一种具有pH响应的长循环铁离子螯合剂的制作方法

本发明属于化学改性的缩聚物领域，具体涉及一种具有ph响应的去铁胺接枝聚乙二醇，还涉及其作为铁离子螯合剂的应用。

背景技术：

铁离子过载与许多临床疾病有关，比如地中海贫血，中风，阿茨海默、帕金森病等神经退变性疾病。

去铁胺是临床上通用的一种铁离子螯合剂，对铁离子过载相关的疾病具有治疗作用。但是其具有明显的缺陷：1、血液中的去铁胺会被体内的酶快速降解，其体内半衰期不足30分钟，导致药效不佳，需要加大用药剂量或者延长用药时间；2、具有毒性，会引起许多不良反应，如，低血压和心动过速(参见俞天骥，去铁胺——老药新毒性，国外医学：药学分册，1991.p249,)，特别是在高剂量的时候，其不良反应特别明显。为了兼顾药效和安全，目前通常的治疗方式低剂量长时间的静脉注射，以维持体内浓度以达到一定效果，但是该种治疗方法十分不便，患者依从性差。

因此，急需对去铁铵进行改进，提高其半衰期，降低其毒性。

技术实现要素：

本专利针对去铁胺在治疗铁过载相关疾病中存在的半衰期短和药物载体修饰可能产生的积累毒性等问题，本发明提供了一种具有ph响应的长循环铁离子螯合剂。

一种化合物，它是由聚乙二醇与去铁胺通过ph敏感的化学键链接后组成。

上述化合物具有下述式(ⅰ)所示的结构：

其中，rn表示聚乙二醇链，dfo表示去铁胺基，结构如下：

上述化合物中，所述的聚乙二醇为聚乙二醇单甲醚，分子质量为1kda～20kda。

上述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)聚乙二醇单甲醚与对醛基苯甲酸在催化剂作用下通过酯化反应得到中间产物；

(2)将上述中间产物与去铁胺通过西佛碱反应制备得到具有ph响应的长循环铁离子螯合剂。

进一步地，所述步骤(1)的酯化反应温度为-5～5℃。

进一步地，所述步骤(1)的酯化反应时间为40～72h。

进一步地，所述步骤(1)的酯化反应时间为48h。

进一步地，所述步骤(1)中，对醛基苯甲酸与聚乙二醇单甲醚的质量比为0.08～0.4:1；4-二甲氨基吡啶(dmap)与聚乙二醇单甲醚的质量比为0.05～0.3:1；n,n'-二环己基碳酰(dcc)与聚乙二醇单甲醚的质量比为0.25～1.3:1。

进一步地，所述步骤(1)的溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺。

进一步地，所述步骤(1)的溶剂为二氯甲烷。

进一步地，所述步骤(2)的溶剂选自甲醇、二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺。

进一步地，所述步骤(2)的溶剂为甲醇。

进一步地，所述步骤(2)中三乙胺与中间产物的体积质量比为1～5.2ml：1g。

进一步地，所述步骤(2)中所述去铁胺为甲磺酸去铁胺。

进一步地，所述步骤(2)中甲磺酸去铁胺与中间产物的质量比为1.2～6：1。

进一步地，所述步骤(2)中反应温度为60℃，反应时间为12h。

上述化合物作为铁离子螯合剂的应用。

与去铁铵相比，本发明铁离子螯合剂的半衰期显著延长、毒性大大降低，而且其螯合铁离子的能力没有变化，因此，将其注入体内，药效会明显提高，同时毒性大大减小，安全性明显提升，临床应用前景优良。本发明公开的铁离子螯合剂与去铁胺相比还具有长效和病灶部位酸性微环境响应的特点。

