超敏反应调节剂的制作方法

专利名称：：超敏反应调节剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肥大细胞活化调节剂，特别是它们在治疗和预防超敏疾病和病症中的用途。更具体地，本发明涉及能够抑制和/或防止肥大细胞活化的蛋白和肽。背景在过去几十年，工业化世界中与超敏反应相关病症的普遍性有显著增加。特别地，最常见类型的超敏反应相关病症，IgE介导的超敏反应，已经在发展中国家影响到超过25%的人群。超敏反应为免疫反应不适当地起作用的结果，可由很多抗原引起。它们由几种细胞类型释放的炎性介质的组合产生。当IgE反应针对无害的环境抗原如花粉或尘螨时，发生一种形式的超敏反应。作为结果而发生的IgE致敏肥大细胞释放药理学介质产生了急性炎性反应，其具有诸如哮喘或鼻炎的症状。气管炎症为哮喘发病机理的核心，包括募集并活化肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞进入肺组织和支气管肺泡空间。肥大细胞被认为是超敏反应中的关键效应子之一。这些细胞遍布整个身体，紧邻血管、神经、黏膜表面和皮肤。在这些部位，它们处于检测抗原并通过它们释放几种炎性介质的能力而引起最早期变应性反应的良好位置。肥大细胞为身体内仅有的表达特异于IgE的受体的细胞之一，IgE为负责出现变应性反应和哮喘的免疫球蛋白。肥大细胞可通过多种刺激物活化，但是，最明确的是经由抗原与结合至细胞表面其高亲和性受体(FeεRI)的IgE的相互作用。由FcεRIα结合的IgE进行的抗原检测导致受体交联以及随后该相同受体的β和Y亚基的ITAM基序中酪氨酸残基的磷酸化。接下来，FcεRI受体的聚集诱导了复杂的细胞内途径的活化，这涉及到多种细胞相互作用，其最后导致释放预形成的颗粒和分泌类花生酸、细胞因子和趋化因子。肥大细胞活化导致引起全身和/或局部作用的一系列生物化学事件，它们通常在变应性和过敏反应中被观察到。当前的用于治疗超敏反应相关病症的方法主要包括糖皮质激素类和其它症状缓解药物的组合。不同于直接靶向肥大细胞，这些治疗旨在干扰下游炎性介质的作用。诸如肾上腺皮质激素的抗炎药物以非选择性方式影响到多种细胞功能。因此，长期的类固醇治疗导致的并发症限制了其临床使用。亟需新的治疗手段来治疗超敏反应相关疾病和病症。特别地，需要新的靶向肥大细胞的治疗手段，以便调节与变应性反应相关的炎性介质的释放。发明概述本文描述了之前未知的参与肥大细胞活化和超敏反应发作的基因。这些基因编码的蛋白包含Pleckstrin同源(PH)、Src同源2(SH2)或Src同源3(SH3)结构域中的至少一个。这些结构域被认为通过与存在于肥大细胞表面的受体的特异相互作用来调节肥大细胞活化。因此本发明的某些方面和实施方案涉及通过给予含SH2/SH3/PH结构域蛋白来调节肥大细胞活化。本文还描述了能够调节肥大细胞活化的对应SH3和/或PH结构域序列的肽。本文描述的肽提供了治疗和预防超敏疾病和病症的手段。在第一方面，本发明提供了调节肥大细胞活化的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。在第一方面的一实施方案中，所述肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸。在第一方面的另一实施方案中，所述肽包含SEQIDNO:8或SEQIDNOs14-273中任一所示的氨基酸。在第一方面的另一实施方案中，所述肽包含SEQIDN0:11或SEQIDN0:12所示的氨基酸。在第一方面的一实施方案中，所述肽包含SEQIDN0:10或SEQIDNOs274-488中任一所示的氨基酸。在第一方面的另一实施方案中，所述调节抑制肥大细胞活化。在第二方面，本发明提供了抑制或预防个体中肥大细胞活化的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的蛋白，所述蛋白包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽。在第二方面的一实施方案中，所述肥大细胞活化为IgE介导的。在第二方面的另一实施方案中，所述肥大细胞活化为非IgE介导的。在第三方面，本发明提供了治疗或预防个体中超敏疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的蛋白，所述蛋白包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽。在第三方面的一实施方案中，所述超敏疾病或病症包括肥大细胞活化。在第三方面的另一实施方案中，所述超敏疾病或病症包括炎性反应。在第三方面的另一实施方案中，所述超敏疾病或病症可以为过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及呼吸疾病和病症。该呼吸疾病或病症可以为哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。在第四方面，本发明提供了调节个体中免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的蛋白，所述蛋白包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽。在第四方面的一实施方案中，所述蛋白为NEDD9。在第四方面的一实施方案中，所述蛋白为PHLDA1。在第五方面，本发明提供了抑制或预防个体中肥大细胞活化的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。在第六方面，本发明提供了治疗或预防个体中超敏疾病或病症的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。在第六方面的一实施方案中，所述超敏疾病或病症包括肥大细胞活化。在第六方面的另一实施方案中，所述超敏疾病或病症包括炎性反应。在第六方面的其它实施方案中，所述超敏疾病或病症选自过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及呼吸疾病和病症。该呼吸疾病或病症可以为哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。在第七方面，本发明提供了调节个体中免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。在第五、第六和第七方面的一实施方案中，所述肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列或变体。在第五、第六和第七方面的其它实施方案中，所述肽包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或变体。在第五、第六和第七方面的另一实施方案中，所述肽包含SEQIDNO11所示的氨基酸序列。在第五、第六和第七方面的又一实施方案中，所述肽包含SEQIDN0:12所示的氨基酸序列或变体。在第八方面，本发明提供了抑制肥大细胞活化的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)结构域之一或二者结合至肥大细胞受体。在第九方面，本发明提供了治疗或预防个体中超敏疾病或病症的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)结构域之一或二者结合至肥大细胞受体。在第八和第九方面的一实施方案中，所述抑制包括给予包含对应NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域或PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列的肽。该肽可以包含SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。该肽可以包含选自SEQIDNO10、SEQIDNO:11禾口SEQIDNO12的氨基酸。在第十方面，本发明提供了包含(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽中至少之一的蛋白在制备用于治疗超敏疾病或病症的药物中的用途。在第十方面的一实施方案中，所述蛋白为NEDD9。在第十方面的另一实施方案中，所述蛋白为PHLDA1。在第十一方面，本发明提供了包含对应(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列的肽在制备治疗超敏疾病或病症的药物中的用途。在第^^一方面的一实施方案中，所述肽包含选自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO11禾口SEQIDNO12的氨基酸序列。在第十和第i^一方面的一实施方案中，所述超敏疾病或病症选自过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及呼吸疾病和病症。所述呼吸疾病或病症可以为哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。在第十二方面，本发明提供了用于治疗超敏疾病或病症的蛋白，其包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽在第十三方面，本发明提供了用于治疗超敏疾病或病症的肽，其包含对应于以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。在第十四方面，本发明提供了鉴定调节包含Src同源2(SH2)结构域、Src同源3(SH3)结构域或pleckstrin同源(PH)结构域至少之一的蛋白的活性的试剂的方法，所述方法包括(a)让候选试剂与所述蛋白在适合于允许所述候选试剂与所述蛋白相互作用的条件下接触；以及(b)测定所述蛋白的活性。在第十五方面，本发明提供了筛选多种候选试剂以鉴定调节包含Src同源2(SH2)结构域、Src同源3(SH3)结构域或pleckstrin同源(PH)结构域至少之一的蛋白的活性的试剂的方法，所述方法包括(a)让多种候选试剂与所述蛋白在适合于允许所述候选试剂与所述蛋白相互作用的条件下接触；以及(b)测定所述蛋白的活性。在第十四和第十五方面的一实施方案中，所述蛋白为NEDD9或PHLDA1。在第十四和第十五方面的另一实施方案中，测定所述蛋白的活性包括测量肥大细胞活化的水平。在第十四和第十五方面的其它实施方案中，所述候选试剂为所述蛋白的激动剂。在第十四和第十五方面的其它实施方案中，所述候选试剂为所述蛋白的激动剂。缩写B匪C骨髓来源肥大细胞DEAE葡聚糖二乙基氨基乙基葡聚糖DNA脱氧核糖核酸DNP-IgE抗二硝基酚免疫球蛋白EdsRNA双链RNAFc恒定片段FcεRIFcε受体I，高亲和性IgE受体FcεRIα高亲和性IgE受体的α亚基FcγRFcγ受体Fyn酪氨酸蛋白激酶FynIgE免疫球蛋白EIgG免疫球蛋白GIL-10白介素10ITAM基于免疫受体酪氨酸的活化基序kg千克LAMP-I脂质体相关膜蛋白-ILAMP-2脂质体相关膜蛋白-1Lck淋巴细胞特异的蛋白酪氨酸激酶Lyn蛋白酪氨酸激酶Lynm米mg毫克mRNA信使核糖核酸NEDD9神经前体细胞表达的发育下调基因9PHpleckstrin同源PHLDAlpleckstrin同源样结构域家族A成员1PHRIP富含脯氨酸和组氨酸蛋白RBL-2H3细胞大鼠嗜碱性粒细胞性白血病2H3细胞RNA核糖核酸SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SH2Src同源2结构域SH3Src同源3结构域siRNA小抑制RNATDAG51T细胞死亡相关基因51定义下文为一些定义，它们可能对于理解本发明的描述有帮助。