所示(VI) CH:!0— (C2H4—0—) —C2H4-0H所述氰化物为有机氰化物如a,p不饱和有机氰化物，也可以是金属氰化物如
11 氰化钾(KCN)。本发明说明书所述的"GMP合格化学品"是指依照现行GMP指弓I 所预备的化学品。本发明说明书所述的"USP级化学品"是指符合USP29-NF24版 本的美国药典和2006美国国家处方的相应试验要求。在本发明的一个实施方案中，所述分离和实质纯化的聚乙二醇-酸，如前述 通式(I)所示，是符合GMP和美国药典等级，其中可捡测金属量是不大于5 ppm。 所述聚乙二醇-酸固体是白色的。在本发明的另一实施方案中，所述分离和实质纯化的聚乙二醇-腈，如前述 通式(III)所示，是符合GMP和美国药典等级，其中可捡测金属量是不大于5卯m。 所述淡白色的聚乙二醇-腈固体的熔点是49°C至50.7"C。下列实施例进一步详细说明本发明，但不等于限制本发明。 实施例1使用甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯为起始原料以制备甲氧基聚乙二醇-腈的 方法甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯的制造及纯化甲基磺酸酯本方法的第一歩，是将lg的羟基-甲氧基聚乙二醇(平均分子量为5000; Fluka)与0. 19 g的甲基磺酰氯(MsCl; Aldrich)反应，从而得到甲氧基聚乙二醇 -甲基磺酸酯。先将溶于2ml 二氯甲烷(DCM;分析试剂规格min. 99%, Tedia)的 羟基-甲氧基聚乙二醇，与0. 14mL的三乙胺(分析试剂规格min. 99%， Merck)在 冰浴内和氩气环境下混合和搅拌一小时。然后，再将MsCl在30分钟内慢慢加入 所述混合物并持续搅拌多2个小时。所述混合物在室温下再搅拌22-24小时。将所述已搅拌的混合物用吸滤法过滤，丢弃沉淀物，而所述滤出液通过以 干硅胶填充的色谱柱(10 g， 70-120 mesh)。将大约25 mL二氯甲烷(分析试剂规格 min. 99%, Tedia)加入所述过滤色谱柱以冲洗出任何保留在色谱柱内的甲氧基聚乙
二醇-甲基磺酸酯。将前述过滤与冲洗程序重复最少两次直至所有甲基磺酰氯的残余 物被除去。所述最后所得的甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯溶液用旋转式脱水器浓缩， 并进一步以200 mL冷乙醚(分析试剂规格min. 99%, Tedia)纯化。所述醇化后 的产品再次过滤并在真空下干燥48小时。甲氧基聚乙二醇-腈的制造及纯化随后，将大约lg的所述醇化后的甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯与溶于 4-5ml 二甲基亚砜(DMSO;分析试剂规格min. 99%, Tedia)的0. 03 g的氰化钾
(KCN; Aldrich)反应。所述反应混合物在32-35"C氩气流动之下搅拌48小时以 形成甲氧基聚乙二醇-腈。所述原始混合物再经过一个干硅胶过滤柱。收集所述过滤 液，然后将二氯甲烷加进色谱柱以冲洗任何残留在色谱柱内的甲氧基聚乙二醇-腈。 重复所述过滤工序直至杂质如甲基磺酸基钾全部清除。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈过滤液接着用冷乙醚沉淀以得到甲氧基聚乙二醇-腈的固体。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈的特征可以由'H-NMR中获得，其特征是所述 NMR谱图(Fig. la)于2. 7 ppm (与腈基团毗连的质子相应，-0CCN) ， 3. 24 ppm (与甲氧基团相应，C^0-)，和3.51 ppm (与所述聚合物的主轴相应)皆显示峰值。 