专利名称：通过对接和锁定(dnl)技术的聚乙二醇化的制作方法
通过对接和锁定(DNL)技术的聚乙二醇化相关申请本申请要求2007年10月26日提交的美国专利申请序列第11/925408号的优先 权，在此引入其全部内容作为参考。
背景技术：
可以经过多种方式，通过改进治疗剂的生物利用度来增强其效力，其中一种方式 是聚乙二醇化，即将聚乙二醇化学连接到目标治疗剂上的过程，而所得轭合物展现出增加 的血清半衰期。聚乙二醇化产物的其他优点还可以包括更低的免疫原性、降低的服药频率、 增加的溶解度、增强的稳定性和减少的肾清除。由于蛋白质(包括肽)上用来连接PEG的 最通常的反应位点为赖氨酸的ε氨基基团和N-末端残基的α氨基基团，所以早期的聚乙 二醇化方法造成多位点修饰，不仅产生由位置异构体混合物组成的单聚乙二醇化轭合物， 例如 PEGINTRON (Grace 等人，J. Biol. Chem. 2005 ；280 6327)和PEGASYS (Dhalluin 等人，Bioconjugate Chem. 2005 ；16 :504)，而且还产生包括多于一个PEG链的加合物。据 报道，单一 PEG与N-末端残基的α氨基基团的位点特异性连接是PEG-乙醛(PEG-ALD) 与 IFN- β lb (Basu 等人，Bioconjugate Chem. 2006 ；17 618)或 IFN- β la (Pepinsky 等人， J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001 ；297 1059)在低PH下反应的主要产物。类似的策略应用于 制备N-末端连接PEG的6气5卩(灯118{161~等人，卩1^1·!!!. Res. 1996 ；13 996)或I型可溶的肿 瘤坏死因子受体(Kerwin等人，Protein Sci. 2002 ；11 1825)。最近报道了一种用于重组干 扰素 α _2a 的 N-末端 PEG 化的固相过程(Lee 等人，Bioconjug. Chem. Oct. 18，2007，印ub)。对于几种重组构建体，还实现了利用PEG-马来酰亚胺(PEG-MAL)对引入目标蛋 白质的游离半胱氨酸残基进行的位点定向聚乙二醇化，所述重组构建体包括IL-2(GoodSon 禾口 Katre，Biotechnology. 1990 8 343) ；IFN-α 2(Rosendahl 等人，Bioconjugate Chem. 2005；16 200) ；GM-CSF(Doherty 等人，Bioconjugate Chem. 2005 ；16 1291)； scFv (Yang 等人，Protein Eng. 2003 ；16 761)，和微型抗体(Kubetzko 等人，J. Biol. Chem ；2006 ；201 35186)。用于提高酶治疗效力的常用途径是制备含有多个小型PEG的 轭合物，如已知用于甲硫氨酸酶(Yang等人，Cancer Res. 2004 ；64 6673) ；L-甲硫氨酸 Y-裂解酶(Takakura 等人，Cancer Res. 2006 66 2807)；精氨酸脱氨酶(Wang 等人， Bioconjugate Chem. 2006 ；17 1447)；腺苷脱氨酶(Davis 等人，Clin. Exp. Immunol. 1981 ； 46 649) ；L-天冬酰胺酶(Bendich 等人，Clin. Exp. Immunol. 1982 ；48 273)；和肝过氧化氢 酶(Abuchowski 等人，J. Biol. Chem. 1977 ；252 3582)。还描述了牛血清白蛋白(Abuchowski等人，J. Biol. Chem. 1977 ;252 :3578)；血 工胃白(Manjula ^A, Bioconjugate Chem. 2003 ； 14 464) ； visomant (Mosharraf φ A, Int. J. Pharm. 2007 ；336 215)；小分子物质，例如整联蛋白α4β1的抑制剂(P印insky 等人，J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005 ；312 742)；淋巴瘤靴向肽(DeNardo 等人，Clin. Cancer. Res. 2003 ；9(Suppl.) :3854s)；抗-VEGF 适体(Bunka 禾口 Stockley，Nat. Rev. Microbiol. 2006 ；4 588)和寡聚脱氧核苷酸(Fisher 等人，Drug Metab. Dispos. 2004 ；32
5983)的聚乙二醇化。但是，存在对于聚乙二醇化的通用方法的需求，该方法能专有地产生 单聚乙二醇化的轭合物，该轭合物由部分特异性连接到候选试剂的预定位置的单一 PEG组 成，并保持未修饰的对应物的生物活性。发明概述本发明公开了用于生成聚乙二醇化复合物的方法和组合物，所述复合物具有连接 到候选试剂的选定位置的选定数目的连接的PEG残基。在优选实施方式中，该试剂是单 聚乙二醇化的。在更优选的实施方式中，如下面详述的，要聚乙二醇化的目标可以连接到 DDD(二聚化和对接结构域)序列，PEG部分可以连接到AD(锚结构域)序列。DDD序列的 二聚体以高亲和力与AD序列的单体结合，导致单聚乙二醇化的效应部分二聚体的形成。结 合的化学计量和PEG残基的位置由DDD/AD相互作用的特异性决定。在更优选的实施方式中，可以通过在DDD和AD序列的适当位置引入半胱氨酸残基 以形成稳定单聚乙二醇化复合物的二硫键来共价地稳定该复合物。在其他实施方式中，可 用直链或支链的甲氧基(m-PEG)在一端对PEG试剂加帽。在其他优选实施方式中，由DNL法制得的聚乙二醇化复合物显示比未聚乙二醇化 的效应部分慢至少一个数量级的血清清除速率。在某些可替代的实施方式中，聚乙二醇化 复合物可以可选择地用连接到DDD序列的PEG部分和连接到AD序列的效应部分构建，得到 每个复合物2个PEG :1个效应部分的化学计量。本领域技术人员将认识到，将要体内施用的几乎任何生理学活性剂或治疗活性 剂都可以通过聚乙二醇化来稳定，所述活性剂包括但不限于酶，细胞因子，趋化因子、生长 因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和其片段。示例性的试剂包括MIF，HMGB-I (高迁移率族 蛋白 1)，TNF-α，IL-1, IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11， IL-12, IL-13, IL-15, IL-16， IL-17， IL-18， IL-19， IL-23， IL-24， CCL19, CCL21, IL-8， MCP-I, RANTES, ΜΙΡ-1Α，ΜΙΡ-1Β，ΕΝΑ-78，MCP-I, ΙΡ-10，Gro-β，嗜酸性粒细胞活化趋化因 子(Eotaxin)，干扰素-α，- β，- λ，G-CSF, GM-CSF, SCF，PDGF，MSF，Flt-3 配基，促红细胞 生成素，血小板生成素，hGH, CNTF,瘦素(1印tin)，制瘤素M，VEGF, EGF, FGF, PlGF,胰岛素， hGH，降钙素，因子VIII，IGF，促生长素抑制素，组织型纤维蛋白溶酶原活性剂和LIF。单聚乙二醇化复合物适用于多种治疗和诊断应用。应用单聚乙二醇化复合物的方 法可包括疾病或其他医疗病状的检测、诊断和/或治疗。这类病状可包括但不限于癌症， 增生，糖尿病，糖尿病性视网膜病，黄斑变性，炎性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，类风湿性 关节炎，结节病，哮喘，水肿，肺部高血压，牛皮癣，角膜移植排斥反应，新生血管性青光眼， Osler-Webber综合症，心肌血管新生，斑块新生血管形成，再狭窄，血管创伤后新内膜形成， 毛细血管扩张症，血友病患者关节，血管纤维瘤，与慢性炎症相关的纤维化，肺纤维化，深静 脉血栓形成或创面肉芽发生。在特定实施方式中，所公开的方法和组合物可以用于治疗自身免疫性疾病，例如， 急性特发性血小板减少性紫癜，慢性特发性血小板减少性紫癜，皮肌炎，西德纳姆舞蹈症， 重症肌无力，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎，风湿热，多腺体综合症，大疱性类天疱疮，青少 年糖尿病，Henoch-Schonlein紫癜，链球菌感染后肾炎，结节性红斑，Takayasu氏动脉炎， Addison病，类风湿性关节炎，多发性硬化症，结节病，溃疡性结肠炎，多形性红斑，IgA肾 病，结节性多动脉炎，强直性脊柱炎，Goodpasture综合征，血栓闭塞性脉管炎，Sjogren氏
6综合征，原发性胆汁性肝硬化，桥本甲状腺炎，甲状腺毒症，硬皮病，慢性活动性肝炎，多发 性肌炎/皮肌炎，多软骨炎，寻常性天疱疮，韦格纳氏肉芽肿，膜性肾病，肌萎缩性侧索硬化 症，脊髓痨，巨细胞动脉炎/肌痛，恶性贫血，急进性肾小球肾炎，牛皮癣或纤维性肺泡炎。预期可以靶向任一类型的肿瘤和任一类型的肿瘤抗原。可以靶向的肿瘤的示例类 型包括急性淋巴母细胞白血病，急性髓性白血病，胆管癌，乳腺癌，骨癌、子宫颈癌，慢性淋 巴细胞性白血病，慢性髓性白血病，结肠直肠癌，子宫内膜癌，食管癌，胃癌，头颈癌，霍奇金 氏淋巴瘤，肺癌，甲状腺髓样癌，非霍奇金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤，肾癌，卵巢癌，胰腺癌， 神经胶质瘤，黑色素瘤，肝癌，前列腺癌，和尿膀胱癌。附图概述