它们旨在作为一般性定义，不应将本发明的范围仅限制于这些术语，它们是为了更好地理解以下描述而提供。除上下文另有要求或明确指出相反含义，本文中作为单数整数、步骤或元件陈述的整数、步骤或元件显然包括所陈述的整数、步骤或元件的单数和复数形式。在整个本说明书中，除非上下文另有要求，措辞“包括(comprise)”或诸如“comprises”和“comprising”的变型应理解为暗指包含所述步骤或元件或整数或成组的步骤或元件或整数，但是不排除任何其它步骤或元件或整数或成组的元件或整数。因而，在说明书上下文中，措辞“包括(comprising)”指“主要包括，但不必仅包括”。用在本文时，“试剂”在其范围内包括任何天然或制造的元素或化合物。因此，该术语包括但不限于任何化学元素和化合物、核酸、氨基酸、多肽、蛋白、抗体和抗体片段，以及其它的可能在本发明上下文中合适的物质。用在本文时，术语“调节(modulating)”、“调节(modulates)”及其变型指，在本发明的特定调节分子或试剂存在下，分子的活性、产生、分泌或功能水平与该调节分子或试剂不存在下的其活性、产生、分泌或其它功能水平相比增加或降低。这些术语不隐含对增加或降低的量化。调节可以是任何足以产生期望结果的数量，并且可以是直接的或间接的。用在本文时，术语“免疫调节剂”指一种或多种细胞类型分泌的且在免疫反应的活化、维持、成熟、抑制、遏制或增强中起作用的分子介质。用在本文时，术语“含SH2/SH3/PH结构域蛋白”指含有以下一种或多种结构域的蛋白(a)至少一个Src同源2(SH2)结构域，(b)至少一个Src同源3(SH3)结构域，(c)至少一个pleckstrin同源3(PH)结构域。因此，含SH2/SH3/PH结构域蛋白包括这样的蛋白，其仅具有一个或多个SH2结构域，仅具有一个或多个SH3结构域，仅具有一个或多个PH结构域，具有一个或多个SH2结构域和一个或多个SH3结构域，具有一个或多个SH3结构域和一个或多个PH结构域，或具有一个或多个SH2和一个或多个SH3结构域以及一个或多个PH结构域。用在本文时，术语“肥大细胞活化途径”在其范围内包括导致肥大细胞活化的发生在肥大细胞内或表面上的生物学过程中的所有组分和步骤。一般地，肥大细胞的活化可以从外部刺激物开始，导致细胞内信号级联，其涉及一系列的细胞蛋白，例如磷酸酶、激酶以及接头/调节因子，其引起肥大细胞活化。用在本文时，术语“给予(administering)，，以及该术语的包括“administer”和“administration”在内的变型包括通过任何适当的手段让本发明的化合物或组合物与有机体接触、或将其涂、输送或提供至有机体。用在本文时，术语“抗体”包括IgG(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgAl和IgA2)、IgD、IgE、或IgM、以及IgY，完整抗体，包括单链完整抗体，及其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的FvS(SdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗体可以为任何动物来源的。包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段可以仅包含可变区或连同完整或部分的以下成分铰链区、CHI、CH2和CH3结构域。还包括可变区和铰链区、CHUCH2和CH3结构域的任何组合。抗体可以是单克隆的、多克隆的、嵌合的、多特异性的、人源化的、以及人单克隆和多克隆抗体，其特异结合生物学分子。用在本文时，术语“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有说明，还包括以类似于天然存在核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。用在本文时，术语“多肽”或“肽”指通过肽键连接在一起的由氨基酸构成的聚合物。术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，尽管出于本发明的目的，“多肽”可以构成全长蛋白的一部分。用在本文时，术语“多核苷酸”指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸碱基或已知类似物或天然核苷酸或其混合物的单或双链聚合物。用在本文时，遍及说明书使用的术语“突变”旨在包括任何和所有类型的功能性和/或非功能性核酸变化，包括与存在于样品中的相同核酸区域或等位基因或更常见的核酸分子相比时，靶核酸分子中的突变和多态性。这类变化包括但不限于一个或多个核苷酸的删除、插入、易位、倒位和碱基取代。用在本文时，术语“多态性”指群体内基因组中基因的序列内的变异，例如等位基因变异和其它出现的或观察到的变异。遗传多态性指可作为核苷酸碱基对差异、可变mRNA剪接或翻译后修饰包括例如糖基化结果的基因序列变异形式。因此，多态性指群体内出现两个或更多个遗传上确定的可选序列或等位基因。这些差异可出现在基因组的编码和非编码部分，并且可作为差异而显露或检测到，所述差异在于核酸序列、基因表达，例如包括转录、加工、翻译、输送、蛋白加工、运输、DNA合成、表达的蛋白、其它基因产物或生化途径的产物或翻译后修饰以及任何其它显露的差异。用在本文时，术语“治疗”指任何以及所有的应用，其补救疾病状态或症状，或以任何其它方式预防、阻止、延缓或逆转疾病进展或其它不希望的症状。用在本文时，术语“个体”包括人和社会、经济或研究上重要的任何哺乳动物物种的个体，包括但不限于以下属绵羊、牛、马、猪、猫、犬、灵长类和啮齿类的成员。在一实施方案中，该哺乳动物为人。用在本文时，术语“有效量”和“治疗有效量”在其含义内包括无毒性但足够提供期望治疗效果的量的药物或化合物。所需的确切量随个体不同而变化，这取决于一些因素，例如所治疗的物种、个体的年龄和总体状况、所治疗状况的严重性、所给予的具体药物和给药模式等。因此，不可能指出确切的“有效量”。但是，对于任何给定病例，本领域普通技术人员可以仅采用任何常规实验来确定适当的“有效量”。本领域技术人员会意识到，本文描述的发明可能有不同于所具体描述内容的变型和改动。应理解本发明包括所有的这类变型和改动。本发明还包括本说明书中个别或共同提及的或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何和所有组合的或任意两种或更多种的所述步骤或特征。包括在本说明书中的任何对文献、决议、原料、设备、制品等的讨论仅出于为本发明提供背景的目的。不应认为是承认任何或所有的这些材料形成了现有技术基础的一部分或者为本发明相关领域中在本申请优先权日之前所共知的一般知识。出于描述目的，将本文中提及的所有文献通过引用并入。附图简要说明图IA显示人肥大细胞应答IgE刺激的NEDD9相对基因表达时间进程。图IB显示人肥大细胞应答IgE刺激的PHLDAl相对基因表达时间进程。图IC显示小鼠肥大细胞应答IgE刺激的NEDD9相对基因表达时间进程。图ID显示小鼠肥大细胞应答IgE刺激的PHLDAl相对基因表达时间进程。图2A显示RBL-2H3细胞应答IgE刺激的相对NEDD9mRNA表达。结果表示为相对于未处理样品值的相对倍数变化。图2B显示RBL-2H3细胞应答离子霉素(ionomycin)刺激的相对NEDD9mRNA表达。结果表示为相对于未处理样品值的相对倍数变化。图2C显示RBL-2H3细胞应答IgE刺激的相对PHLDAlmRNA表达。结果表示为相对于未处理样品值的相对倍数变化。图2D显示RBL-2H3细胞应答离子霉素刺激的相对PHLDAlmRNA表达。结果表示为相对于未处理样品值的相对倍数变化。图3显示在3种不同的靶向NEDD9基因表达的siRNAs存在下，与IgE孵育30分钟的RBL-2H3细胞中肥大细胞脱粒百分比。不靶向任何基因的另外siRNA用作对照。图4A显示与阴性siRNA/DNP-IgE对照相比，给予针对NEDD9的siRNA与DNP-IgE的组合后，在Lewis大鼠中通过Evan蓝恢复测量的肥大细胞脱粒程度。图4B显示与阴性siRNA/DNP-IgE对照相比，给予针对PHLDAl的siRNA与DNP-IgE的组合后，在Lewis大鼠中通过Evan蓝恢复测量的肥大细胞脱粒程度。图5显示智人(Homosapiens)(HS)、小家鼠(Musmusculus)(MM)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)(RN)、黑猩猩(Pantroglodytes)(PT)、欧洲牛(Bostaurus)(BT)、家犬(Canisfamiliaris)(CF)和红原鸡(gallusgallus)(GG)中NEDD9SH3结构域的氨基酸序列比对。突出显示的残基指出推测的活性位点(HS、匪、RN、PT和BT中氨基酸9-28；CF中氨基酸残基41-60；GG中氨基酸残基41-59)。图6为显示活RBL-2H3细胞中生物素化MDDl摄取的柱状图，在以链霉亲和素-APC细胞内染色后通过FACS检测。生物素化MDDl以0.OOlmMMDDl(2),0.OlmMMDDl(3)或0.ImMMDDl(4)的浓度给予细胞。对照细胞仅给予PBS(I)。图7显示MDDl肽对IgE受体交联后RBL-2H3细胞脱粒的影响。(1)仅IgE包被(2)IgE包被+IgE受体交联(3)MDDl肽(0.OlmM)预处理+IgE包被+IgE受体交联(4)SCR肽0.OlmM预处理+IgE包被+IgE受体交联。图8显示MDDl肽对卵清蛋白抗原(OVA)致敏小鼠肺功能的影响。对经OVA鼻内激发以诱导哮喘的小鼠，以8mg/kg静脉内共给予MDDl肽(A)或以lmg/ml鼻内雾化共给予MDDl肽(B)。通过体积描记法测量肺阻力。RL:非阻力。图9显示哮喘诱导后OVA致敏小鼠中的炎性反应水平。通过以β_乙酰甲胆碱激发，在经盐水、SCR对照肽或MDDl肽预处理的OVA致敏小鼠中诱导哮喘。(A)%血液中嗜酸性粒细胞⑶支气管肺泡灌洗液中总细胞数(C)炎性病症处的TNF表达和⑶血清中抗原特异IgE的水平。图10显示MDDl肽的局部给药稳定衍生自IgE受体交联后IgE致敏小鼠的耳活检组织的皮肤肥大细胞。小鼠左(L)耳仅以DMSO处理。右(L)耳以MDDl肽/DMSO或地塞米松/DMSO的混合物处理。图11显示MPX741和MPX742肽对IgE受体交联后RBL-2H3细胞脱粒的影响。(1)仅IgE包被(2)IgE包被+IgE受体交联(3)MPX741肽(0.OlmM)预处理+IgE包被+IgE受体交联(4)MPX742肽0.OlmM预处理+IgE包被+IgE受体交联。详细说明细胞内信号转导为导致细胞活化的有序级联事件。在大多数真核细胞中，这由主要由磷酸酶、激酶和接头/调节因子组成的复杂蛋白网络所推动。通过促进关键信号分子相互作用，接头分子在细胞内信号途径中起了必不可少的作用。接头分子内的特异结构域负责促进蛋白相互作用。这包括Src同源(SH)结构域(例如Src同源2(SH2)和Src同源3(SH3)结构域)和pleckstrin同源(PH)结构域。在细胞内信号事件期间，Src同源结构域结合含磷酸酪氨酸的蛋白，触发一系列的事件，导致对含Pleckstrin同源(PH)结构域的蛋白的募集。对含PH结构域蛋白的募集又催化二级信使的产生，有助于信号级联的持续。如本文所描述的，在肥大细胞活化期间，编码含SH2/SH3/PH结构域的蛋白的多个不同基因的表达改变了。确定在肥大细胞活化期间具有改变的表达的基因有NEDD9和PHLDA1，与静息细胞相比，在活化的骨髓来源人肥大细胞中它们的表达都被上调。