附图说明

图1为铁离子螯合剂的合成示意图。

图2为实施例1产品的核磁谱图。

图3为实施例1和2的铁离子螯合能力图

图4为去铁胺和螯合剂的半衰期。

图5为实施例3中得到的产品在ph＝6.0条件下酸性响应后产物的核磁谱图。

图6为实施例2和3得到的产品与去铁胺的细胞毒性mtt实验结果。

具体实施方式

所用原料和试剂均来自于市售的商品。

聚乙二醇单甲醚、去铁胺、n,n'-二环己基碳酰亚胺(dcc)、4-二甲氨基吡啶(dmap)均购于sigma，对醛基苯甲酸购于成都科龙试剂公司。

本发明铁离子螯合剂的合成步骤如图1所示。

实施例1

1克聚乙二醇单甲醚(分子量1kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.4g对醛基苯甲酸，0.3gdmap和1.3gdcc，在5℃下反应36小时后，经硅胶柱提纯，得到中间产物mpeg1k-ph-cho。

称取0.5g中间产物mpeg1k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入3g甲磺酸去铁胺和2.6毫升三乙胺，在60℃下反应12小时后，经硅胶柱提纯，得到最终产物mpeg1k-ph-dfo。

核磁氢谱：40mg样品溶于1mld2o中，25℃检测，检测结果如图2所示。

特征峰归属为：8.2和8.07ppm为苯环中的h；8.1ppm为ch＝n键中的h；3.6和3.3ppm分别对应聚乙二醇单甲醚中甲氧基和亚甲基中的氢；3.5ppm对应去铁胺分子中的h-5,h-12和h-19；3.1ppm对应去铁胺分子中的h-1,h-8和h-15；2.8ppm对应去铁胺分子中的h-6和h-13，2.4ppm对应去铁胺分子中的h-14和h-7；2.0ppm对应–ch3；1.5ppm对应去铁胺分子中的h-2,h-4，h-11和h-18；1.4ppm对应去铁胺分子中的h-9和h-16；1.2ppm对应去铁胺分子中的h-3,h-10和h-17。

以上核磁氢谱结果证明了合成产物的化学结构。

实施例2

1克聚乙二醇单甲醚(分子量2kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.2g对醛基苯甲酸，0.15gdmap和0.63gdcc，在-5℃下反应72小时后，经硅胶柱提纯，得到中间产物mpeg2k-ph-cho。

称取0.5g中间产物mpeg2k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入1.5g甲磺酸去铁胺和1.3毫升三乙胺，在60℃下反应12小时后，经硅胶柱提纯，得到最终产物mpeg2k-ph-dfo。

实施例3

1克聚乙二醇单甲醚(分子量5kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.08g对醛基苯甲酸，0.06gdmap和0.25gdcc，在冰浴下反应40小时后，经硅胶柱提纯，得到中间产物mpeg5k-ph-cho。

称取0.5g中间产物mpeg5k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入0.6g甲磺酸去铁胺和0.5毫升三乙胺，在60℃下反应12小时后，经硅胶柱提纯，得到最终产物mpeg5k-ph-dfo。

实施例4

1克聚乙二醇单甲醚(分子量10kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.08g对醛基苯甲酸，0.06gdmap和0.25gdcc，在冰浴下反应48小时后，经硅胶柱提纯，得到中间产物mpeg10k-ph-cho。

称取0.5g中间产物mpeg10k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入0.6g甲磺酸去铁胺和0.5毫升三乙胺，在60℃下反应12小时后，经硅胶柱提纯，得到最终产物mpeg10k-ph-dfo。

实施例5

1克聚乙二醇单甲醚(分子量20kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.08g对醛基苯甲酸，0.06gdmap和0.25gdcc，在冰浴下反应72小时后，经硅胶柱提纯，得到中间产物mpeg20k-ph-cho。

称取0.5g中间产物mpeg20k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入0.6g甲磺酸去铁胺和0.5毫升三乙胺，在60℃下反应12小时后，经硅胶柱提纯，得到最终产物mpeg20k-ph-dfo。