图1.DNL方法的卡通图示。三角形表示组分A，其形成由二聚化和对接结构域 (DDD)介导的同型二聚体(a2)。标示了工程化的半胱氨酸残基的游离巯基(SH)的位置。八 边形表示含有锚结构域(AD)肽的组分B。DNL反应通过DDD与AD肽的结合和二硫桥的随 后形成生成共价的三聚结构。图2. IMP362的卡通图示。显示了 20kDa的PEG(爆炸星形)、AD2肽(螺旋形)， EDANS荧光标签(椭圆形)和游离巯基(SH)的位置。图3· IMP413的卡通图示。显示了 30kDa的PEG(爆炸星形)、AD2肽(螺旋形)、 EDANS荧光标签(椭圆形)和游离巯基(SH)的位置。图4.为利用抗-IFNa免疫印迹和ELISA对转瓶生产和纯化的分析。样品如所示 稀释，并用5 μ 1进行还原SDS-PAGE和用多克隆抗-IFNa的免疫印迹分析。给出了每份样 品的稀释度、总体积、总体积的分析分数(f)。根据标准品估算每个条带中蛋白质的量，并除 以总体积以得到总蛋白的估值。还给出了通过ELISA测定的总蛋白测量值。图5· α 2b_362的卡通图示。标示了 IFNa 2b基团(五边形)、20kDa PEG(爆炸星 形)、AD2和DDD2肽(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。图6. α 2b_413的卡通图示。标示了 IFN α 2b基团(五边形)、30kDa PEG(爆炸星 形)、AD2和DDD2肽段(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。图7.显示在rhIFN- α 2b标准品、IFN- α 2b_DDD2或α 2b_362存在下培养4天后 伯基特淋巴瘤(Daudi)细胞的体外生长抑制的剂量响应曲线。将MTS染料加入到平板中， 其在测量OD49tl之前孵育3h。将获得的信号占未处理细胞的百分比对应摩尔浓度的log值 作图。通过Graph Pad Prism软件的S形拟合非线性回归获得50%有效浓度(EC5tl)。图8. IFNa构建体的药代动力学特性评估。将每种试剂(测试和对照)以等摩 尔蛋白剂量作为单一丸剂i. v.注射施用于Swiss-Webster小鼠中，rhuIFN- a 2a为3 μ g， PEGINTR0N 为5 μ g，α 2b_362为11 μ g，且α 2b_413为13 μ g。在所示时间分离血清样品， 并通过ELISA测定IFN-α的血清浓度。将P M浓度对应注射后小时数作图。数据代表来 自两只小鼠的平均值。图9.荷有伯基特淋巴瘤(Daudi)的小鼠中的IFN-α构建体治疗效力的评估。8 周大的雌性SCID小鼠i. v.注射1. 5xl07Daudi细胞。具有5只小鼠的组施用PEGINTR0N 、 a2b-362和^213-413，剂量为3，500、7，000或14，000单位，每周一次，持续4周。治疗从 Daudi细胞移植后一天开始。注射时间如箭头所示。显示了每组的存活曲线和存活中值。图10.用于治疗荷有肿瘤小鼠的给药安排的评价。8周大的雌性SCID小鼠i. v.注射1. 5xl07Daudi-细胞。向具有6、7只小鼠的组经由皮下注射施用14，000IU的PEGINTR0N 或a2b-413。在将Daudi细胞施用于小鼠后一天开始治疗。向各组一周一次(q7dx4)、两 周一次(q2wkx4)、三周一次(q3wkx4)给药。注射时间用箭头表示。所有小鼠共计接受4次 注射。显示了各组的存活曲线和存活中值。图11. G-CSF-413的卡通图示。标示了 G-CSF基团(五边形)、30kDaPEG(爆炸星 形状)、AD2和DDD2肽(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。图 12. h679-Fab-DDD2 (A)、二聚 EP0-DDD2 (B)的卡通图示，其 h679_Fab_DDD2 和聚 EP0-DDD2通过DNL法结合以生成EP0-679 (C)。标示了 h679Fab (椭圆形)可变结构域和恒 定结构域、AD2和DDD2螺旋、EPO基团(五边形)和游离巯基(SH)。图13. EPO构建体对细胞生长的刺激。EPO-应答的TFl细胞(IxlO4)在rhEPO、 EP0-DDD2或EP0-679存在下培养72小时。通过MTS分析测定相对活细胞密度。将U/mL浓 度的log值对应OD49tl作图。图14.EP0-413的卡通图示。标示了 EPO基团(五边形)、30kDa PEG(爆炸星形)、 AD2和DDD2肽(螺旋形)和EDANS荧光标签(椭圆形)。图 15. IMP-421 的结构。图 16. mPEG2-MAL-40K 的结构。对接和锁定(DNL)方法DNL法利用发生在cAMP-依赖的蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基和A-激酶锚定蛋 白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等人，FEBS Letters. 2005 ；579 3264. Wong 和 Scott,Nat. Rev. MoI. Cell Biol. 2004 ；5 959)。1968 年 PKA首次从兔骨骼肌中分离，在由第二信使cAMP与R亚基结合引发的研究最充分的信号转 导途径之一中，PKA起到核心的作用(Walsh等人，J. Biol. Chem. 1968 ；243 3763)。全酶的 结构由被R亚基置于非活性形式的两个催化亚基构成(Taylor，J. Biol. Chem. 1989 ；264 8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RJ和RII)，并且每种类型有α和β同 种型(Scott,Pharmacol. Ther. 1991 ；50 :123)。R亚基仅以稳定的二聚体被分离，并且已经 显示二聚体化结构域由前44个氨基末端残基组成(Newlon等人，Nat. Struct. Biol. 1999 ； 6 222)。cAMP结合到R亚基导致了活性催化亚基的释放以获得广谱的丝氨酸/苏氨酸激酶 活性，活性催化亚基通过PKA的区隔化定位至选定的底物，PKA的区隔化经由其与AKAP的 对接实现(Scott 等人，J. Biol. Chem. 1990 ；265 ；21561)。自从1984年表征首个AKAP即微管相关蛋白_2以来(Lohmann等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984 ；81 6723)，已经在从酵母到人类的多个物种中鉴别出具有不同的结构 的50多种AKAP，它们位于不同的亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒 体和内质网(Wong 和 Scott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 959)。AKAP 对 PKA 的 AD 是 14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J. Biol. Chem. 1991 ；266 14188)。各个AKAP之间的 AD的氨基酸序列差别很大，据报道，其对于RII 二聚体的结合亲和力为从2-90nM(Alto等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 ；100 4445)。有趣的是，AKAP 只结合到二聚 R 亚基。对 于人类RIIa，AD结合到由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scottjrends Cell Biol. 1999 ；6 216)。因此，人类RII α的二聚体化结构域和AKAP结合结构域均位于 相同的 N-末端 44 氨基酸序列中(Newlon 等人，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 222 ；Newlon 等
8人，EMBO J. 2001 ；20 1651)，其在本文被称为 DDD。作为连接体模块的人RII α的DDD和AKAP的AD我们已经开发出利用人类RII α的DDD和特定氨基酸序列的AD作为优秀的连接 体模块对以将任何两个实体(以下简称为A和B)对接成非共价复合物的平台技术，该复合 物可通过引入半胱氨酸残基到DDD和AD 二者的重要位点以促进形成二硫键而进一步锁定 为稳定拴系结构，如图1所示。“对接和锁定”(dock-and-lock)途径的常规方法如下。实 体A通过连接DDD序列与A的前体构建，得到以下称为a的第一组分。由于DDD序列会影 响二聚体自发的形成，因此A将由a2组成。实体B通过连接AD序列与B的前体构建，得到 以下称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚基序将形成用于结合b中含有的AD序列 的对接位点，从而促进迅速缔合以形成包含a2b的二元的、三聚复合物。用经由二硫 桥共价固定所述两个实体的随后反应使结合事件不可逆，基于有效的局部浓度原理，所述 反应非常有效地发生，因为初始的结合相互作用使置于DDD和AD 二者上的反应性巯基靠近 (Chimura 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 ；98 8480)以进行位点特异性连接。通过在远离两个前体的功能基团处连接DDD和AD，还预期这些位点特异性连接 保持两个前体的原始活性。这种方法具有模块化的性质，并潜在地能用于位点特异性和共 价地连接多种物质，包括肽、蛋白质、核酸和PEG。DNL方法公开于以下美国临时专利申请 2005年10月20日提交的60/728，292 ；2005年12月16日提交的60/751，196 ；和2006年 3月14日提交的60/782，332 ；和以下美国专利申请2006年3月24日提交的11/389，358 ； 2006年3月28日提交的11/391，584 ；2006年6月29日提交的11/478，021 ；2006年12月 5日提交的11/633，729 ；和2007年10月26日提交的11/925，408。在优选的实施方式中，如下述实施例所述，要聚乙二醇化的效应部分是蛋白质或 肽，其能够连接到DDD或AD单元以形成融合蛋白或肽。已知多种生成融合蛋白的方法，包括 核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成的双链核酸。这种双链核酸可 以利用标准分子生物学技术插入到用于融合蛋白生产的表达载体中(参见，例如Sambrook 等人，Molecular Cloning, A laboratory manual (分子克隆实验手册)，第 2 版，1989)。在 这样的优选实施方式中，AD和/或DDD部分可连接到效应蛋白或肽的N-端或C-端。但是，技术人员将认识到，依赖于效应部分的化学性质和其生理活性涉及的效应 部分的部位，AD或DDD位点与效应部分的连接位点可以改变。多种效应部分的位点特异性 连接可以使用本领域已知的技术进行，例如使用二价交联试剂和/或其他化学轭合技术。通过DNL的聚乙二醇化在优选的方法中，将要聚乙二醇化的靶与DDD序列连接以生成DDD模块。将具 有期望的分子大小的PEG试剂与相关AD序列衍生，并将由此产生的PEG-AD模块与DDD 模块组合以产生聚乙二醇化的轭合物，该轭合物由通过DDD和AD之间形成的二硫键位点 特异性连接到效应部分的两个拷贝的单一 PEG组成。PEG试剂可在一端具有甲氧基加帽 (m-PEG)，可以是直链或支链的，并可能包含以下功能基团中的一种丙醛、丁醛、邻吡啶硫 酯(ortho-pyridylthioester，0ΡΤΕ)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、噻唑烷-2-硫酮、琥珀酰 亚胺碳酸酯(SC)、马来酰亚胺、或邻吡啶二硫化物(OPPS)。可能为聚乙二醇化的目标的效 应部分包括酶、细胞因子、趋化因子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和抗体片段。该方 法是非限制性的，使用所公开的方法和组合物可以对多种剂进行聚乙二醇化。不同大小的