人NEDD9基因(神经前体细胞表达的发育下调基因9)(GenBankIDs:NM_006403.2和ΝΜ_182966·2，EnsemblID:ENSG00000111859，Entrez基因ID4739和UniprotIDQ14511)，也称为CasL(Crk相关底物淋巴细胞类型)和HEFl(人成丝增强子1)，编码表达未加工的834氨基酸前体蛋白。NEDD9为多功能的锚定蛋白，参与传播细胞内信号，并在多种组织内的细胞核、细胞质和诸如高尔基体和板状伪足的结构中表达。NEDD9含有SH3结构域和富含SH2结合位点的结构域。这些结构域有利于与Lck、Lyn和Fyn以及其它细胞内伙伴的高选择性相互作用，其中Lck、Lyn和Fyn为位于包括T细胞、B细胞和Fc受体在内的表面受体下游的重要细胞内角色。PHLDAl(Pleckstrin同源样结构域，家族A，成员1)(GenBankID:NM_007350,Ensembl基因ID:ENSG00000139289，Entrez基因ID-.22822)编码蛋白PHLDAl(UniprotIDQ8WV24)，也称为PHLAl、TDAG51(Τ细胞死亡相关基因51)和PHRIP(富含脯氨酸和组氨酸的蛋白)。PHLDAl含有pleckstrin同源(PH)结构域。PH结构域以高亲和力结合限制于细胞膜的磷酸肌醇(磷脂酰肌醇的磷酸化衍生物)。通过结合磷酸肌醇，含PH结构域蛋白通常被募集至细胞膜，然后在这里它们在细胞信号转导中发挥功能。在某些方面和实施方案中，本发明提供了能够调节肥大细胞活化的肽。这些肽包含对应SH3结构域序列和/或PH结构域序列的至少一部分的序列。优选地，该SH3结构域为NEDD9SH3结构域。优选地，该PH结构域为PHLDAlPH结构域。在本发明的其它方面和实施方案中，提供了含SH2/SH3/PH结构域蛋白，它们也能够调节肥大细胞活化。不限制于特定机制，认为含SH2/SH3/PH结构域蛋白(例如NEDD9和PHLDA1)通过它们的SH2结构域、SH3结构域和/或PH结构域结合至在肥大细胞内部具有对应结合结构域的特异靶蛋白而调节肥大细胞活性。相应地，本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽可以减弱、增强、阻止或以其它方式改变SH2结构域、SH3结构域或PH结构域与位于肥大细胞表面受体下游重要细胞内角色如Lck、Lyn和Fyn的相互作用。因此，可以以本发明的肽和含SH2/SH3/PH结构域蛋白给药来调节肥大细胞活化，从而提供治疗和/或预防超敏疾病和病症的手段。含SH2/SH3/PH结构域蛋白和竞争肽本文描述能够调节肥大细胞活化的含SH2/SH3/PH结构域蛋白。根据本发明的方面和实施方案，能够调节肥大细胞活化的蛋白包含SH2、SH3或PH结构域的至少之一。适合的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的实例包括但不限于NEDD9和PHLDAl。在本说明书上下文中，应理解NEDD9蛋白包括该包含SH3结构域的蛋白的所有变体和亚型。NEDD9蛋白的亚型例如包括亚型1(Q14511)(REFSEQ登记号NM_006403.2)、亚型2(UniProt:Q5XKI0)、亚型CRA_a(UniProt识别号Q5T9R4)、和亚型CRA_c(REFSEQEAW55302.1)。其它的NEDD9蛋白变体例如列在UniProt数据库中，包括蛋白(UniProtQ5TI59)。也涉及源自翻译后修饰的NEDD9蛋白，例如亚型1蛋白pll5、pl05、p65和p55。类似地，在本说明书上下文中，应理解PHLDAl蛋白包括该包含PH结构域的蛋白的所有变体和亚型。因此，PHLDAl蛋白可以由EntrezGeneID22822描述的PHLDAl基因(Pleckstrin同源样结构域家族A成员1)编码，其表达产生5913核苷酸的转录本(参见NCBIREFSEQ登记号NM_007350)，并且例如可翻译成REFSEQ:NP_031376、REFSEQEAW97312.1或UniProt识别号Q8WV24指出的蛋白。也涉及Entrez数据库中变体PHLDAlCRA_a(例如REFSEQ:AAH18929.3、AAI10821.1和AI26426.2)编码的PHLDAl蛋白。本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白可以具有，但不限于，SEQIDNO:2或SEQIDN0:4所示的多肽序列。编码本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的多核苷酸序列可以为SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示，或显示出足够的序列一致性以至于与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的序列杂交。在可选择实施方案中，编码本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的多核苷酸序列可以与SEQIDNO:1所示的序列和/或SEQIDNO:3所示的序列有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。根据其它方面和实施方案，本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白可以具有但不限于SEQIDNO:6所示的多肽序列。编码本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的多核苷酸序列可以为SEQIDNO:5所示，或显示足够的序列一致性以至于与SEQIDNO:5的序列杂交。在可选择实施方案中，编码本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的多核苷酸的核苷酸序列可以与SEQIDNO:5所示的序列有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。本文描述了包含对应于SH3结构域的至少一部分的序列的肽。优选地，该SH3结构域为NEDD9SH3结构域。本文还描述了包含对应于PHLDAl蛋白PH结构域的至少一部分的序列的肽。本发明的肽可以认为是“竞争肽”，因为它们的序列至少部分对应于部分或全部NEDD9SH3结构域，或部分或全部PHLDA1PH结构域。根据某些方面和实施方案，本发明的肽可以具有SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12禾口SEQIDNO13所示的序列。根据其它方面和实施方案，本发明的肽可以具有SEQIDNOS14-273中任一所示的序列。根据其它方面和实施方案，本发明的肽可以具有SEQIDNOS:274_488中任一所示的序列。一般而言，本发明的蛋白和为分离或纯化形式。应理解，包括在本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽范围内的有其变体和片段。用在本文时，术语“变体”指基本上相似的序列。通常，如果两序列在特定区域上或未明确指出时在整个序列上具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(“序列一致性”百分比)，则该两序列为“基本上相似的”。因此，本文公开的多核苷酸和多肽序列的“变体”与参照序列有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、83%、85%、88%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。通常，序列变体具有共同的定性生物学活性。多核苷酸序列变体一般编码这样的多肽，它们一般具有共同的定性生物学活性。本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和竞争肽的同源物也包括在术语“变体”的含义之内。同源物通常来自不同科、属或种，其具有与本文公开的对应的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或竞争肽基本上相同的生物学功能或活性。例如，含SH2/SH3/PH结构域蛋白或竞争肽同源物可以包括，但不限于源自其它不同的哺乳动物物种的那些。另外，术语“变体”也包括本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的类似物。多肽“类似物”为这样的多肽，其为本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的衍生物或本发明的肽的衍生物，该衍生物包括添加、删除、置换一个或多个氨基酸，以至于该蛋白/肽基本上保留了相同功能。术语“保守氨基酸置换”指在本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白多肽链或本发明的肽内以一个氨基酸置换或替换另一具有类似性能的氨基酸。例如，以带电氨基酸谷氨酸(Glu)置换类似的带电氨基酸天冬氨酸(Asp)为保守氨基酸置换。氨基酸添加可以产生自本发明的多肽与另一多肽或肽的融合，所述另一多肽或肽如多组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白融合蛋白、谷胱甘肽S转移酶融合蛋白、绿色荧光蛋白融合蛋白，或产生自添加表位标签如FLAG或c-myc。通常，可以改变本文描述的蛋白和肽的性能和特征，以便使得更适合特定治疗应用。可以被改善的这类性能和特征的非限定性实例包括但不限于溶解性、化学和生物学稳定性、细胞摄取、毒性、免疫原性以及降解产物的排泄。可以改善本文描述的肽的特征和性能的方法和手段为本领域所公知。例如，一种手段是搜寻并鉴定对特定性能为负面或正面决定基(determinant)的特定氨基酸残基。这可以例如通过采用侧链截短(side-chainamputation)技术来实现，其中沿肽序列以原始型残基(prototypicresidue)L-丙氨酸一次一个地置换氨基酸。弄清关键决定位点为生成和测试在鉴定位点具有天然和非天然氨基酸置换的变体提供了基础。显示出期望的特征的先导肽可以用作设计具有改善的稳定性和药代动力学性能的模拟态分子的模板。这种方法采用合理设计和分子模型指导的结构修饰。这些包括但不限于构象限制的建筑块以及肽键等排物(参见，例如，Vagneretal,2008,"Peptidomimetics,asynthetictoolofdrugdiscover(模拟肽，药物开发的合成工具)，，，CurrentOpinioninChemicalBiology,12-.292-296.)。两序列之间的序列一致性百分比可以通过在比较窗口中比较两最佳比对的序列来确定。比较窗口内的序列部分可以例如相对于参照序列(例如，本文公开的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽的多核苷酸或多肽序列)包括删除或添加(即空位)(该参照序列不包括删除或添加)，以便最佳比对两序列。接着可这样计算序列一致性百分比确定两序列中均存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以得到匹配位置数量，以匹配位置数量除以比较窗口内的位置总数并将结果乘以100，得到序列一致性百分比。