从醒R谱图分析显示取代程度达到95-100%。 实施例2 使用甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯为起始原料以制备甲氧基聚乙二醇-酸的方法甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯的制造及纯化本方法的第一步，是将lg的羟基-甲氧基聚乙二醇(平均分子量为5000; Fluka)与0. 19 g的甲基磺酸基氯(MsCl; Aldrich)反应，从而得到甲氧基聚乙二
醇-甲基磺酸酯。先将溶于2ml 二氯甲烷(DCM;分析试剂规格min. 99%, Tedia)的 羟基-甲氧基聚乙二醇，与0. 14mL的三乙胺(分析试剂规格min. 99%, Merck)在 冰浴内和氩气环境下混合和搅拌一小时。然后，再将MsCl在30分钟内慢慢加入 所述混合物并持续再搅拌2个小时。所述混合物在室温下再搅拌22-24小时。将所述已搅拌的混合物用吸滤法过滤，丢弃沉淀物，而所述滤出液通过以 干硅胶填充的色谱柱(10 g， 70-120 niesh)。将大约25 mL 二氯甲垸(解析试剂规 格min. 99%, Tedia)加入所述过滤色谱柱以冲洗出任何保留在色谱柱内的甲氧基 聚乙二醇-甲基磺酸酯。将前述过滤与冲洗程序重复最少两次直至所有甲基磺酰氯的 残余物被除去。所述最后所得的甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯溶液用旋转式脱水器浓 縮，并进一步以200 mL冷乙醚(分析试剂规格min. 99%, Tedia)纯化。所述醇 化后的产品再次过滤并在真空下干燥48小时。甲氧基聚乙二醇-腈的制造及纯化随后，将大约lg的所述醇化后的甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯与溶于 4-5ml 二甲基亚砜(DMSO;解析试剂规格min. 99%， Tedia)的0. 03 g的氰化钾 (KCN; Aldrich)反应。所述反应混合物在32-35"C氩气流动之下搅拌48小时以 形成甲氧基聚乙二醇-腈。所述原始混合物再经过一个干硅胶过滤柱。收集所述过滤 液，然后将二氯甲烷加进色谱柱以冲洗任何残留在色谱柱内的甲氧基聚乙二醇-腈。 重复所述过滤工序直至杂质如甲基磺酸基钾全部清除。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈过滤液接着用冷乙醚沉淀以得到甲氧基聚乙二醇-腈的固体。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈的特征可以由'H-NMR中获得，其特征是所述 NMR谱图(Fig. la)于2. 7ppm (与腈基团毗连的质子相应，-0CH2C"CN) ， 3. 24 ppm (与甲氧基团相应，C斥0-)，和3. 51 ppm (与所述聚合物的主轴相应)皆显示峰值。 从NMR谱图分析显示取代程度达到95-100%。甲氧基聚乙二醇-酰胺的制造及纯化
14在下一个步骤,将lg纯化后的甲氧基聚乙二醇-腈以4mL的氢氯酸(HC1; 12 M， BDH Company)水解，并形成甲氧基聚乙二醇-酰胺。这酸性水解反应曾在美 国专利5,672,662中公开，而Sedaghat-Herati et 在Polymer Bulletin, 43, 35 - 41 (1999)中提到，首先将甲氧基聚乙二醇-腈溶于浓縮的盐酸并在室温下搅 拌44小时，然后再将3. 5 g的氢氧化钾颗粒(K0H; BDH Company)加进所述在冰 浴中的搅拌混合物。其后，以盐酸(2-6 M)将所述溶液的pH调较至3 - 4。在上 述的化学反应中，所产生的氯化钾(KC1)是可以经透析法(1000 cut-off membrane) 配以每天换水以室温透析3日来去除。