9和用多种反应性部分的衍生的PEG可从商业来源获得，如下面实施例中更详细讨论的。细胞因子和其他免疫调节剂在某些优选的实施方式中，要聚乙二醇化的效应部分是免疫调节剂。免疫调节剂 是在存在时改变、抑制或刺激身体的免疫系统的剂。有用的免疫调节剂可以包括细胞因子、 干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成 素、血小板生成素和其组合。特别有用的是淋巴毒素，例如肿瘤坏死因子(TNF)的；造血因 子，如白细胞介素(IL)；集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞 集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，如干扰素-α，-β或-Y ；和干细胞生长因子，如命名为 “Si因子”的干细胞生长因子。在更优选的实施方式中，要聚乙二醇化的效应部分为细胞因子，如淋巴因子、单核 因子、生长因子和传统的多肽激素。包括在细胞因子中的为生长激素，如人生长激素、N-甲 硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松弛激 素；前松弛激素；糖蛋白激素，如促卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和促黄体生成 素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白； 肿瘤坏死因子-α和-β ；苗勒抑制物质(mullerian inhibitingsubstance)；小鼠促性腺 激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长 因子，如NGF-β ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ；胰岛素样生 长因子-I和-II ；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、_β和-Y ； 集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL_1、IL-I a、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ； IL_13、IL-14、IL-15、IL_16、 IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit-配基或FLT-3、制管张素、血小板反应素、内皮抑制 素、肿瘤坏死因子(TNFjBTNF-a)和LT。示例性细胞因子的聚乙二醇化描述在实施例2_12 中。蛋白质或肽免疫调节剂如细胞因子的氨基酸序列是本领域公知的，并且任何此 类已知的序列可以用于本发明的实施。本领域技术人员知道关于细胞因子序列的公共 信息的很多来源。例如，NCBI数据库含有大量细胞因子和免疫调节剂的蛋白质序列和 编码核酸序列，所述细胞因子和免疫调节剂如促红细胞生成素(GenBank匪000799)、 IL-I β (GenP印tAAH08678)、GM-CSF (GenP印t MA52578)、TNF_ a (GenPept CAA26669)和几 乎任一种上述的肽或蛋白质免疫调节剂。鉴别基本上任一种目标蛋白或肽效应部分的适当 氨基酸和/或核酸序列对于本领域技术人员来说是常规的技能。抗体和抗体片段在其他的实施方式中，抗体或抗体的抗原结合片段可以聚乙二醇化。抗原结合的 抗体片段是本领域公知的，诸如F(ab' )2, F(ab)2, Fab'、Fab、Fv、scFv和类似片段，并且 可以使用任何这种已知的片段。如本文所用的，抗原结合的抗体片段是指与完整抗体或母 体抗体识别的相同抗原结合的抗体的任何片段。用于制备几乎任何目标抗体或片段的AD 和/或DDD轭合物的技术是已知的(例如，美国专利申请序列第11/633，729号)。可以使用未与治疗剂轭合的抗体或其片段，称为“裸露”抗体或其片段。在可替代 的实施方式中，抗体或片段可轭合至一种或多种治疗剂和/或诊断剂。多种此类治疗剂和 诊断剂是本领域已知的，如下面将详细讨论，并且可以使用任何此类已知的治疗剂或诊断
10剂。针对基本上任何靶抗原制备单克隆抗体的技术是本领域公知的。参见，例如， Kohler 和 Milstein，Nature 256 :495 (1975)，和 Coligan 等人(编.)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (免疫学最新方案)，卷 1，第 2. 5. 1-2. 6. 7 页(John ffiley&Sons 1991)。简 言之，单克隆抗体可通过以下获得向小鼠注射含抗原的组合物，取出脾以获得B淋巴细 胞，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤细胞，收集选择产生针对所 述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对所述抗原的抗体的克隆，并从杂交瘤细胞培养物 中分离抗体。可以利用各种完善的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离 技术包括应用A蛋白琼脂糖凝胶(Sepharose)的亲和层析、体积排阻层析和离子交换层 析。参见,例如，Coligan，第2. 7. 1-2.7. 12页和第2. 9. 1-2. 9. 3页。还参见Baines等人， "Purification of Immunoglobulin G(IgG) ”(免疫球蛋白 G(IgG)的纯化)，METHODS IN M0LECULARBI0L0GY(分子生物学方法)，卷 10，第 79-104 页(Humana Press, Inc. 1992)。在针对免疫原的抗体的初步培育之后，可以对抗体进行测序，并随后由重组技术 制备所述抗体。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员公知的。从人源化抗 体、嵌合抗体或人抗体衍生的抗体组分的使用避免了与鼠恒定区的免疫原性有关的潜在问 题。嵌合抗体嵌合抗体是其中人抗体的可变区已被，例如，小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))取代的重组蛋白。当施 用于受试者时，嵌合抗体展现出减小的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆小鼠免疫球蛋 白可变结构域的常规技术公开于，例如，Orlandi等人，Proc. Nat' 1 Acad. ScL USA 86: 3833(1989)。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员公知的。例如，Leung等人，Hybridoma 13 :469 (1994)，通过通过组合编码鼠LL2(—种抗-CD22单克隆抗体)的Vk和Vh结构域的 DNA序列以及相应的人κ和IgG1恒定区结构域的DNA序列，产生了 LL2嵌合体。人源化抗体产生人源化单克隆抗体技术是本领域公知的(参见，例如，Jones等人，Nature 321 522 (1986)，Riechmann 等人，Nature 332 323 (1988)，Verhoeyen 等人，Science 239 1534(1988)，Carter 等人，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 89 4285(1992)，Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 :437 (1992)，和 Singer 等人，J. Immun. 150 :2844 (1993))。通过把小鼠的 CDR从小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链转移到相应人抗体可变结构域，可使得嵌合 的或鼠单克隆抗体人源化。嵌合单克隆抗体的小鼠框架区(FR)，也取代为人类FR序列。由 于只转移小鼠的CDR到人类FR常常导致抗体亲和力的下降甚至丧失，可能需要其他的修饰 以恢复鼠抗体的原始亲和力。这可以通过将FR区的一个或多个某些人类残基替换为它们 的鼠对等物以获得具有对其表位的良好结合亲和力的抗体来实现。参见，例如，Tempest等 人，Biotechnology 9:266(1991)和 Verhoeyen 等人，Science 239:1534(1988)。一般来 说，不同于其鼠对等物和紧邻或接触一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基将 是取代的候选残基。人抗体
11