下面通过试验说明本发明的有益效果。

本发明作为铁离子螯合剂的应用

(1)铁离子螯合能力检测

铁离子螯合能力采用紫外吸收光谱法检测(tian,etal.,carbohydratepolymers,2016,144,522-530)。如图3所示，去铁胺螯合铁离子的特征吸收峰在429nm。实施例1和例2的产品螯合铁离子后的吸收峰也在429nm，并根据去铁胺浓度-吸光度标准曲线计算实施例1和例2产品中的去铁胺含量，结果表明与其分子结构式中的理论含量是一致的。上述结果表明，实施例1和实施例2制备的螯合剂与相同摩尔浓度的去铁胺螯合铁离子的能力相同，去铁胺接枝上聚乙二醇并不影响其对铁离子的螯合能力。

(2)半衰期检测

半衰期采用代谢实验检测(meyer-brunot&keberle，biochem.pharmaco.l,1967,16,527-535)。步骤为：样品采用实施例1-5中得到的产品，分别为mpeg1k-ph-dfo，mpeg2k-ph-dfo，mpeg5k-ph-dfo，mpeg10k-ph-dfo和mpeg20k-ph-dfo。样品和去铁胺对照(dfo)分别溶于10毫升krb缓冲液后加入2毫升新鲜血浆，然后在37℃，95％氧气和5％二氧化碳气氛中震荡，每隔一定时间吸出1毫升反应液，经处理后采用紫外-可见光谱在429nm检测吸光度。对应标准曲线计算出孵化不同时候后孵化液中的有效去铁胺浓度。然后将时间和对应浓度作图，曲线经拟合后计算半衰期。

根据图4所示，去铁胺的半衰期为0.8小时，而螯合剂的半衰期分别为16.3，18.4,28.2,36.9和42.9小时。本发明制备的螯合剂大幅度延长了去铁胺的半衰期。

(3)螯合剂的ph响应性

样品为实施例3中得到的产品，40mg样品溶于1mlpbs溶液中，调节溶液ph至6.0摇床震荡24h后冷冻干燥，产品溶于1mldmso-d6中，25℃检测核磁氢谱，如图5。

特征峰归属为：10.1ppm处出现了对醛基苯甲酸中的cho中的h的吸收峰，表明在酸性条件下产物分子中的ch＝n键发生了断裂，生成了-cho。该结果表明产物具有ph响应性。

(4)细胞毒性

采用mtt法检测细胞毒性。样品采用实施例2和3中得到的产品，分别为mpeg2k-ph-dfo和mpeg5k-ph-dfo。各样品分别溶于磷酸缓冲液pbs中配制成含10mm等效dfo浓度的溶液，用于细胞试验时，再用培养基稀释成含0.5、0.2、0.1、0.05、0.01和0.005mm等效dfo浓度的溶液。对照组采用等体积的pbs加入培养基。人脐静脉内皮细胞按3×10³的密度种于96孔板，24小时后吸弃培养基，加入上述含不同浓度的螯合剂培养基，继续培养48小时，然后采用mtt法检测人脐静脉内皮细胞毒性(tian,etal.,carbohydratepolymers,2010,79,137-144)。

细胞活率mtt测试结果依次如图6所示。

去铁胺具有剂量依赖性的细胞毒性，从图中看出当dfo的浓度高于0.05mm时培养48小时后细胞活率低于60％。相对比，产品2和3的各实验组的等效dfo浓度在0.5mm下均表现出大于80％的细胞活率。

以上结果表明：螯合剂的细胞毒性明显小于对照组去铁胺的细胞毒性，

本发明公开的具有ph响应的铁离子螯合剂，具有长效低毒的作用。具体的，本发明通过去铁胺与乙二醇链接，克服了去铁胺在体内半衰期短的问题，同时，等效去铁胺浓度的铁离子螯合剂细胞毒性比去铁胺的细胞毒性小，降低了去铁胺的毒副作用，明显优于单独的去铁胺。本发明公开的铁离子螯合剂与去铁胺相比还具有长效和病灶部位酸性微环境响应的特点。