如所述已经透析的水和所述用来透析的水的 传导性是等同的话，则表示去除氯化钾的程序已经完成。所述透析工序尽管可以去 除氯化钾，亦同时可以有助于纯化甲氧基聚乙二醇-酰胺。甲氧基聚乙二醇-酸的制造及纯化所述纯化甲氧基聚乙二醇-酰胺然后在室温及搅拌下以1.7g氢氧化钾颗 粒再次水解72小时以形成相应甲氧基聚乙二醇-酸的羧化物。此后，在冰浴下加盐 酸(2-4 M)进所述混合物以调较pH回3 - 4。如前述甲氧基聚乙二醇-酰胺的合 成，所产生的氯化钾盐和氯化铵盐可以经透析工序去除，其中所述冰冷的混合物是 经过透析法(1000 cut-off membrane)配以每天换水以室温透析3日来去除。如 所述已经透析的水和所述用来透析的水的传导性是等同的话，则表示去除盐的程序 已经完成。所述纯化后的甲氧基聚乙二醇-酸其后冷冻干燥3日，得到纯化的甲氧 基聚乙二醇-酸固体。 所述纯化的甲氧基聚乙二醇-酸以'H-醒R谱图辨别，其中所述NMR光谱 (Fig. 2a)反映在2.4卯m (与腈基团毗连的质子相应，-OCCN) ， 3. 24 ppm (与 甲氧基团相应，CM0-)，和3.51 ppm (与所述聚合物的主轴相应)皆显示峰值。从 刚R谱图分析显示取代程度达到95-100%。 实施例3使用甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯为起始原料以预备甲氧基聚乙二醇-琥珀 酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)琥珀酰亚胺丙酸酯甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯的制造及纯化本方法的第一步，是将lg的羟基-甲氧基聚乙二醇(平均分子量为5000; Fluka)与0. 19g的甲基磺酰氯(MsCl; Aldrich)反应，从而得到甲氧基聚乙二醇 -甲基磺酸酯。先将溶于2ml 二氯甲垸(DCM;分析试剂规格min. 99%, Tedia)的 羟基-甲氧基聚乙二醇，与0. 14mL的三乙胺(分析试剂规格min. 99%, Merck)在 冰浴内和氩气环境下混合和搅拌一小时。然后，再将MsCl在30分钟内慢慢加入 所述混合物并持续再搅拌2个小时。所述混合物在室温下再搅拌22-24小时。将所述已搅拌的混合物用吸滤法过滤，丢弃沉淀物，而所述滤出液通过干 硅胶过滤柱(10 g， 70-120 mesh)。将大约25 mL 二氯甲烷((分析试剂规格min. 99%, Tedia)加入所述过滤色谱柱以冲洗出任何保留在色谱柱内的甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯。将前述过滤与冲洗程序重复最少两次直至所有甲基磺酰氯的残余物被 除去。所述最后所得的甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯溶液用旋转式脱水器浓縮，并进 一步以200 mL冷乙醚(分析试剂规格min. 99%, Tedia)纯化。所述醇化后的产 品再次过滤并在真空干燥48小时。甲氧基聚乙二醇-腈的制造及纯化随后，将大约lg的所述醇化后的甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯与溶于 4-5ml 二甲基亚砜(DMSO;分析试剂规格min. 99%, Tedia)的0. 03 g的氰化钾 (KCN; Aldrich)反应。所述反应混合物在32-35°C氩气流动之下搅拌48小时以 形成甲氧基聚乙二醇-腈。所述原始混合物再经过一个干硅胶过滤柱。收集所述过滤 液，然后将二氯甲垸加进色谱柱以冲洗任何残留在色谱柱内的甲氧基聚乙二醇-腈。 重复所述过滤工序直至杂质如甲基磺酸基钾全部清除。