使用组合方法或以人免疫球蛋白基因组转化的转基因动物生产完全人抗体的方 法是本领域已知的(例如，Mancini 等人，2004，New Microbiol. 27 :315_28 ;Conrad 和 Scheller,2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8 117-26 ；Brekke 禾口 Loset,2003, Curr. Opin. Phamacol 3:544-50)。还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技 术来构建完全人抗体，所述方法或技术全部是本领域已知的。参见例如，McCafferty等人， Nature348 :552_553 (1990)。预期此类完全人抗体展现出比嵌合或人源化抗体甚至更少的 副作用，并在体内基本上像内源性人抗体一样起作用。在某些实施方式中，所要求保护的方 法和操作可以使用由这些技术生产的人抗体。在一个可替代的实施方式中，噬菌体展示技术可以用于人抗体的产生(例如， Dantas-Barbosa等人，2005，Genet. Mol. Res. 4 126-40)。人抗体可能产生自正常的人或表 现出特定疾病状态如癌症的人(Dantas-Barbosa等人，2005)。从患病个体构建人抗体的优 点是，循环抗体谱可能会偏好针对疾病相关抗原的抗体。在该方法的一个非限制实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)构建了骨肉瘤患者 的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般而言，总RNA从循环血淋巴细胞获得(Id.)。重 组Fab从μ、γ和κ链抗体谱克隆，并插入噬菌体展示文库(Id.)。将RNA转化为cDNA，并 使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物生成Fab cDNA文库(Marks等人，1991， J Mol. Biol. 222 :581_97)。文库构建是根据 Andris-Widhopf 等人(2000，于=PhageDisplay Laboratory Manual (噬菌体展示实验手册)，Barbas 等人(eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，第 9. 1 至 9. 22 页)进行。最后的 Fab 片段被 限制性内切酶消化并插入噬菌体基因组中，以制备噬菌体展示文库。可通过标准噬菌体展 示方法筛选此类文库，如本领域已知的。噬菌体展示可以多种形式进行，有关它们的综述，参见，例如Johnson和 Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564—571(1993)。人抗体也可能 由体外活化的B-细胞产生。参见美国专利第5，567，610和5，229，275号，其通过参考以其 全部内容结合到本文。本领域技术人员将认识到这些技术是示例性的，并且可以利用用于 制造和筛选人类抗体或抗体片段的任何已知方法。在另一可替代的实施方式中，使用标准的免疫方案，已被基因工程化以生产人抗 体的转基因动物可用于产生针对几乎任何免疫性靶标的抗体。从转基因小鼠获得人抗 体的方法公开于 Green 等人，Nature Genet. 7 13 (1994), Lonberg 等人，Nature 5(55 856 (1994)，和Taylor等人，Int. Immun. 6 579 (1994)。此类系统的一个非限制实例是来自 于 Abgenix(Fremont, CA) 的XenoMouse (例如，Green 等人，1999，J. Immunol. Methods 231 11-23)。在XenoMouse⑧和类似动物中，小鼠抗体基因已被灭活并被有功能的人抗 体基因所取代，但小鼠免疫系统的其余部分保持不变。用种系配置的YAC(酵母人工染色体)转化XenoMouse ,所述YAC含有人类IgH 和IgK基因座的部分，包括可变区序列的大部分，以及附属基因和调节序列。人类可变区 谱可以用来生成产生抗体的B-细胞，所述B-细胞可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗 原免疫的XenoMouse 将通过正常的免疫反应产生人抗体，所述人抗体可通过上文讨论 的标准技术收获和/或生产。XenoMouse 的多个品系是可获得的，其中每个品系能生产 不同类别的抗体。已显示转基因生产的人类抗体具有治疗潜力，同时保持正常人抗体的药
12代动力学特性(Green等人，1999)。本领域技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法 不局限于使用XenoMouse 系统，而是可使用已被基因工程化为生产人类抗体的任何转 基因动物。抗体片段可以由已知的技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的结合抗原部 分，如F(ab' )2、Fab'、F (ab) 2、Fab、Fv、sFv和类似片段。F(ab' )2片段可以通过抗体分 子的胃蛋白酶消化产生，而Fab'片段可以通过还原F(ab' )2片段的二硫桥生成。可替代 地，可构建Fab'表达文库(Huse等人，1989，Science，246 1274-1281)，以便快速和简单的 鉴别具有所需特异性的单克隆Fab'片段。F(ab)2片段可能由抗体的木瓜蛋白酶消化生成， 并且Fab片段可通过二硫键还原获得。单链Fv分子(scFv)包括一个VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形 成靶标结合位点。这两个结构域进一步通过肽连接体(L)共价连接。制造scFv分子和设计 合适的肽连接体的方法公开于美国专利第4，704，692号，美国专利第4，946，778号，R. Raag 和 M.ffhitlow, "SingleChain Fvs"(单链 Fv)FASEB 卷 9 :73_80(1995)以及 R. E. Bird 和 B. W. Walker, "Single Chain Antibody Variable Regions，，(单链抗体可变区)TIBTECH， 卷 9 132-137(1991)。抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或在大肠杆菌(E. coli)或另一宿主中表达 编码该片段的DNA来制备。抗体片段可通过传统方法以胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗 体得到。这些方法描述于例如，Goldenberg，美国专利第4，036，945号和第4，331，647号以 及其中包含的参考文献。还参见Nisonoff等人，Arch Biochem. Biophys. 89 230 (1960)； Porter, Biochem. J. 73 119 (1959)，Edelman 等人，于 METHODS IN ENZYM0L0GY 中卷· 1，第 422 页(Academic Pressl967)，和 Coligan 在第 2.8. 1-2.8. 10 页和第 2. 10.-2. 10. 4 页。已知抗体使用的抗体可以从多种已知来源商业获得的。例如，多种分泌抗体的杂交瘤 系可从美国菌种保藏中心获得(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)。针对不同疾病靶标的 许多抗体，包括但不限于肿瘤相关抗原，已保存于ATCC和/或已发表可变区序列，并 可用于所要求保护的方法和组合物。参见，例如，美国专利第7，312，318 ；7, 282，567 ；
7，151，164；7,074，403 ；7，060，802 -J,,056;,509 -J,,049，060 ；7,,045，132；7,041，8037，041，802；7,041，293 ；7，038，018 ；7:,037:’ 498 -J,,012,,133 ；7;,001，598；6,998，4686，994，976；6,994，852 ；6，989，241 ；6;,974;,863 ；6;,965，018 ；6，964，854；6,962，9816，962，813；6,956，107 ；6，951，924 ；6;,949,,244 ；6,946，129 ；6，943，020；6,939，5476，921，645；6,921，645 ；6，921，533 ；6，919，433 ；6，919，078 ；6，916，475；6,905，6816，899，879；6,893，625 ；6，887，468 ；6，887，466 ；6，884，594 ；6，881，405；6,878，8126，875，580；6,872，568 ；6，867，006 ；6，864，062 ；6，861，511 ；6，861，227；6,861，2266，838，282；6,835，549 ；6，835，370 ；6:,824;,780 ；6;,824,,778 ；6,,812，206；6,793，9246，783，758；6,770，450 ；6，767，711 ；6;,764;,688 ；6,,764，681 ；6，764，679；6,743，8986，733，981；6;,730;,307 ；6:,720’ 15 ；6,716，966 ；6，709，653 ；6，693，176；6,692，9086，689，607；6,689，362 ；6，689，355 ；6，682，737 ；6，682，736 ；6，682，734；6,673，3446，653，104；6,652，852 ；6，635，482 ；6，630，144 ；6，610，833 ；6，610，294；6,605，4416，605，279 ；6，596，852 ；6，592，868 ；6，576，745 ；6，572 ；856 ；6，566，076 ；6，562，618 ； 6，545，130 ；6，544，749 ；6，534，058 ；6，528，625 ；6，528，269 ；6，521，227 ；6，518，404 ； 6，511，665 ；6，491，915 ；6，483，930 ；6，482，598 ；6，482，408 ；6，479，247 ；6，468，531 ； 6，468，529 ；6，465，173 ；6，461，823 ；6，458，356 ；6，455，044 ；6，455，040,6，451，310, 6，444，206 ‘ 6，441，143 ；6，432，404 ；6，432，402 ；6，419，928 ；6，413，726 ；6，406，694 ； 6，403，770 ；6，403，091 ；6，395，276 ；6，395，274 ；6，387，350 ；6，383，759 ；6，383，484 ； 6，376，654 ；6，372，215 ；6，359，126 ；6，355，481 ；6，355，444 ；6，355，245 ；6，355，244 ； 6，346，246 ；6，344，198 ；6，340，571 ；6，340，459 ；6，331，175 ；6，306，393 ；6，254，868 ； 6，187，287 ；6，183，744 ；6，129，914 ；6，120，767 ；6，096，289 ；6，077，499 ；5，922，302 ； 5，874，540 ；5，814，440,5，798，229,5，789，554 ；5，776，456 ；5，736，119 ；5，716，595 ； 5，677，136 ；5, 587，459 ；5, 443，953 ；5, 525，338号。