对于两个或更多个核酸或多肽序列，序列一致性百分比指，当在比较窗口针对最大对应比较并比对时，或采用以下的序列比较算法之一测量或通过手工比对并肉眼检查而指定区域时，在指定区域上(或者，当未指定时，在整个序列上)相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比。对于序列比较，典型地是，一个序列用作参照序列，测试序列与其比较。当采用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，视情况指定亚序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可指定可选择参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列一致性。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。可采用已知的计算机程序常规确定用于比较的序列的最佳比对，这些程序包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics，MountainView,California获得)；ALIGN程序(2·0版)以及GCGWisconsin遗传学软件包，第10版(可从AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTABESTFIT程序(Wisconsin序列分析包，Unix第8版，GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源算法以发现两序列之间的最佳同源片段(AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981))。当采用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定两序列之间的同源程度时，可以设置参数以使得一致性百分比在参照序列的全长上计算，以及允许至多参照序列中核苷酸或氨基酸残基总数的5%的同源空位。GAP采用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453中描述的算法来发现匹配数最大化且空位数最小化的两完整序列比对。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并生成具有最大数量的匹配碱基和最少空位的比对。它允许提供空位生成罚分和以匹配碱基为单位的空位延伸罚分。GAP显示最佳比对家族的一个成员。确定查询序列和目标序列之间的最佳整体匹配的另一方法，也称为全局序列比对，可采用基于Brutlag及其同事的算法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))来确定。在序列比对中，查询和目标序列都为DNA序列。可通过将U转变为T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果示为百分比一致性。BLAST和BLAST2.O算法可以用来确定百分比序列一致性和序列相似性。它们分别在Altschuletal.(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389_3402和Altschuletal(1990)J.Mol.Biol.215403-410中有说明。用于进行BLAST分析的软件为公众可从NationalCenterforBiotechnologyInformation(国家生物技术信息中心)获得的。这种算法包括首先鉴定高得分序列对(HSPs)，这通过在查询系列中鉴定长度W的短字(shortwords)来进行，当在数据库序列中与相同长度的字比对时，它们或者匹配或者满足某种正值的阈值得分Τ。T称为邻字得分阈值(neighbourhoodwordscorethreshold)(Altschuletal，同上)。这些最初的邻字命中用作起始查询的种子以发现含有它们的更长HSPs。这些字命中沿每一序列双向延伸，只要累积比对得分可增加。对于核苷酸序列，累积得分采用参数M(对于成对的匹配残基的奖赏分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)计算。对于氨基酸序列，得分矩阵被用于计算累积得分。当出现以下情况时，每一方向上的字命中延伸停止累积比对得分从其最大获得值减小数量X；由于一个或多个负分残基比对积累导致累积得分变为零或以下；或到达任一序列的末端。该BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用默认字长(W)ll，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及两条链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用默认字长3，期望值(E)10，以及BLOSUM62得分矩阵(参见HenikoffandHenikoff(1989)Proc.Natl,Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及两条链比较。BLAST算法也进行两序列之间相似性的统计分析(参见，例如Kar1inandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sd.USA90:5873_5787)。BLAST算法提供的对相似性的一种衡量是5最小和概率(P(N))，其提供对两核苷酸或氨基酸序列之间偶然匹配的概率的指示。例如，当测试核酸与参照核酸比较的最小和概率小于约0.2、更优选小于约0.01、且最优选小于约0.001时，认为测试核酸类似于参照核酸。本发明还涉及本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的片段。“片段”为多肽分子，其编码或为本发明含SH2/SH3/PH结构域蛋白和/或肽或其变体的组成部分。该片段通常具有与其作为组成部分的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和/或肽共同的定性生物学活性。该肽片段可以为约3至约2000氨基酸长度，约3至约1750、约3至约1500氨基酸长度，约3至约1250氨基酸长度，约3至约1000氨基酸长度，约3至约950氨基酸长度，约3至约900氨基酸长度，约3至约850氨基酸长度，约3至约800氨基酸长度，约3至约750氨基酸长度，约3至约700氨基酸长度，约3至约650氨基酸长度，约3至约600氨基酸长度，约3至约550氨基酸长度，约3至约500氨基酸长度，约3至约450氨基酸长度，约3至约400氨基酸长度，约3至约350氨基酸长度，约3至约300氨基酸长度，约3至约250氨基酸长度，约3至约200氨基酸长度，约3至约150氨基酸长度，约3至约125氨基酸长度，约3至约100氨基酸长度，约3至约75氨基酸长度，约3至约50氨基酸长度，约3至约40氨基酸长度，约3至约35氨基酸长度，约3至约30氨基酸长度，约3至约25氨基酸长度，约3至约20氨基酸长度，约3至约15氨基酸长度，约3至约10氨基酸长度，约3至约7氨基酸长度，约5至约10氨基酸长度，约5至约15氨基酸长度，约5至约20氨基酸长度，约5至约25氨基酸长度，约5至约30氨基酸长度，约5至约35氨基酸长度，约8至约12氨基酸长度，约8至约15氨基酸长度，约8至约20氨基酸长度，约8至约25氨基酸长度，以及约8至约30氨基酸长度。还涉及本文公开的多核苷酸的片段。多核苷酸“片段”为多核苷酸分子，其编码或为本发明多核苷酸或其变体的组成部分。多核苷酸片段可以或可以不编码保留了生物学活性的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽。根据本发明使用的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽的生物学活性片段通常可以具有对应全长蛋白的免疫调节活性的至少约50%，更通常具有至少约60%的这种活性，更通常具有至少约70%的这种活性、更通常具有至少约80%的这种活性、更通常具有至少约90%的这种活性、且更通常具有至少约95%的这种活性。该片段例如可用作杂交探针或PCR引物。该片段可以源于本发明的多核苷酸或可以通过一些其它手段、例如化学合成而合成。本发明含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的变体可通过诱变生成。诱变可以针对本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽，或编码核酸，其例如采用本领域技术人员公知的方法通过随机诱变或定点诱变进行。这类方法例如在CurrentProtocolsInMolecularBiology(现代分子生物学规程)(第9章)，Ausubeletal，1994，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork中有描述，在此通过引用将其公开内容并入本文。本文描述的变体和类似物也包括与其它化学部分复合的多肽、融合蛋白或以其它方式翻译后修饰的多肽。此外，含SH2/SH3/PH结构域蛋白、肽及其片段或变体可以具有其它的翻译后修饰，包括侧链修饰如乙酰化、脒基化、甲氨酰化、还原烷基化和本领域技术人员已知的其它修饰。含SH2/SH3/PH结构域蛋白、肽及其变体或片段可以采用本领域已知的任何适当方法获得。例如，本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白、肽及其变体或片段可以采用标准重组核酸技术获得，或者可以例如采用常规液相或固相合成技术合成。本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽可以例如通过以一种或多种诸如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶的蛋白酶消化多肽而产生。所消化的肽片段可以通过例如高效液相色谱(HPLC)技术纯化。重组蛋白产生技术一般可以包括将编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白的基因或编码本文描述的肽的序列克隆进用于随后在适合的微生物内过表达的质粒中。构建表达载体或质粒的适当方法例如在标准教科书中有详细描述，例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，ColdSpringHarbor,NewYork,1989,禾口Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学规程)，JohnWileyandSons,copyright2007。产生本发明的重组的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的方法例如在标准教科书中有详细描述，例如Coliganetal.,CurrentProtocolsinProteinScience(现代蛋白科学规程)，(第5章)，JohnffileyandSons,Inc.,copyright2007,以及PharmaciaBiotech.,TheRecombinantProteinHandbook(M^lSS)1994,PharmaciaBiotech。