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈过滤液接着用冷乙醚沉淀以得到甲氧基聚乙二醇-腈的固体。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈的特征可以由'H-顺R中获得，其特征是所述 剛R谱图(Fig. la)于2. 7ppm (与腈基团毗连的质子相应,-0CH蒸N) ， 3. 24 ppm (与甲氧基团相应，C"0-)，和3.51 ppm (与所述聚合物的主轴相应)皆显示峰值。 从画R谱图分析显示取代程度达到95-100%。甲氧基聚乙二醇-酰胺的制造及纯化在下一个步骤,将lg纯化后的甲氧基聚乙二醇-腈以4mL的氢氯酸(HC1: 12 M, BDH Company)水解，并形成甲氧基聚乙二醇-酰胺。这酸性水解反应曾在美 国专利5,672,662中公开，而Sedaghat-Herati e￡ 在Polymer Bulletin, 43, 35 - 41 (1999)中提到，首先将甲氧基聚乙二醇-腈溶于浓縮的盐酸并在室温下搅 拌44小时，然后再将3. 5 g的氢氧化钾颗粒(KOH; BDH Company)加进所述在冰 浴中的搅拌混合物。其后，以盐酸(2-6 M)将所述溶液的pH调较至3 - 4。在上 述的化学反应中，所产生的氯化钾(KC1)是可以经透析法(1000 cut-off membrane) 配以每天换水以室温透析3日来去除。如所述已经透析的水和所述用来透析的水的 传导性是等同的话，则表示去除氯化钾的程序已经完成。所述透析工序尽管可以去 除氯化钾，亦同时可以有助于纯化甲氧基聚乙二醇-酰胺。甲氧基聚乙二醇-酸的制造及纯化所述纯化甲氧基聚乙二醇-酰胺然后在室温及搅拌下以1.7g氢氧化钾颗 粒再次水解72小时以形成相应甲氧基聚乙二醇-酸的羧化物。此后，在冰浴下加盐 酸(2-6 M)进所述混合物以调较pH回3 - 4。如前述甲氧基聚乙二醇-酰胺的合 成，所产生的氯化钾盐和氯化铵盐可以经透析工序去除，其中所述冰冷的混合物是 经过透析法(1000 cut-off membrane)配以每天换水以室温透析3日来去除。如 所述已经透析的水和所述用来透析的水的传导性是等同的话，则表示去除盐的程序 已经完成。所述纯化后的甲氧基聚乙二醇-酸其后冷冻干燥3日，得到纯化的甲氧 基聚乙二醇-酸固体。所述纯化的甲氧基聚乙二醇-酸以'H-NMR谱图辨别，其中所述匿R光谱
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(Fig. 2a)反映在2. 43 ppm (与腈基团毗连的质子相应，-0CH2C"CN) ， 3. 24卯m (与 甲氧基团相应，C 0-)，和3.51 ppm (与所述聚合物的主轴相应)皆显示峰值。从 NMR谱图分析显示取代程度达到95-100%。甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯的制造及纯化在最后的一个步骤，将0.06 g的N-羟基丁二酰亚胺(NHS; Aldrich)加 进一个由1 g纯化后的甲氧基聚乙二醇-酸和7 mL 二氯甲垸(DCM;分析试剂规格 min. 99%, Tedia)组成的混合物，而所述反应混合物于0"C保持冷藏。慢慢将在0. 5 mL DCM里的0. 1 g of 1,3-二环己基碳酰亚胺(DCC, Aldrich)加进所述反应混合 物，而所述混合物在室温和氩气下搅拌24小时。接着以吸滤法过滤上述所得到的溶 液，所得的过滤液以冷乙醚沉淀，再将所得的沉淀物经过过滤和在室温真空下干燥 48小时。最后所得的甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯以铝纸收藏于大约_20°C。 实施例4 使用甲氧基聚乙二醇-对甲磺酸酯为起始原料以制备甲氧基聚乙二醇-
琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)'甲氧基聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的制造及纯化本方法的第一步，是将1 g羟基-甲氧基聚乙二醇(平均分子量为5000; Fluka)与0. 19 g对甲苯磺酰氯(TsCl; Aldrich)反应，从而得到甲氧基聚乙二 醇-对甲苯磺酸酯。先将溶于2ml 二氯甲烷(DCM;分析试剂规格min. 99%, Tedia) 的羟基-甲氧基聚乙二醇，与0. 14mL的三乙胺(分析试剂规格min. 99%, Merck) 在冰浴内和氩气环境下混合和搅拌一小时。然后，再将TsCl在30分钟内慢慢加 入所述混合物并持续搅拌多2个小时。所述混合物在室温下再搅拌22-24小时。将所述已搅拌的混合物用吸滤法过滤，丢弃沉淀物，而所述滤出液通过以 干硅胶填充的色谱柱(10 g, 70-120 mesh)。将大约25 mL 二氯甲烷所述过滤色谱 柱以冲洗出任何保留在色谱柱内的甲氧基聚乙二醇-对甲苯磺酸酯。将前述过滤与
冲洗程序重复最少两次直至所有对甲苯磺酰氯的残余物被除去。所述最后所得的甲 氧基聚乙二醇-对甲苯磺酸酯溶液用旋转式脱水器浓縮，并进一步以200mL冷乙醚 (分析试剂规格min. 99%, Tedia)纯化。所述醇化后的产品再次过滤并在真空下干 燥48小时。甲氧基聚乙二醇-腈的制造及纯化随后，将大约lg的所述醇化后的甲氧基聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与溶于 4-5ml二甲基亚砜(DMSO;解析试剂规格min. 99%, Tedia)的0. 03 g的氰化钾 (KCN; Aldrich)反应。所述反应混合物在32-35"C氩气流动之下搅拌48小时以 形成甲氧基聚乙二醇-腈。所述原始混合物再经过一个干硅胶过滤柱。收集所述过滤 液，然后将二氯甲烷加进色谱柱以冲洗任何残留在色谱柱内的甲氧基聚乙二醇-腈。 重复所述过滤工序直至杂质如甲基磺酸基钾全部清除。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈过滤液接着用冷乙醚沉淀以得到甲氧基聚乙二醇-腈的固体。所述纯化甲氧基聚乙二醇-腈的特征可以由'H-NMR中获得，其特征是所述 醒R谱图(Fig. la)于2.7ppm (与腈基团毗连的质子相应，-OCH2CH2CN) ， 3. 24 ppra (与甲氧基团相应，CH力-)，禾Q 3.51 ppm (与所述聚合物的主轴相应)皆显示峰值。 从NMR谱图分析显示取代程度达到95-100%。甲氧基聚乙二醇-酰胺的制造及纯化在下一个步骤，将1 g纯化后的甲氧基聚乙二醇-腈以4-5 mL的氢氯酸 (HC1; 12 M， BDH Company)水解，并形成甲氧基聚乙二醇-酰胺。本酸性水解反应 曾在美国专利5, 672, 662中公开，而Sedaghat-Herati et al在Polymer Bulletin, 43， 35 - 41 (1999)中提到，首先将甲氧基聚乙二醇-腈溶于浓縮的盐酸并在室温 下搅拌44小时，然后再加入3.5 g的氢氧化钾颗粒(K0H; BDH Company)进所述 在冰浴中的搅拌混合物。其后，以盐酸(2-6 M)将所述溶液的pH调较至3 - 4。 在上述的化学反应中，所产生的氯化钾(KC1)是可以经透析法(1000 cut-off membrane)配以每天换水以室温透析3日来去除。如所述己经透析的水和所述用来