这些只是示例性的，多种其他抗体和其 杂交瘤是本领域已知的。本领域技术人员将认识到，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序 列或抗体分泌杂交瘤可通过简单检索ATCC、NCBI和/或美国专利商标局数据库中针对选定 的感兴趣的疾病相关靶标的抗体。克隆抗体的抗原结合结构域可使用本领域已知的标准技 术扩增，切除，连接至表达载体，转染至一修改的宿主细胞并用于蛋白质的生产。治疗剂在可替代的实施方式中，可按本文的描述对治疗剂进行聚乙二醇化，所述治疗剂 如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前体 药物、毒素、酶或其他剂。已公开了以下治疗剂的聚乙二醇化形式，例如，SN38 (Zhao等人， Bioconjug Chem 2008，10 :849_59)、尿酸酶(Biggers 和 Scheinfeld，Curr Opin Investig Drugs 2008,9 :422_29)、多西紫杉醇(Liu 等人，2008，J Pharm Sci 97 :3274_90)和喜树碱 (Haverstick等人，2007，Bioconjug Chem 18:2115-21)。使用的药物可具有选自由抗有丝 分裂、抗激酶、烷基化、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗血管生成、促凋亡剂和其组合组成的组 的药物特性。使用的示例性药物可包括5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类 抗生素、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡钼、 10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺钼(⑶DP)、Cox-2抑制剂、依立替康 (CPT-Il)、SN-38、卡钼、克拉屈滨、喜树碱(camptothecans)、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪 胺、多西紫杉醇、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素(2P-D0X)、氰基吗啉阿 霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、表叶毒素epidophyllotoxin、雌激 素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷 (FUdR), 3' ,5' -0-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基蛋白转移酶抑制 剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺(lenolidamide)、 亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝 裂霉素、米托坦、新霉酰胺、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、甲基苄胼、紫杉醇、喷司他丁、 PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲佐菌素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide) (DTIC的含水形式)、反钼、沙利度胺、硫乌嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、 长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花属生物碱。使用的毒素可能包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂素、核糖核酸酶(RNA酶)，
14例如，豹蛙酶(onconase)、DNA酶I、葡萄球菌属(Staphylococcal)肠毒素Α、商陆抗病毒蛋 白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素和假单胞菌内毒素。使用的趋化因子可包括RANTES、MCAF, MIPl-α β、MIPl-β和ΙΡ_Ι0。在某些实 施方式中，可使用抗血管生成剂、如制管张素、baculostatin、血管能抑素、乳腺丝抑蛋白、 抗-VEGF抗体、抗-PIGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗-Flk-I抗体、抗-Flk-I抗体和 肽、抗-Kras抗体、抗-cMET抗体、抗-MIF(巨噬细胞移动抑制因子)抗体、层粘蛋白肽、纤维 连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、 Gro-β、血小板反应素、2-甲氧雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧酰胺三唑、CM101、马立马司 他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、 利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管张 素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-470、血小板因子4或米诺环素。其它有用的治疗剂可包括寡核苷酸，尤其是优选针对致癌基因和致癌基因产物例 如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。轭合已知并可以使用将小分子轭合到蛋白或肽如AD或者DDD肽上的多种技术和组 合物。治疗剂可以连接到，例如还原的巯基和/或糖侧链。治疗剂可以通过二硫键形 成连接到含有半胱氨酸残基的还原的蛋白质或肽上。可替代地，此类剂够使用异双功 能交联剂如N-3-(2-吡啶二硫)丙酸琥珀酯(SPDP)连接。Yu等人，Int. J. Cancer 56: 244(1994)。这种轭合的常用技术是本领域公知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PR0TEINC0NJUGATI0N AND CROSS-LINKING (蛋白轭合和交联化学)(CRCPress 1991)； Upeslacis 等人，“Modification of Antibodies by ChemicalMethods”(通过化学方法修 饰抗体)，于 MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS (单克隆抗体原理和 应用)，Birch 等人· (eds.)，第 187-230 页(ffiley-Liss, Inc. 1995) ；Price, "Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，，(合成月太tii生白勺抗 体的生产和表征)，于 MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION(单克隆抗体生产、工程化和临床应用)，Ritter等人.(eds.)，第60-84页 (Cambridge University Pressl995)。治疗应用本文所述的组合物特别适用于各种疾病状态的治疗。在优选的实施方式中，所述 疾病可能是自身免疫性疾病或癌症，如造血细胞癌症或实体肿瘤。可使用所公开的组合物 和方法治疗的示例性非限制性疾病包括B-细胞淋巴瘤的无痛形式、B细胞淋巴瘤的侵袭 形式、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、急性髓性 白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、以 及GVHD、冷球蛋白血症、溶血性贫血、同种致敏和器官移植排斥反应。还包括第III类自身 免疫性疾病，诸如免疫介导的血小板减少症、如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性 血小板减少性紫癜、皮肌炎、Sjogren氏综合征、多发性硬化症、西德纳姆舞蹈症、重症肌无 力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、类风湿关节炎、多腺体综合症、大疱性类天疱疮、 糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu' s动脉炎、 Addison病、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture综合征、闭塞性血栓性脉管炎、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状 腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳 氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/肌痛、恶性贫血、急进 性肾小球肾炎和纤维性肺泡炎。可以治疗的实体肿瘤包括成神经细胞瘤，恶性黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌， 子宫癌，子宫内膜癌，前列腺癌，肺癌，肾癌，结肠直肠癌，胃癌，膀胱癌，神经胶质瘤，肉瘤， 脑癌，食管癌，上皮细胞癌，骨肉瘤，睾丸癌，肝癌和胰腺癌。试剂盒多个实施方式可能涉及含有适用于治疗或诊断患者病变组织的组分的试剂盒。示 例性试剂盒可含有至少如本文所述的聚乙二醇化的治疗剂。如果用于施用的含组合物的组 分未配制为通过消化道递送如口服递送，则可包括能够通过一些其他途径递送所述试剂盒 组分的装置。用于诸如胃肠外递送的应用的装置的一种类型是用来将所述组合物注入受试 者身体的注射器。也可使用吸入装置。在某些实施方式中，能够以包含无菌、液体制剂或冻 干制品的预充式注射器或自动进样笔的形式提供聚乙二醇化的治疗剂。试剂盒组分可以共同包装或分成两个或多个容器。在一些实施方式中，容器可以 是含有适于重建的组合物的无菌、冻干制剂的小瓶。试剂盒还可包含适于重建和/或稀释 其他试剂的一种或多种缓冲液。可用的其他容器包括但不限于袋、盘、盒、管或类似容器。 试剂盒组分可包装并无菌保持在容器中。可包括的另一组分是给使用试剂盒的人员的关于 其使用的说明。