可用于产生本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的常用表达系统包括例如细菌(如，大肠杆菌(E.coli))、酵母(如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)曲霉菌(Aspergillus)，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastorisis))、病毒(如，杆状病毒和牛痘病毒)、细胞(如，哺乳动物和昆虫的)以及无细胞系统。也可以采用例如Madinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.97:559_564(2000),PelhamandJackson,Eur.J.Biochem.,67247-256(1976),RobertsandPaterson,Proc.Natl.Acad.Sci.,70:2330_2334(1973)，Zubay,Ann.Rev.Genet.,7:267(1973),GoldandSchweiger,Meth.Enzymol.,20537(1971)，Lesleyetal.，J.Biol.Chem.，266(4):2632_2638(1991)，Baranovetal.，Gene,84463-466(1989)以及Kudlickietal.,Analyt.Biochem.，206:389_393(1992)中描述的方法，使用无细胞系统，例如真核兔网状细胞、麦芽提取物系统和原核E.coli无细胞系统。本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和竞争肽(以及每一种的片段和变体)可以采用本领域公知的液相和固相化学标准方法合成(参见，例如Hackengetal.,ProcNatlAcadSciUSA.96(18)10068-73(1999)，以及StewardandYoung,SolidPhasePeptideSynthesis(固相肽合成)(第二版)，PierceChemicalCo.，Illinois,USA(1984)。一般而言，这种合成方法包括向生长肽链顺序添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。第一氨基酸的氨基或羧基基团一般被适合的保护基团保护。然后经保护的氨基酸连接至惰性固体支持物，或者在适合于形成酰胺键的条件下，通过添加互补(氨基或羧基)基团被适当保护的序列中的下一氨基酸而在溶液中使用。接着从该新添加的氨基酸残基中除去保护基团，并添加下一(受保护的)氨基酸，以此类推。当所有期望的氨基酸都已连接后，顺序或同时除去任何剩余的保护基团以及任何固体支持物(有必要的话)，以生成最后的多肽。可通过本领域的标准技术实现对本发明含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的氨基酸序列的改变。例如，只要保持了正确的阅读框。可以通过包括添加、删除或置换核苷酸(保守和/或非保守的)在内的核苷酸替换技术实现氨基酸改变。示例性技术包括随机诱变、定点诱变、寡核苷酸介导的或多核苷酸介导的诱变、通过使用现有的或改造的限制酶位点删除所选区域、以及聚合酶链式反应。出于本发明目的的免疫调节活性测试可以通过本领域已知的多种技术的任一种来进行。对本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽(及其每一种的片段和变体)的纯化可以采用本领域标准技术实现，例如Coliganetal.,CurrentProtocolsinProteinScience(现代蛋白科学规程)，(第6章)，JohnWileyandSons，Inc.，copyright2007中描述的那些方法。例如，如果蛋白或肽为可溶状态，可以采用标准方法如柱层析来分离。本文描述的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽可以经遗传改造而含有辅助纯化的各种亲和标签或载体蛋白。例如，使用工程化进含有本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白和/或肽的表达载体中的组氨酸和蛋白标签可以促进例如通过天然或变性条件下金属螯合层析(MCAC)进行的纯化。可以为大规模生产而按比例扩大纯化。技术人员应理解，本发明不被所使用的产生或纯化方法所限，以上描述的方法和技术是仅出于示例目的而提供。免疫反应调节和抑制肥大细胞活化本文描述了调节个体中免疫反应的方法。该方法包括向个体给予治疗有效量的蛋白，该蛋白包括以下的至少之一(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)本发明的肽。在一实施方案中，该蛋白为NEDD9或其片段或变体。在另一实施方案中，该蛋白为PHLDAl或其片段或变体。通过本发明的方法可以增强或抑制免疫反应。例如，给予有效量的负调节肥大细胞活化途径的本文描述的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽可以导致肥大细胞活化遏制。于是，给药后个体内的超敏反应可以被减弱或防止。可选择地，给予有效量的正调节肥大细胞活化的本文描述的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽可以导致肥大细胞活化增强。于是，给药后可以增强个体内的超敏反应。本文还提供了抑制或防止肥大细胞活化的方法。在本发明的某些方面，抑制或防止肥大细胞活化的方法可以包括给予包含以下的至少之一的蛋白(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)本发明的肽。优选地，该蛋白为NEDD9或PHLDA1。在本发明的其它方面，抑制或防止肥大细胞活化的方法包括给予治疗有效量的肽，该肽包含对应于(i)Src同源3(SH3)结构域或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列。优选地，该肽的序列至少部分对应于NEDD9Src同源3(SH3)结构域。优选地，该肽的序列至少部分对应于PHLDAlpleckstrin同源(PH)结构域。在本发明的某些实施方案中，至少部分对应于NEDD9Src同源3(SH3)结构域的肽可以具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。在本发明的其它实施方案中，至少部分对应于NEDD9Src同源3(SH3)结构域的肽可以具有SEQIDNOS14-273中任一所示的氨基酸序列。在本发明的某些实施方案中，至少部分对应于PHLDAlpleckstrin同源(PH)结构域的肽可以具有SEQIDNO10,SEQIDN0:11或SEQIDNO12所示的氨基酸序列。在本发明的其它实施方案中，至少部分对应于PHLDAlpleckstrin同源(PH)结构域的肽可以具有SEQIDNO13所示或SEQIDNOs274-488中任一所示的氨基酸序列。肥大细胞活化可以通过IgE依赖机制发生，例如通过肥大细胞表面上的IgE交联。另外地或可选择地，肥大细胞活化可以通过IgE非依赖机制发生。可以采用本领域已知的方法来测量和比较给予了或未给予本文描述的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽的肥大细胞中的活化水平。例如，可通过检测活化的肥大细胞脱粒后释放的因子的标准测定法，来测量肥大细胞活化水平。这些因子包括例如组胺、类胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶(serineproteasetryptase)、β-己糖胺酶、肝素、硫酸软骨素Ε、前列腺素D2、白细胞三烯Β4和C4、血小板活化因子、或细胞因子释放，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、TNF、CCL2、CCL3和CCL5。另外地或可选择地，肥大细胞活化程度可以通过肥大细胞活化的特定标志物的表达变化来测量，例如通过流式细胞术或免疫细胞化学进行。可以采用这类技术，通过本领域已知的由肥大细胞表达的各种表面受体的表达来鉴定肥大细胞，其包括但不限于⑶9、⑶29、⑶33、⑶43、⑶44、CD45、CD46、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、和CDl17、CD47、CD48、CD49d、CD53、CD60、CD63、CD81、CD82、CD84、CD87、CD92、CD97、CD98、和CD99、CD147、CD149、CD151、以及CD157。如此鉴定的肥大细胞的活化水平可以例如通过肥大细胞活化标志物的表达来测量，所述标志物例如CD107A(LAMP-I)、CD107B(LAMP-2)、类胰蛋白酶和PGD2。如本文所附实施例中显示的，已确认，给予在序列上对应于NEDD9SH3或PHLDA1PH结构域内特异区域的“竞争肽”具有使肥大细胞脱敏并抑制它们在IgE交联时活化的效果。不希望局限于特定机制，可认为对应于NEDD9SH3的肽通过干扰NEDD9SH3结构域与肥大细胞内部靶蛋白SH3结合结构域的正常结合而对肥大细胞活化起这种作用。可认为这是改变了与位于这些肥大细胞表面受体下游的三个重要细胞内角色Lck、Lyn和Fyn的高选择性相互作用，由此破坏了活化途径。类似地，可认为对应于PHLDAlPH结构域的肽通过干扰PHLDAlPH结构域与肥大细胞内靶蛋白中存在的PH结合结构域的正常结合而抑制肥大细胞活化。本发明人已证实，干扰NEDD9SH3结构域和/或PHLDAlPH结构域与肥大细胞内靶蛋白的结合提供了调节肥大细胞活化的手段。除了示例的肽，可设计使用大量的基于NEDD9SH3结构域或PHLDAlPH结构域序列的肽，并且应理解这些也包括在本发明范围内。本发明还涉及可以通过改变含SH2/SH3/PH结构域蛋白的表达而发挥对个体免疫反应调节作用的试剂。这种情况下，可以通过将候选试剂存在下含SH2/SH3/PH结构域蛋白的表达与候选试剂不存在下含SH2/SH3/PH结构域蛋白的表达水平进行比较来鉴定这类试齐U。编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白的基因的表达可以通过试剂来增强，例如通过接触基因的调节序列并由此增强其转录。可选择地，编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白的基因的表达可以被试剂减弱或抑制，例如通过以阻碍包括在该基因的转录机构中的蛋白接近或防止其起作用的方式结合该基因。另外，可通过给予同源反义核酸减少或抑制含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl的生成而实现对免疫反应和肥大细胞活化的调节作用。本文还提供了至少5核苷酸、一般至多约200核苷酸的这类核酸(其对编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白的互补DNA(cDNA)基因反义)的治疗或预防用途。这种反义核酸能够通过一定程度的序列互补而通常在高严紧条件下杂交至含SH2/SH3/PH结构域蛋白的RNA前体(一般为mRNA)的一部分。反义核酸可以互补于含SH2/SH3/PH结构域蛋白的RNA前体的编码和/或非编码区。不必要完全互补于全长RNA前体。这种形式的反义核酸可用作减弱或抑制肥大细胞活化的治疗剂，并且可用在治疗或预防本文描述的疾病状态中。互补于含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl的RNA前体的反义核酸可以为至少5核苷酸，并一般为长度范围5至约200核苷酸的寡核苷酸。