透析的水的传导性是等同的话，则表示去除氯化钾的程序已经完成。所述透析工序 尽管可以去除氯化钾，亦同时可以有助于纯化甲氧基聚乙二醇-酰胺。甲氧基聚乙二醇-酸的制造及纯化所述纯化甲氧基聚乙二醇-酰胺然后在室温及搅拌下以1.7g氢氧化钾颗 粒再次水解72小时以形成相应甲氧基聚乙二醇-酸的羧化物。此后，在冰浴下加盐 酸(2-6 M)进所述混合物以调较pH回3 - 4。如前述甲氧基聚乙二醇-腈的合成， 所产生的氯化钾盐和氯化铵盐可以经透析工序去除，其中所述冰冷的混合物是经过 透析法(1000 cut-off membrane)配以每天换水以室温透析3日来去除。如所述 已经透析的水和所述用来透析的水的传导性是等同的话，则表示去除盐的程序已经 完成。所述纯化后的甲氧基聚乙二醇-酸其后冷冻干燥3日，得到纯化的甲氧基聚 乙二醇-酸固体。所述纯化的甲氧基聚乙二醇-酸以'H-NMR谱图辨别，其中所述醒R光谱 (Fig. 2a)反映在2.4ppm (与腈基团毗连的质子相应，_0CH2CH2CN) ， 3. 24 ppm (与 甲氧基团相应，CH30-)，和3. 51 ppm (与所述聚合物的主轴相应)皆显示峰值。从 NMR谱图分析显示取代程度达到95-100%。甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯的制造及纯化 在最后的一个步骤，将0.06 g的N-羟基丁二酰亚胺(NHS; Aldrich)加 进一个由1 g纯化后的甲氧基聚乙二醇-酸和7 mL 二氯甲烷(DCM;分析试剂规格 min. 99%, Tedia)的混合物，而所述反应混合物于0"C保持冷藏。慢慢将在0. 5 mL DCM里的0. 1 g of 1,3-二环己基碳酰亚胺(DCC, Aldrich)加进所述反应混合物， 而所述混合物在室温和氩气下搅拌24小时。接着以吸滤法过滤上述所得到的溶液， 所得的过滤液以冷乙醚沉淀，再将所得的沉淀物经过过滤和在室温真空下干燥48 小时。最后所得的甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯以铝纸收藏于大约-2(TC。本发明的优选实施例已经完全阐述。然而上述阐述只提及部份实施例，本
20 发明所属领域的技术人员清楚知道本发明可以对所述具体细节加以变更。如此，本 发明不应以上述实施例作为限定解释。例如，在第一个取代反应中，羟基-聚乙二醇里的磺酸酯是作为一个好的离 去基团，然而这反应是一个亲核性取代，任何离去基团也可使用，如可以代替羟基-聚乙二醇里的氢氧根官能团的卤化物。虽然金属氰化物如氰化钾或氰化钠是牵涉在 制造聚乙二醇-腈的程序，聚乙二醇-腈也可以直接由羟基-聚乙二醇和a,p-不饱和有 机氰化物合成，而这合成路径可以作为替代。在聚乙二醇-酸或聚乙二醇-腈的纯化 中，其它纯化色谱柱如硅胶色谱柱也可以使用。进一步地，苯可以作为二氯甲烷的代替品，以用作在纯化甲氧基聚乙二醇-甲基磺酸酯或甲氧基聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的冲洗剂。而且，N-(3-二甲氨基丙 基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)可以在由甲氧基聚乙二醇-酸制造甲氧基 聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯过程最后的步骤作为1,3-二环己基碳酰亚胺的代替品。
权利要求
1.一种如式(I)的分离和实质纯化的聚乙二醇-酸(I)R-PEG-(CH2)k-COOH其中k为1到5；R选自氢，羟基，甲氧基基团，及其它烷氧基基团；和PEG如通式(II)所示(II)-C2H4O-(C2H4O-)n-其中n为44至4000。
2. 如权利要求1所述的分离和实质纯化的聚乙二醇-酸，其中所述聚乙二醇-酸的纯 度为95%到100%。
3. 如权利要求1所述的分离和实质纯化的聚乙二醇-酸，其中所述聚乙二醇-酸为固 体而且纯度为95%到100%。
4. 一种如式(in)的分离和实质纯化的聚乙二醇-腈(III) R-PEG-(CH2)「CN 其中k为1妾U 5;R选自氢，羟基，甲氧基基团，和其它烷氧基基团；和 PEG如所述通式(II)所示。