实施例提供下面的实施例来说明而不是限制本发明的权利要求。实施例1. PEG-AD2模块的生成IMP350 的合成CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)-NH2 (SEQ ID Ν0:1)ΜΗ+2354使用 Fmoc 方法在 Protein Technologies PS3 肽合成仪上用 Sieber Amide 树脂在0. Immol水平制备包括AD2序列的IMP350。从C-末端开始，所用保护的氨 基酸是 Fmoc-Cys (t-Buthio)-OH、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Gln (Trt)-0H、 Fmoc-Gln (Trt) _0H、Fmoc-I Ie-OH> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Asp (OBut) -OH、 Fmoc-Val-0H、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Tyr (But) -OH、Fmoc-Glu (OBut) -OH、Fmoc-I Ie-OH> Fmoc-Gln (Trt) -OH、 Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Cys (Trt) -OH。将肽从树脂上切下并用反相(RP) HPLC纯化。PEG20-IMP 350 的合成IMP350(0. 0104 克)与溶于 7 毫升 IM Tris 缓冲液(pH 7.81)的 0. 1022 克的 mPEG-0PTE(20kDa, Nektar Therapeutics)混合。随后加入1毫升乙腈来溶解某些悬浮物 质。将反应物在室温下搅拌3小时，然后加入0. 0527克的TCEP和0. 0549克的半胱氨酸。 将反应混合物搅拌1. 5小时，然后在PD-IO脱盐柱纯化，脱盐柱用溶于水的20%甲醇平衡。 将样品洗脱，冷冻和冻干，得到0. 0924克粗PEG2(1-IMP350(MH+23508，MALDI)。IMP360 的合成
16
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)G-EDANS(SEQ ID NO :1)ΜΗ+2660使用Fmoc 方法在 Protein Technologies PS3 多肽合成仪用 Fmoc-Gly-EDANS 树 脂在 0. Immol 水平制备包括 AD2 序列的 IMP360。使用 0. 23gFmoc-Gly_0H、0. 29g HATU, 26 μ L DIEA、7. 5mL DMF 和 0. 57g EDANS 树脂(Nova Biochem)手动将 Fmoc-Gly-OH 添加至 树脂。将这些试剂混合并添加到树脂。反应物在室温下混合2. 5小时，并用DMF和IPA清 洗树脂以除去过量的试剂。从C-末端开始，所用保护的氨基酸是Fmoc-Cys (t-Buthio) -0H、 Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Tn)-0H> Fmoc-Gln (Tn)-0H> Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Asn (Trt)-0H> Fmoc-Asp (OBut)-0H> Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Gln (Trt)-OH、Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr (But)-OH> Fmoc-Glu (OBut) -OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Gln (Trt) -0H、Fmoc_Gly-0H和 Fmoc-Cys (Trt) -OH。 将多肽从树脂切下并用RP-HPLC纯化。IMP362 (PEG20-IMP 360)的合成IMP362的卡通图提供于图2。为了合成IMP362，将IMP360 (0. 0115克)与溶于7 毫升 IM Tris 缓冲液(pH 7. 81)的 0. 1272 克 mPEG-OPTE (20kDa，Nektar Therapeutics)混 合。随后加入乙腈(1毫升)来溶解某些悬浮物质。将反应物在室温下搅拌4小时，然后加 入0. 0410克的TCEP和0. 0431克的半胱氨酸。反应混合物搅拌1小时，然后在PD-IO的脱 盐柱纯化，该脱盐柱用溶于水的20%甲醇平衡。将样品洗脱、冷冻和冻干，得到0. 1471克粗 IMP362(MH+23713)。IMP 413 (PEG30-MP 360)的合成IPM413的卡通图提供于图3。为了合成IMP413，将IMP360 (0. 0103克)与溶于7 毫升 IM Tris 缓冲液(pH 7. 81)的 0. 1601 克 mPEG-OPTE (30kDa，Nektar Therapeutics)混 合。随后加入乙腈(1毫升)来溶解某些悬浮物质。将反应物在室温下搅拌4. 5小时，然后 加入0. 0423克的TCEP和0. 0473克的半胱氨酸。反应混合物搅拌2小时，然后透析2天。 将透析的物质冷冻和冻干，得到0. 1552克粗IMP413(MH+34499)。IMP421 的合成IMP 421 Ac-C-PEG3-C (S-tBu) GQIEYLAKQIVDNAIQQAGC (S-tBu) G-NH2 (SEQ IDNO :9)通过以所示的顺序向树脂添加下述氨基酸在NovaSyn TGR树脂(487. 6毫 克，0. 112 毫摩尔)上制备肽 IMP421, MH+2891 =Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Cys (t-Buthio) -0H, Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gln (TrQ-0H、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn (Trt)-0H> Fmoc-Asp (OBut)-0H> Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Gln (Trt)-OH、Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr (But)-OH> Fmoc-Glu (OBut)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Cys (t-Buthio) -OH、Fmoc-NH-PEG3-COOH, Fmoc-Cys (Trt) -OH。N 末端氨基酸作为乙酰 衍生物被保护。随后将肽从树脂上切下，并用RP-HPLC纯化，产生32. 7毫克白色固体。IMP457 的合成包括AD2序列的IMP 421 (SEQ ID NO :9，图15)是由标准的化学方法合成的。向溶 于 Iml 乙腈中的 15. 2 毫克(5. 26 μ mol) IMP421 (F. W. 2890. 50)和 274. 5 毫克(6. 86ymol) 的mPEG2-MAL-40K溶液加入7毫升IM Tris (pH 7. 8)，并允许在室温下反应3小时。用 49. 4毫克L-半胱氨酸猝灭过量的mPEG2-MAL-40K(图16)，随后用59. 1毫克的TCEP进行
171小时的S-S-tBu脱保护。反应混合物在2-8°C透析过夜，使用两个3-12毫升容量的IOK Slide-A-Lyzer透析盒(每个盒4毫升)透析至5L 5mM醋酸铵(pH 5. 0)。第二天进行5mM醋 酸铵(pH 5.0)的另外三次5L缓冲液的更换，每次透析至少持续272h。纯化产物(19.4ml) 转移到2个20ml的闪烁瓶，冷冻和低压干燥，得到246. 7mg的白色固体。MALDI-T0F给出了 mPEG2-MAL-40K 42，982 和 IMP-457 45，500 的结果。实施例2.基于干扰素(IFN) - α 2b的DDD模块的生成用于在哺乳动物细胞中表达的IFN- α 2b_DDD2-pdHL2的构建通过PCR扩增IFN- α 2b的cDNA序列，得到包括下列特征的序列，其中XbaI 和BamHI为限制性酶切位点，信号肽对于IFN-α 2b是原生的，6His是6组氨酸标签 XbaI-—信号肽-—IFN α 2b-—6Hi s-—BamHI。所得的分泌蛋白由IFN- α 2b构成，所述 IFN- α 2b在其C-末端与由SEQ ID NO 2构成的多肽融合。KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO 2)PCR 扩增使用全长人 IFNa 2b cDNA 克隆(Invitrogen Ultimate ORF 人类克隆 cat#H0RF01 Clone ID I0H35221)作为模板和以下寡核苷酸作为引物完成IFNA2 Xba I 左5，-TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG-3，(SEQ IDNO 3)IFNA2 BamHI 右5’ -GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3’ (SEQ ID NO 4)将PCR扩增物克隆到pGemT载体(Promega)。