例如，该反义寡核苷酸为至少10核苷酸、至少15核苷酸、至少100核苷酸、至少125核苷酸、至少150核苷酸或至少175核苷酸。该寡核苷酸可为DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修饰形式，单链或双链的。可采用本领域普遍已知的取代基修饰互补于RNA前体的反义核酸结构上的任何位置。该反义核酸可以包括至少一个经修饰的碱基部分，其选自包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、次黄嘌呤核苷、2，2_二甲基鸟嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(ν)、Q核苷、wybutoxosine、5-甲基_2_硫尿嘧啶、3_(3_氨基-3_N_2-羧丙基)尿嘧啶、以及2，6-二氨基嘌呤的组。互补于RNA前体的反义核酸可以包括至少一个修饰的糖部分，例如阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。该反义核酸还可以包括至少一个经修饰的磷酸骨架，选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和formacetal及其类似物。该反义核酸可偶联至另一分子，例如肽、杂交触发的交联剂、转运试剂(transportagent)或杂交触发的切割试剂。编码互补于含SH2/SH3/PH结构域蛋白(例如NEDD9或PHLDA1)RNA前体的反义核酸的序列的表达可通过本领域已知的在哺乳动物(包括人)、细胞内起作用的任何启动子进行，并且可以包括诱导型或组成型启动子。RNA干扰(RNAi)(参见，例如Chuangetal.,ProcNatlAcadSciUSA97:4985-4990(2000))可用来抑制编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl的基因的表达。干扰RNA(RNAi)片段，特别是双链RNAi，可用来引起蛋白减少。与使用RNAi在有机体内沉默基因有关的方法是已知的，例如Fireetal.，Nature391806-811(1998)；Hammondetal.,NatureRev,Genet.2110-1119(2001)；Hammondetal.,Nature404293-296(2000)；Bernsteinetal.,Nature409363-366(2001)；Elbashiretal.,Nature411:494_498(2001)；国际PCT申请WO01/29058；以及国际PCT申请WO99/32619)，通过引用将它们的公开内容并入本文。采用保持在染色体之外或整合进基因组的可复制载体将双链RNA表达构建体引入宿主。通过选择适当的序列，dsRNA的表达可干扰编码IL-10同源物的内源mRNA的积累。治疗和/或预防超敏反应一方面，本发明涉及抑制或预防超敏疾病或病症的方法。该方法包括给予治疗有效量的蛋白的步骤，所述蛋白包括以下的至少之一(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)本发明的肽。优选地，该蛋白为NEDD9或其片段或变体。优选地，该蛋白为PHLDAl或其片段或变体。本文还描述了治疗或预防超敏疾病或病症的方法，包括给予治疗有效量的肽，该肽包含对应于(i)Src同源3(SH3)结构域或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列。优选地，该蛋白为NEDD9或其片段或变体。优选地，该蛋白为PHLDAl或其片段或变体。优选地，该肽包含选自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12及其变体和片段的氨基酸序列。在一实施方案中，该肽包含SEQIDNOs14-273所示的氨基酸。在另一实施方案中，该肽包含SEQIDNOs274-488任一所示的氨基酸。本发明还提供了治疗或预防超敏疾病或病症的方法，包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)结构域之一或二者结合肥大细胞受体。该抑制结合可以包括给予包含对应于NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域或PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列的肽。优选地，该肽包含选自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12及其变体和片段的氨基酸序列。在一实施方案中，该肽包含SEQIDNOs14-273所示的氨基酸。在另一实施方案中，该肽包含SEQIDNOs274-488任一所示的氨基酸。该超敏疾病或病症可以完全或部分地产生自肥大细胞活化。该肥大细胞活化可以通过IgE依赖或IgE非依赖机制发生。该超敏疾病或病症可以包括炎性反应。根据本文描述的方法可以预防或治疗的超敏疾病或病症的实例包括，但不限于，过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及呼吸疾病和病症，例如哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。治疗或预防超敏疾病或病症的方法还可以包括给予至少一种其它试剂。该其它试剂可以为免疫调节剂，在本发明上下文中，其指一种或多种细胞类型分泌的且在免疫反应的活化、维持、成熟、抑制、遏制或增强中起作用的分子介质。在另一实施方案中，该免疫调节剂可以为I型干扰素。根据本发明的方面和实施方案，可以向需要治疗的个体给予有效量的含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDA1，或肽(例如，SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO11,SEQIDN0:12)。本领域普通技术人员理解，该含SH2/SH3/PH结构域蛋白可以以物种特异方式给药，这样该蛋白可以源自待治疗的物种。本发明的蛋白和肽可以以组合物的形式给予个体。一般而言，适合于根据本发明方法使用的组合物可以按本领域普通技术人员已知的方法制备，因此可以包括药物可接受载体、稀释剂和/或佐剂。本发明的组合物可以制备为仅包含含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽，也涉及不同的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的混合物、肽混合物以及含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的组合。这类组合物可以包括在包含药物可接受载体、佐剂和/或稀释剂的药物组合物中。可选择地，本发明的组合物还可以包含免疫抑制剂。本发明的实施方案还涉及给予多核苷酸，该多核苷酸编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白(例如NEDD9或PHLDA1)和/或包含对应于SH3或PH结构域的至少一部分的氨基酸序列的肽。这种情况下，该多核苷酸通常可操作地连接至启动子，使得在向个体给予该多核苷酸之后产生适当的多肽序列。该多核苷酸可以在载体中给予个体。该载体可以为质粒载体、病毒载体或经改造用于插入外源序列、将它们引入真核细胞并表达引入序列的任何其它适合载体。待给药的核酸构建体可以包括裸DNA，或可以为组合物的形式，连同一种或多种药物可接受载体。该载体一般为真核表达载体，可以包含表达控制和加工序列，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号和转录终止序列。采用本领域已知的各种基因递送方法，可以增强编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl或本发明的肽的基因在个体的肥大细胞中的表达。例如，可以向个体给予包含可操作地连接至表达控制序列如诱导型启动子的编码肥大细胞活化途径的含SH2/SH3/PH结构域蛋白调节物的核酸序列的表达载体，来增强所述蛋白在肥大细胞中的生成。可选择地，可以向个体给予含有编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白和/或本发明的肽的核酸序列的病毒载体(例如逆转录和腺病毒载体)，以导致所述蛋白的生成。也可以通过从个体提取细胞、给予含目的基因的载体并随后再将细胞回输个体，来实现编码本文描述的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽的基因的递送。通过基因递送技术的编码本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽的基因的表达可用作调节个体内肥大细胞活化的手段。因此，这类方法也可以适合于治疗和预防个体内超敏疾病或病症。筛选调节剂本发明还涉及使用含SH2/SH3/PH结构域蛋白的激动剂和拮抗剂调节个体免疫反应，并提供鉴定这类激动剂和拮抗剂的方法。本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的激动剂和拮抗剂可以根据它们对肥大细胞活化的作用而具体设计或筛选。—方面，本发明涉及鉴定调节蛋白活性的试剂的方法，该蛋白包含Src同源2(SH2)结构域、Src同源3(SH3)结构域或pleckstrin同源(PH)结构域的至少之一。该方法包括让候选试剂在适合于允许候选试剂与该蛋白相互作用的条件下接触该蛋白，然后分析该蛋白的活性。另一方面，本发明涉及筛选多个候选试剂以鉴定调节蛋白活性的试剂的方法，该蛋白包含Src同源2(SH2)结构域、Src同源3(SH3)结构域或pleckstrin同源(PH)结构域的至少之一。该方法包括让多种候选试剂在适合于允许候选试剂与该蛋白相互作用的条件下接触该蛋白，然后测定该蛋白的活性。又一方面，本发明涉及筛选多种候选试剂以鉴定调节肥大细胞活化途径的含SH2/SH3/PH结构域蛋白调节剂活性的试剂。该方法包括让多种候选试剂在适合于允许候选试剂与肥大细胞活化途径的含SH2/SH3/PH结构域蛋白调节剂相互作用的条件下与肥大细胞活化途径的含SH2/SH3/PH结构域蛋白调节剂接触并测定所述肥大细胞活化途径的含SH2/SH3/PH结构域蛋白调节剂活性的步骤。优选地，在上述方法中提到的含SH2/SH3/PH结构域蛋白为NEDD9或PHLDAl。多种适合的方法可用于确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl相互作用或结合。非限定性方法包括双杂交法、免疫共沉淀、亲和纯化、质谱学、串联亲和纯化、噬菌体展示、标签转移(labeltransfer)、DNA微阵列/基因共表达和蛋白微阵列。例如，双杂交测定法可以用于确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白相互作用或结合。该酵母双杂交测定系统为基于酵母的遗传测定法，一般用于检测蛋白-蛋白相互作用(FieldsandSong.,Nature340245-246(1989))。该测定利用了转录激活因子的多结构域性质。例如，已知的转录激活因子的DNA结合结构域可以被融合至本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白且转录激活因子的激活结构域被融合至候选试剂。