5. 如权利要求4所述的分离和实质纯化的聚乙二醇-腈，其中所述聚乙二醇-腈的纯 度为95%到100%。
6. 如权利要求4所述的分离和实质纯化的聚乙二醇-腈，其中所述聚乙二醇-腈为固 体而且纯度为95%到100%。
7. —种制备分离和实质纯化的聚乙二醇-酸的方法，所述方法包括a) 将羟基-聚乙二醇与氯磺酸反应以得到聚乙二醇-磺酸酯；b) 将所述聚乙二醇-磺酸酯与金属氰化物反应以得到聚乙二醇-腈；和 c) 将所述聚乙二醇-腈水解成所述聚乙二醇-酸；其中所述聚乙二醇-酸是由所述式(I)代表；所述聚乙二醇是由所述通式(II) 代表。
8. 如权利要求7所述方法，其中所述已制备的聚乙二醇-酸为固体而且纯度为95% 到100%。
9. 如权利要求7所述方法，其中步骤(a)中所述的氯磺酸是甲基磺酰氯。
10. 如权利要求7所述方法，其中步骤(a)中所述的氯磺酸是对甲苯磺酰氯。
11. 如权利要求7所述方法，其中所述步骤(c)进一步包括d) 用一种矿物酸水解所述聚乙二醇-腈，以得到聚乙二醇-酰胺；和e) 用一种碱水解所述聚乙二醇-酰胺，再以矿物酸酸化，以得到所述聚乙二醇-酸。
12. 如权利要求11所述方法，其中步骤(d)与(e)中所述的矿物酸是氢氯酸； 所述步骤(e)中所述的碱是氢氧化钾。
13. 如权利要求7所述方法，进一步包括用水透析纯化所述聚乙二醇-酸的步骤。
14. 如权利要求7所述方法，其中所述方法包括a) 在冰浴内和氩气环境下将溶于二氯甲烷的羟基-甲氧基-聚乙二醇与三乙胺和 甲基磺酰氯混合，以获得甲氧基-聚乙二醇-甲基磺酸酯；b) 在氩气环境下将溶于二甲基亚砜的氰化钾与所述甲氧基-聚乙二醇-甲基磺酸 酯混合，以获得甲氧基-聚乙二醇-腈；用干硅胶过滤柱纯化所述甲氧基-聚乙 二醇-腈；c) 将所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-腈与氢氯酸反应以得到甲氧基-聚乙二醇-酰 胺；采用水透析来纯化所述甲氧基-聚乙二醇-酰胺；d) 将所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-酰胺与氢氧化钾反应，其后以盐酸酸化，以 获得甲氧基-聚乙二醇-酸；e) 采用水透析来纯化所述甲氧基-聚乙二醇-酸；和f) 冷冻干燥所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-酸以获得所述纯化的甲氧基-聚乙二 醇-酸的固体。
15. —种制备分离和实质纯化的聚乙二醇-腈的方法，所述方法包括a) 将羟基-聚乙二醇与氯磺酸反应以得到聚乙二醇-磺酸酯；禾口b) 将所述聚乙二醇-磺酸酯与金属氰化物反应以得到聚乙二醇-腈； 其中所述聚乙二醇-腈是由所述式(III)代表；所述聚乙二醇是由所述通式(II) 代表。
16. 如权利要求15所述方法，其中所述已制备的聚乙二醇-腈为固体而且纯度为95%到100%。
17. 如权利要求15所述方法，其中步骤(a)中所述的氯磺酸是甲基磺酰氯。
18. 如权利要求15所述方法，其中步骤(a)中所述的氯磺酸是对甲苯磺酰氯。
19. 如权利要求15所述方法，进一步包括以色谱柱过滤纯化所述聚乙二醇-腈的步 骤。
20. 如权利要求15所述方法，其中所述方法包括a) 在冰浴内和氩气环境下将溶于二氯甲烷的羟基-甲氧基-聚乙二醇与三乙胺和 甲基磺酰氯混合，以获得甲氧基-聚乙二醇-甲基磺酸酯；b) 在氩气环境下将溶于二甲基亚砜的氰化钾与所述甲氧基-聚乙二醇-甲基磺酸 酯混合，以获得甲氧基-聚乙二醇-腈；c) 用干硅胶过滤柱纯化所述甲氧基-聚乙二醇-腈；和d) 以冷乙醚沉淀所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-腈，以获得所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-腈的固体。