通过用XbaI和BamHI限制性内切酶 消化制备DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体以与IFN- α 2b连接。用XbaI和Bam HI从pGemT 切下IFN- α 2b扩增物并连接入DDD2-pdHL2载体中，以生成IFN- α 2b_DDD2-pdHL2表达载体。IFN- α 2b_DDD2的哺乳动物表达通过用SalI酶消化使得IFN-α 2b-DDD2_pdHL2线性化，并通过电穿孔将其稳定 转染入Sp/EEE骨髓瘤细胞(参见，例如，2006年7月14日提交的美国专利申请序列第 11/487，215号，其通过参考引入本文)。用ELISA法，2个克隆被发现具有IFN- α 2b的可 检测水平。该两个克隆之一(命名为95)适应于无血清培养基中生长而生产率没有明显的 下降。随后在5个星期里用0.1至0.8μΜ的逐渐增加的甲氨喋呤(MTX)浓度放大克隆。 在这个阶段，通过限制稀释对其进行亚克隆，并且产量最高的亚克隆(95-5)得到扩大。生 长在摇瓶里的95-5的生产率估计为2. 5毫克/升，使用商业获得的rIFN-α 2b (Chemicon IF007, Lot 06008039084)作为标准。转瓶中生长的批培养物中IFN- α 2b_DDD2的纯化用0. 8 μ M MTX将克隆95_5扩大到含有共20L的无血清杂交瘤SFM的34个转瓶， 并允许其达到末期培养。将上清液通过离心澄清，过滤(0.2 μ Μ)。滤液用IX结合缓冲液 (IOmM咪唑、0.5Μ NaCl、50mMNaH2P04 (pH 7.5))透滤，并浓缩到310mL制品以通过固定金属 亲和层析(IMAC)纯化。浓缩物装载于30-mLNi-NTA柱，用500毫升溶于IX结合缓冲液的 0. 02%吐温20清洗柱，然后用290毫升30mM咪唑、0. 02%吐温20、0. 5M氯化钠、50mM磷
18酸二氢钠(pH 7.5)清洗。用110毫升250mM咪唑、0. 02%吐温20、150mM氯化钠、50mM磷 酸二氢钠(pH 7. 5)洗脱产物。纯化出大约6毫克IFNa2b-DDD2。图4显示了用于定量 IFN α 2b-DDD2的抗-IFNa免疫印迹和ELISA的结果。IFN- a 2b_DDD2 的表征IFN-a 2b_DDD2的纯度通过还原条件下的SDS_PAGE(未显示)评估。考马斯亮 蓝染色凝胶表明，转瓶生产的批次比之前的批次(未显示)更纯。IFN-a2b-DDD2是染色 最重的条带，占总蛋白(未显示)的大约50%。产物分离为具有轧为 26kDa的双联体 (doublet)，这符合计算出的IFN- a 22b_DDD2_SP (26kDa)的MW。这里存在具有34kDa的Mr 的一个主要污染物和许多微弱的污染条带(未显示)。实施例3.通过DNL的聚乙二醇化IFN- α 2b的生成α 2b-362 (IFN-a2b-DDD2_IMP362)的制备和纯化图5为卡通图示，其显示了 α 2b-362的结构，α 2b_362具有与20kDa的聚乙二醇 偶联的两个拷贝的IFN α 2b。DNL反应通过将10倍摩尔过量的Ilmg还原的和冻干的IMP362 加入到溶于250mM咪唑、0. 02%吐温20、150mM氯化钠、ImM EDTA、50mM磷酸二氢钠(pH 7. 5) 的2. 25毫克(3. 5毫升)IFN- α 2b_DDD2进行。室温下于黑暗中6h之后，反应混合物于4°C 在黑暗中对CM加样缓冲液(150mM NaCl,20mM NaAc (pH 4. 5))透析。溶液装载在1毫升的 Hi-Trap CM-FF柱(Amersham)，该柱使用CM加样缓冲液预先平衡。样品装载之后，柱用CM 加样缓冲液清洗至基线，随后用15毫升0. 25M氯化钠、20mM醋酸钠(pH 4. 5)清洗。聚乙二 醇化的产物用12. 5毫升0. 5M氯化钠、20mM醋酸钠(pH 4. 5)洗脱。轭合过程通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE、荧光成像和抗-IFNa免疫印迹(未 显示)分析。为了将样品标准化以直接比较蛋白质质量，将从CM-FF柱洗脱的每一个成分浓 缩到3. 5毫升以匹配反应体积。在非还原条件下，考马斯亮蓝染色的凝胶显示出在反应混 合物中出现一个IlOkDa的虬的主要的条带，该条带在未结合或0. 25M氯化钠清洗的级部分 中没有出现，但在0. 5M氯化钠级分(未显示)中明显。用来检测IMP362的EDANS标签的 荧光成像表明含IlOkDa条带含有IMP362以及反应混合物和未结合级分中过量IMP362的 存在，其不被考马斯亮蓝染色(未显示)。抗-IFNa免疫印迹证实了 IFN-a 2b与IlOkDa 条带的缔合(未显示)。这些数据共同表明，DNL反应导致IMP362与IFN-a2b 二聚体的位 点特异性和共价轭合。在打破了二硫键的还原条件下，DNL结构的组分被分离(未显示)。 a 2b-362的计算MW是 75kDa，这与由MALDI TOF测定的76，728Da十分匹配。计算的质 量和SDS-PAGE评估的Mr之间观察到的偏差是由于PEG引起的，已知当通过SDS-PAGE或 SE-HPLC分析聚乙二醇化的产物时，PEG会夸大分子的大小。总的来说，DNL反应导致近似 定量的产量的均一产物，该产物经阳离子交换层析(未显示)纯化后达>90%纯。α 2b-457 (IFN- α 2b_DDD2_IMP457)的制备和纯化DNL反应通过将10倍摩尔过量的2. 5mg还原的和冻干的IMP457加入到溶于250mM 咪唑、0. 02%吐温20、150mM氯化钠、ImM EDTA、50mM磷酸二氢钠(pH 7. 5)的1毫克(1. 7毫 升)IFN- α 2b-DDD2中进行。室温经过60h之后，将ImM氧化型谷胱甘肽加入到反应混合物 中，其再放置2小时。混合物按1 20用CM加样缓冲液(150mM NaCl、20mM NaAc (pH 4.5)) 稀释，并用醋酸滴定到pH4. 5。溶液装载入1-mL Hi-Trap CM-FF柱(Amersham)，该柱使用 CM加样缓冲液预先平衡。样品装载之后，柱子用CM加样缓冲液清洗至基线，随后用15毫
19升0. 25M氯化钠、20mM醋酸钠(pH 4. 5)清洗。聚乙二醇化的产物用20毫升0. 5M氯化钠、 20mM醋酸钠(pH 4. 5)洗脱。将a2b_457浓缩到2ml，并对0. 4M的PBS (pH 7. 4)透滤，。最 后的产量为大约1毫克的大于90%纯度的a2b-457，如由SDS-PAGE和IFN α ELISA测定的。α 2b-413 (IFN- α 2b_DDD2_IMP413)的制备和纯化图6是显示α 2b-413结构的卡通图示，α 2b_413拥有与30kDa聚乙二醇偶联的 两个拷贝的IFNci 2b。α 2b_413的制备如紧接的上文描述的，只是用IMP413替代IMP362。实施例4. IFN- α 2b_DDD2、α 2b_362 和 α 2b_413 的体外效力评价体外抗增殖测定分析了 IFN-α 2b_DDD2和a 2b_362对伯基特淋巴瘤(Daudi)细胞的生长抑制。 简言之，IFN-a2b 标准品(Chemicon IF007, Lot 06008039084)、IFN-a 2b_DDD2 (批次 010207)和a 2b-362(批次010807)各自用补充10% FBS的RPMI1640培养基稀释至500pM， 在96孔组织培养板上从其制备三份三倍连续稀释(50 μ L样品/孔)。将Daudi细胞稀 释至4Χ IO5个细胞/mL，并且每个孔加入50 μ L(20K/孔)。每个测试试剂的浓度范围为 500ρΜ-0· 008ρΜ。在37°C经过4天后，将MTS染料加入板中(20 μ L/孔)，3小时后在490纳 米下用Envision平板读取仪(Perkin Elmer, Boston ΜΑ)读取板。生成剂量-响应曲线 (图 7)，并使用 Graph Pad Prism 软件(AdvancedGraphics Software，Encinitas，CA)通过 S形拟合非线性回归获得50%有效浓度(EC5tl)。IFNci 2b-DDD2和cc2b_362的计算EC5tl相 似( 16pM)，并且它们的效力比IFN- α 2b标准品(EC50 4pM)低约5倍。在一个类似实 验中，a2b_413与a2b_362有相似的效力。抗病毒测定由独立的分析实验室(PBL Interferon Source, Piscataway, NJ)使用脑心肌炎 (EMC)病毒在A549细胞上在病毒攻击测定中分析两份重复的样品。用结晶紫染色平板，并 在染料溶解后通过分光光度法在96孔板读取仪上测量OD值。使用Graph Pad Prism软件 使用S形拟合(可变斜率)非线性回归分析数据。通过与IFNa标准品EC5tl值的比较测 定抗病毒滴度。α 2b-362和α 2b_413的比抗病毒活性分别计算为1. 2 X IO8单位/毫克和 8. 8X IO6单位/毫克。实施例5. α 2b-413和α 2b_362的体内评价药代动力学研究在成年雌性Swiss-Webster小鼠( 35克)中进行。有4个不同的治疗组， 每组2只小鼠。每个试剂(测试和对照)以等摩尔量蛋白剂量(3 μ g rhuIFN- α 2a、5 μ g PEGINTR0N U1 μ g α 2b_362和13μ g α 2b_413)作为单一丸剂i. v.注射施用。在不同 时间点(给药前，注射后5分钟、2-、8-、24-、48-、72-、96_和168h)经由后眼眶法对对小鼠 进行取血。让血液凝固，离心，分离血清，并储存在_70°C直至分析IFN-α浓度和随后的PK 分析。用人干扰素-α ELISA试剂盒，按照制造商的说明(PBL InterferonSource)测定 血清样品中的IFN-α浓度。简单来说，根据试剂盒中提供的人IFN-α标准，适当稀释血清 样品。与微量滴定板孔偶联的抗体捕获干扰素。随后用二抗来显示结合的干扰素，二抗通 过轭合辣根过氧化物酶(HRP)的抗-二抗抗体在添加四甲基联苯胺(TMB)底物后定量。在 450nm读取平板，结果显示在图8中。