候选试剂与含SH2/SH3/PH结构域蛋白之间的相互作用促使转录激活因子的DNA结合和激活结构域紧密靠近。随后转录激活因子激活的特定报告基因的转录，使得能检测相互作用。在上述技术的修饰中，可以将本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白与可检测标签如碱性磷酸酶融合而构建融合蛋白，并采用如Flanagan和Leder描述的修饰形式的免疫沉淀(FlanaganandLeder,Cell63:185-194(1990))。可选择地，免疫共沉淀可用于确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白相互作用或结合。采用这种技术，活化的肥大细胞可以在适合于保持蛋白-蛋白相互作用的非变性条件下被裂解。然后可以将得到的溶液与特异于本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的抗体一起孵育，并例如通过以连接至固体支持物的抗体结合蛋白捕获，将其从本体溶液中免疫沉淀。以这种方法免疫沉淀含SH2/SH3/PH结构域蛋白促进了与该蛋白结合的试剂的免疫共沉淀。可采用多种本领域已知的方法来建立对结合试剂的鉴定，所述方法包括但不限于SDS-PAGE、western印迹和质谱学。可选择地，噬菌体展示技术可以用来确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白相互作用或结合。噬菌体展示为通过将来自基因库的多种基因整合进噬菌体而筛选蛋白相互作用的测试。在这种方法下，重组DNA技术被用于将多种基因表达为与噬菌体的外壳蛋白的融合蛋白，这样每一基因的肽或蛋白产物都展示在病毒颗粒的表面。以此方式，可以产生噬菌体展示目的肽或蛋白产物的整个文库。然后，可以就结合本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的能力而筛选所得到的噬菌体展示肽或蛋白产物的文库。从相互作用的噬菌体提取的DNA含有相互作用蛋白的序列。可选择地，亲和层析可用于确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白相互作用或结合。例如，含SH2/SH3/PH结构域蛋白可以固定在支持物(例如琼脂糖)上并让细胞裂解物穿过柱。然后可以从柱洗脱结合至固定的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的蛋白并例如通过N-末端氨基酸测序进行鉴定。确定候选试剂与本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白相互作用或结合是否调节所述蛋白活性的方法，可以通过测量刺激后肥大细胞活化程度来确定。例如，可以测量给予了候选试剂的肥大细胞的活化水平，并与未给予候选试剂的肥大细胞活化水平进行比较。肥大细胞对候选试剂的摄取可以通过天然扩散发生，或者可以通过本领域已知的各种方法诱导，包括但不限于显微注射、电穿孔、蛋白与一种或多种病毒蛋白转导结构域(PTDs)融合以及阳离子脂质递送。可选择地，可以在肥大细胞内诱导候选试剂的产生，例如通过将含有编码候选试剂的基因的质粒表达载体或病毒引入肥大细胞来进行。以质粒转染细胞的方法在本领域是公知的，包括例如磷酸钙共沉淀、DEAE葡聚糖协助的转染、电穿孔、显微注射和阳离子脂质体。然后，可以通过各种方法诱导肥大细胞活化，例如通过与IgE—起孵育并随后以DNP/白蛋白交联。也可以使用各种其它的IgE非依赖肥大细胞活化触发剂，可以例如经由FcyR,Toll样受体(TLRs)或通过给予离子霉素来诱导活化。可通过本领域已知的方法实现对给予了或未给予候选试剂肥大细胞的活化水平的测量和比较。肥大细胞活化的水平可以通过标准测定法来测量，它们检测活化的肥大细胞脱粒后释放的因子，例如组胺、类胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶、β-己糖胺酶、肝素、硫酸软骨素Ε、前列腺素D2、白细胞三烯Β4和C4、血小板活化因子、或细胞因子释放，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、TNF、CCL2、CCL3和CCL5。可选择地，肥大细胞活化程度可以通过肥大细胞活化的特定标志物的表达变化来测量，例如通过流式细胞术或免疫细胞化学进行。可以采用这类技术，通过本领域已知的由肥大细胞表达的各种表面受体的表达来鉴定肥大细胞，其包括但不限于⑶9、⑶29、⑶33、⑶43、⑶44、CD45、CD46、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、和CDl17、CD47、CD48、CD49d、CD53、CD60、CD63、CD81、CD82、CD84、CD87、CD92、CD97、CD98、和CD99、CD147、CD149、CD151、以及CD157。如此鉴定的肥大细胞的活化水平可以例如通过肥大细胞活化标志物的表达来测量，所述标志物例如CD107A(LAMP-I)、CD107B(LAMP-2)、类胰蛋白酶和PGD2。应理解，上文描述的方法仅为用来鉴定能够与本文描述的本发明含SH2/SH3/PH结构域蛋白(例如NEDD9和PHLDA1)相互作用或调节其活性的试剂的方法类型实例。本领域技术人员会知道其它的适当方法，它们也包括在本发明的范围内。采用上文描述的方法，可以鉴定作为本发明的SH2/SH3/PH结构域激动剂的试剂。作为激动剂的试剂增强本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的一种或多种生物学活性。可选择地，上文描述的方法可以鉴定作为本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的拮抗剂的试齐U。作为拮抗剂的试剂妨碍本发明的SH2/SH3/PH结构域的一种或多种生物学活性。通过各种本领域技术人员已知的方法，可以生成含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl的活性的潜在调节剂，用于通过以上方法进行筛选。例如，诸如X射线晶体学和核磁共振光谱学的方法可以被用于对本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的结构建模，因此有助于采用基于计算机的建模设计潜在调节剂。各种形式的组合化学也可以用于生成推断的调节剂。抗体可以用作本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的激动剂或拮抗剂。优选地，从含SH2/SH3/PH结构域蛋白多肽的不连续区域或片段制备适合的抗体。抗原性的含SH2/SH3/PH结构域多肽含有至少约5氨基酸并优选至少约10氨基酸。本领域技术人员容易地知道产生适合抗体的方法。例如，可以采用Antibodies-ALaboratoryManual(抗体-实验室手册)，HarlowandLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1988)中描述的杂交瘤技术制备通常含Fab部分的特异于本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽的单克隆抗体。本质上，对于制备针对本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽的单克隆抗体，任何用于通过培养的连续细胞系产生抗体分子的技术都可以使用。这些包括最初由Kohleretal.,Nature,256495-497(1975)开发的杂交瘤技术，以及三瘤体技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozboretal.,ImmunologyToday，4:72(1983))，以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Coleetal.,inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp.77-96,AlanR.Liss,Inc.,(1985))。可通过不同于融合的技术生成永生的抗体产生细胞系，例如以癌基因DNA直接转化B淋巴细胞或以Epstein-Barr病毒转染。参见，例如M.Schreieretal.,"HybridomaTechniques(杂交瘤技术)，，ColdSpringHarborLaboratory,(1980)；Hammerlingetal.,"MonoclonalAntibodiesandT-cellHybridomas(单克隆抗体与T细胞杂交瘤)，，Elsevier/North-HollandBiochemicalPress,Amsterdam(1981)；Kennettetal.,"MonoclonalAntibodies()PlenumPress(1980)。总之，产生从其产生单克隆抗体的杂交瘤的手段，将骨髓瘤或其它自身永存细胞系与获得自经其识别因子结合部分、或识别因子或来源特异的其DNA结合部分超免疫的哺乳动物脾的淋巴细胞融合。通过与当前识别因子免疫作用的能力以及抑制靶细胞中特定转录活性的能力，鉴定产生可用于实施本发明的产生单克隆抗体的杂交瘤。可用于实施本发明的单克隆抗体可通过起始单克隆杂交瘤培养物来产生，该单克隆杂交瘤培养物包含含有分泌具有适当抗原特异性的抗体分子的杂交瘤的营养培养基。在足以让杂交瘤向培养基分泌抗体分子的条件和时间段下维持培养。然后收集含抗体的培养基。接着可通过公知的技术进一步分离该抗体分子。类似地，本领域已知各种可用于产生单克隆抗体的操作。为了产生针对本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl或本发明的肽的多克隆抗体，可通过注射蛋白免疫各种宿主动物，包括但不限于兔、鸡、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。另外，多肽或其片段或类似物可以偶联至免疫原性载体，例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔戚血蓝素(KLH)。各种佐剂也可以用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂(rysolecithin)，复合多元醇，聚阴离子，肽、油乳剂、钥孔戚血蓝素、二硝基酚以及可能有用的人佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)0筛选期望的抗体也可通过本领域已知的各种技术来完成。测定抗体的免疫特异性结合可以包括但不限于放射免疫测定、ELISAs(酶联免疫吸附测定)、夹心法免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、Western印迹、沉淀反应、凝集测定、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白A测定以及免疫电泳测定，等等(参见例如Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(i^H^fLf夫JS禾呈)，Vol.1，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork(1994))可通过初级抗体上的可检测标签来检测抗体结合。可选择地，抗体可以通过其与适当标记的次级抗体或试剂结合来检测。在免疫测定中检测结合的各种方法在本领域是已知的，并包括在本发明的范围内。