21. —种制备分离和实质纯化的聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯的方法，所述方法包括a) 将羟基-聚乙二醇与氯磺酸反应以得到聚乙二醇-磺酸酯；b) 将所述聚乙二醇-磺酸酯与金属氰化物反应以得到聚乙二醇-腈；c) 将所述聚乙二醇-腈水解为所述聚乙二醇-酸；和d) 使所述聚乙二醇-酸与N-羟基丁二酰亚胺及l,3-二环己基碳酰亚胺在二氯甲 烷的存在下发生反应，以得到所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯；其中所述聚乙二醇是由所述通式(II)代表。
22. 如权利要求21所述方法，其中步骤(a)中所述的氯磺酸是甲基磺酰氯。
23. 如权利要求21所述方法，其中步骤(a)中所述的氯磺酸是对甲苯磺酰氯。
24. 如权利要求21所述方法，其中所述步骤(c)进一步包括e) 以一种矿物酸水解所述聚乙二醇-腈，以得到聚乙二醇-酰胺；和f) 以一种碱水解所述聚乙二醇-酰胺，再以矿物酸酸化，以得到所述聚乙二醇-酸。
25. 如权利要求21所述方法，其中步骤(d)与(e)中所述的矿物酸是氢氯酸； 步骤(e)中所述的碱是氢氧化钾。
26. 如权利要求21所述方法，进一步包括采用水透析来纯化所述聚乙二醇-酸的步 骤。
27. 如权利要求21所述方法，其中所述方法包括a) 在冰浴内和氩气环境下将溶于二氯甲垸的羟基-甲氧基-聚乙二醇与三乙胺和 对甲苯磺酰氯混合，以获得甲氧基-聚乙二醇-对甲苯磺酸酯；b) 在氩气环境下将溶于二甲基亚砜的氰化钾与所述甲氧基-聚乙二醇-对甲苯磺 酸酯混合，以获得甲氧基-聚乙二醇-腈；c) 用干硅胶过滤柱纯化所述甲氧基-聚乙二醇-腈；d) 将所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-腈与氢氯酸反应以得到甲氧基-聚乙二醇-酰 胺；e) 采用水透析来纯化所述甲氧基-聚乙二醇-酰胺；f) 将所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-酰胺与氢氧化钾反应，其后以盐酸酸化，以 获得甲氧基-聚乙二醇-酸；g) 采用水透析来纯化所述甲氧基-聚乙二醇-酸；h) 将所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-酸与N-羟基丁二酰亚胺和l, 3-二环己基碳酰 亚胺在二氯甲垸的存在下混合，并在0°C持续混合；i) 在氩气环境中，使步骤(h)所得的冷却的混合物与1，3-二环己基碳酰亚胺在 二氯甲垸的存在下发生反应，以获得甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯；j)以过滤色谱柱纯化所述甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯；和k)以冷乙醚沉淀所述纯化的甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯，以得到所述 纯化的甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯的固体。
全文摘要
本发明涉及聚乙二醇功能性衍生物和制造方法。本发明描述分离和实质纯化型态的聚乙二醇-酸(PEG-acid)和聚乙二醇酸-腈(PEG-nitrile)，和其制造和纯化的方法。
文档编号C08G65/329GK101357986SQ20081012690
公开日2009年2月4日 申请日期2008年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者梁文辉, 郭汉龙 申请人:康达医药科技有限公司