每个试剂的PK特性列于表1。如所预期的，rhIFN- α 2a具有从注射的小鼠的血液 中最快的清除速率。其清除速率比PEGINTR0N 的快大约3倍，比DNL-IFN试剂的快超过13 倍。PEGINTR0N 清除又比 α 2b_362 或 α 2b_413 快超过 4 倍。α 2b_362 和 α 2b_413 的清 除速率之间只有很小的差别。关于平均滞留时间(MRT)，存在与各种试剂的大小的明显相关性。19-kDa rhIFN- α 2a 的 MRT 比 3IkDa PEGINTR0N (分别为 0. 7h 对 5. Ih)少 7 倍，3IkDa PEGINTR0N 在与 70kDa α 2b_362(10. 3h)相比时具有低 2 倍的 MRT。80kDa α 2b_413(21. 7h)的 MRT 比a2b_362长2倍。最后，生物等效性测试表明，所述测试试剂没有一个在PK的方面是 相同的，显示出了真正的差异(即循环半衰期为a2b_413> a 2b_362 > PEGINTR0N > rhIFN-a 2a)。
权利要求
一种聚乙二醇化的复合物，该复合物包括a)效应部分连接到DDD(二聚化和对接结构域)序列的效应部分；和b)连接到AD(锚结构域)序列的PEG部分；其中，2个DDD序列与1个AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，该复合物还包括DDD和AD序列之间的二硫键。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中所述DDD序列包括PKARIIa的44个N-末端氨 基酸。
4.根据权利要求1所述的复合物，其中所述DDD序列包括SEQIDNO :2。
5.根据权利要求1所述的复合物，其中所述PEG部分在一端具有甲氧基加帽。
6.根据权利要求1所述的复合物，其中所述效应部分选自酶、细胞因子、趋化因子、生 长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和抗体片段组成的组。
7.根据权利要求6所述的复合物，其中所述效应部分选自干扰素-α、干扰素-β干 扰素-Y、MIF、HMGB-1(高迁移率族蛋白 1)、TNF-α、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IUIL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、 IL-24、CCL19、CCL21、MCP-I、RANTES、MIP-1A、ΜΙΡ-1Β、ΕΝΑ-78、MCP-I、IP-lO.Gro-β、嗜酸 性粒细胞活化趋化因子、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配基、促红细胞生成素、血小 板生成素、hGH、CNTF、瘦素、制瘤素M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、 IGF、促生长素抑制素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂和LIF组成的组。
8.根据权利要求1所述的复合物，其中所述连接到AD序列的PEG部分包括IMP350、 IMP360、IMP362、IMP413 或 IMP457。
9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述效应部分为干扰素(IFN)-Ci2b、G-CSF或 促红细胞生成素。
10.根据权利要求1所述的复合物，其中所述连接到DDD序列的效应部分为融合蛋白。
11.根据权利要求1所述的复合物，其中每个复合物包括一个PEG部分和两个效应部分。
12.根据权利要求1所述的复合物，其中所述聚乙二醇化复合物从血清中的清除速率 比未聚乙二醇化效应部分的清除速率慢至少一个数量级。
13.—种聚乙二醇化的复合物，该复合物包括a)效应部分连接到AD序列的效应部分；和b)连接到DDD序列的PEG部分；其中两个DDD序列与一个AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物。
14.根据权利要求13所述的复合物，其中每个复合物包括两个PEG部分和一个效应部分。
15.根据权利要求13所述的复合物，其中所述聚乙二醇化复合物从血清中的清除速率 比未聚乙二醇化效应部分的清除速率慢至少一个数量级。
16.一种使效应部分聚乙二醇化的方法，该方法包括a)将效应部分连接到DDD序列；b)将PEG部分连接到AD序列；和c)允许所述DDD序列与所述AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物，该复合物包括两个效应部分-DDD序列和一个PEG-AD序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述效应部分选自选自酶、细胞因子、趋化因 子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和抗体片段组成的组。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述聚乙二醇化复合物从血清中的清除速率比 未聚乙二醇化效应部分的清除速率慢至少一个数量级。
19.一种使效应部分聚乙二醇化的方法，包括a)将效应部分连接到AD序列；b)将PEG部分连接到DDD序列；和c)允许所述DDD序列与所述AD序列结合以形成聚乙二醇化复合物，该复合物包括2个 效应部分-DDD序列和1个PEG-AD序列。
20.一种用于治疗疾病的方法，该方法包括a)获取根据权利要求1所述的聚乙二醇化复合物，其中所述效应部分为所述疾病的治 疗剂；和b)将所述聚乙二醇化复合物给药于患有所述疾病的受试者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述效应部分选自MIF、HMGB-1(高迁移率族蛋 白 1)、TNF- α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、MCP-U RANTES, MIP-lA、MIP-lB、ENA-78、MCP-l、IP-lO、Gro-0、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、干扰素-α、干 扰素- β、干扰素-Y、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配基、促红细胞生成素、血小板 生成素，hGH、CNTF、瘦素、制瘤素Μ、VEGF, EGF、FGF、P1GF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、 IGF、促生长素抑制素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂，和LIF组成的组。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病为癌症、增生、糖尿病、自身免疫性 疾病、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关 节炎、结节病、哮喘、水肿、肺部高血压、牛皮癣、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、 Osler-Webber综合征、心肌血管新生、斑块新生血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、 毛细血管扩张症、血友病患者关节、血管纤维瘤、与慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深静 脉血栓形成或创面肉芽发生。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述自体免疫性疾病是急性特发性血小板 减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西德纳姆舞蹈症、重症肌无力、系 统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、 Henoch-Schonlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu氏动脉炎、Addison病、 类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多 动脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture综合征、血栓闭塞性脉管炎、Sjogren氏综合征、原发 性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌 炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨 细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症选自急性淋巴母细胞性白血病、急性 髓性白血病、胆管癌、乳腺癌、骨癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结 肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺 癌和尿膀胱癌组成的组。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述聚乙二醇化复合物仅具有一个连接到每个 聚乙二醇化复合物的PEG部分。
全文摘要
本发明涉及形成确定化学计量和结构的聚乙二醇化复合物的方法和组合物。在优选实施方式中，聚乙二醇化复合物利用对接和锁定(dock andlock)技术形成，该技术通过使效应部分与DDD序列连接，使PEG部分与AD序列连接，并允许DDD序列以2∶1的化学计量与AD序列结合，以形成具有两个效应部分和一个PEG部分的聚乙二醇化复合物。在可替代实施方式中，效应部分可以连接到AD序列，而PEG可以连接到DDD序列，以形成具有两个PEG部分和一个效应部分的聚乙二醇化复合物。在更优选的实施方式中，效应部分可以包括具有生理学或治疗活性的任何肽或蛋白质。聚乙二醇化复合物在注入受试者时表现出明显更慢的清除速率，并可用于多种疾病的治疗。
文档编号C07K14/00GK101951939SQ200880113336
公开日2011年1月19日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月26日
发明者C-H·张, D·高德伯格, E·罗希, W·麦克布莱德 申请人:Ibc药品公司