针对本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白或肽而产生的抗体(或其片段)对该蛋白有结合亲和性。优选地，该抗体(或其片段)具有高于约IO5M-1的结合亲和性或亲和力(avidity)，更优选高于约ΙΟΙ1，还更优选高于约IO7M.1，且最优选高于约108ΜΛ就获得适当量的本发明抗体而言，可以采用无血清培养基成批发酵制备抗体。发酵后，可以通过包括层析和病毒灭活/去除步骤在内的多步操作纯化抗体。例如，可以先通过蛋白A亲和层析分离抗体，接着以溶剂/去垢剂处理来灭活任何脂质包被的病毒。进一步的纯化(一般为阴离子和阳离子交换层析)可以用来除去残余蛋白、溶剂/去垢剂和核酸。经纯化的抗体还可以采用凝集过滤柱进一步纯化并配制在0.9%盐水中。所配制的大量制剂随后可以被灭菌、病毒过滤和分发。诊断超敏素质在另一方面，本发明涉及诊断个体出现超敏相关疾病或病症的素质的方法。该方法包括从个体获得核酸样品并分析核酸样品在编码本发明含SH2/SH3/PH结构域蛋白的核酸内是否存在至少一个突变的步骤。优选地，该含SH2/SH3/PH结构域蛋白为NEDD9或PHLDAl。可以通过本发明方法诊断的超敏相关疾病或病症包括但不限于，过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及与呼吸道感染相关的呼吸疾病。该呼吸道感染相关的呼吸疾病可以包括但不限于哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。用于诊断的核酸可以从源自个体各种来源的细胞获得，这些来源包括但不限于血液、尿、唾液、组织活检和尸检材料。多种技术已被用于鉴定核酸的序列变化。例如，高分辨率熔解曲线分析(Hi-ResMelting)，一种用于勻质突变扫描和基因分型的PCR后技术(Hi-ResLightScanner)，检测核苷酸序列中由于突变或改变产生的限制性位点的限制性片段长度多态性(RFLP)分析(参见Kanetal.，Lancet2(8096):910，(1978))，通过电泳凝胶中带泳动率的改变鉴定核苷酸序列差异的变性梯度凝胶电泳和单链DNA电泳迁移率研究(参见，Myersetal.,Nature313495,(1985)；Oritaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2766，(1989))，鉴定异源双链DNA中错配位点的化学切割分析(参见Cotton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4397，(1988))，以及鉴定RNA-DNA或RNA-RNA异源双链中错配位点的RNA酶切割分析(参见Myersetal.，Science230:1242，(1985)；Maniatisetal.，U.S.Pat.No.4，946，773)。可采用本领域已知的各种技术在DNA水平检测突变。基因组DNA可以被直接用于检测，或者可以在分析之前采用聚合物链式反应(PCR)(Saikietal.，Nature324163-166(1986))酶学扩增。RNA或cDNA也可以用于该目的。举例而言，互补于编码本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的核酸的PCR引物可被用于鉴定并分析突变。例如，通过与野生型基因型相比的扩增产物大小差异可以检测删除和插入。可以通过让扩增的DNA与编码含SH2/SH3/PH结构域蛋白的放射标记RNA或可选择地放射标记的反义DNA序列杂交来鉴定点突变。通过RNA酶A消化或通过解链温度差异可将完全匹配的序列与错配双链体区分开。也可以通过核酸片段或蛋白在含有或不含变性剂的凝胶中的电泳迁移率变化来检测突变。小的序列删除和插入可以通过高分辨率凝胶电泳来观察。不同序列的核酸片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区分开，其中不同片段的迁移根据它们的特异解链或部分解链温度而被阻滞在凝胶中的不同位置(例如，参见Myersetal.,Science2301242(1985))。还可以通过诸如RNA酶和Sl保护的核酸酶保护测定或化学切割方法(例如参见Cottonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85:4397_4401(1985))，来解释特定位置的序列变化。因此，可通过诸如杂交、RNA酶保护、化学切割、直接DNA测序或使用限制酶(例如限制性片段长度多态性(RFLP))以及基因组DNA的Southern印迹的方法实现对特定DNA序列的检测。除了多种常规凝胶电泳和DNA测序外，也可通过原位分析来检测突变。根据本发明，可以制备这样的试剂盒，其包括从个体获得核酸样品的装置和分析该核酸样品是否存在至少一个调节本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的活性的突变的装置。这类试剂盒可以例如用于诊断个体出现变应性疾病或状况的素质。本发明的试剂盒包括一个或多个从个体细胞获取核酸样品的装置。细胞可以来自个体的各种来源，包括但不限于血液、尿、唾液、组织活检和尸检材料。另外，本发明的试剂盒包括分析核酸样品是否存在至少一个调节本发明的含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDAl的活性的突变的装置。这类突变的实例包括但不限于一个或多个核苷酸的删除、插入、易位、倒位和碱基置换。本发明的试剂盒还可以包括其它进行本发明方法所需的其它组分，例如缓冲剂和/或稀释剂。该试剂盒一般包括用于容纳各种组分的容器和在本发明方法中使用试剂盒组分的说明书。组合物和给药途径本发明涉及使用组合物，该组合物包含含SH2/SH3/PH结构域蛋白如NEDD9或PHLDA1、本发明的肽、不同的含SH2/SH3/PH结构域蛋白的混合物、肽的混合物以及含SH2/SH3/PH结构域蛋白和肽的组合。该组合物可以包括在包含药物可接受载体、佐剂和/或稀释剂的药物组合物中。另外地或可选择地，本发明的组合物可以包含免疫抑制剂，例如抗炎化合物或支气管扩张化合物。在其它实施方案中，免疫抑制剂可以为环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、吗替麦考酚酯、氨甲喋呤、chromoglycalates、茶碱、白细胞三烯拮抗剂和抗组胺剂，或它们的组合。免疫抑制剂也可以为针对B或T淋巴细胞或介导它们活化的表面受体的免疫抑制药或特异抗体。例如该免疫抑制药可以为环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、吗替麦考酚酯、氨甲喋呤、chromoglycalates、茶碱、白细胞三烯拮抗剂和抗组胺剂，或它们的组合。另外，根据本发明使用的药物组合物还可以包含类固醇，例如皮质类固醇。在另一实施方案中，该组合物还包含类固醇。本发明还涉及治疗或预防个体超敏疾病或病症的方法，包括给予有效量的该组合物。本发明的其它实施方案提供包含Src同源2(SH2)结构域、Src同源3(SH3)结构域、pleckstrin同源(PH)结构域中至少一种的蛋白在制备治疗超敏疾病或病症的药物中的用途。优选地，该蛋白为NEDD9或其片段或变体。优选地，该蛋白为PHLDAl或其片段或变体。本发明还描述了包含对应(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列的肽在制备治疗超敏疾病或病症的药物中的用途。优选地，该肽包含选自SEQIDN0:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12及其变体和片段的氨基酸序列。在一实施方案中，该肽包含SEQIDSEQIDNOs14-273所示的氨基酸。在另一实施方案中，该肽包含SEQIDSEQIDNOs:274_488中任一所示的氨基酸。组合物可以通过标准途径给药。一般而言，该组合物可以通过胃肠外(例如，静脉内、脊柱内、皮下或肌内)途径给药。更优选地，该组合物可以局部、口服或鼻内给药。给药可以是全身的、区域的或局部的。在任意给定时间使用的特定给药途径将取决于多种因素，包括待治疗状况的性质、状况的严重性和程度、待递送的特定组合物所需剂量以及组合物的潜在副作用。就与组合物其它成分的相容性而言，载体、稀释剂和佐剂必需是“可接受的”，并且对其接受者无害。药物可接受载体或稀释剂的实例为去矿物质水或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3_丁二醇或甘油；脂肪酸酯如棕榈酸异丙酯、豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；黄蓍胶或阿拉伯树胶以及凡士林。一种或多种载体一般占组合物重量的10%至99.9%。本发明的组合物可以为适合于通过注射给药的形式，适合于口服的制剂的形式(例如胶囊、片剂、囊片、酏剂)，适合于局部给药的软膏、乳膏或洗剂的形式，适合于作为滴眼剂递送的形式，适合于通过吸入给药(例如通过鼻内吸入或口腔吸入)的气雾剂形式，适合于胃肠外给药(即皮下、肌内或静脉内注射)的形式。对于作为可注射溶液或悬浮液给药，无毒性的胃肠外可接受稀释剂或载体可包括Ringer溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2丙二醇。适合于口服的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯树胶、黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服制剂可以含有适当的调味和着色剂。当以胶囊形式使用时，胶囊可以涂覆有诸如甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸酯这类延缓崩解的化合物。佐剂一般包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。用于口服给药的固体形式可以含有人和兽医药物实践中可接受的粘合剂，甜味齐U，崩解剂，稀释剂，调味品，涂层剂，防腐剂，润滑剂和/或延释剂。适合的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适合的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。适合的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜儿胶、黄原胶、膨润土、褐藻酸或琼脂。适合的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。适合的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或木莓调味品。适合的涂层剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。适合的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素Ε、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适合的延释剂包括甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。除了上述试剂，用于口服给药的液体形式还可以含有液体载体。适合的液体载体包括水，油类如橄榄油、花生油、芝麻油、向日葵油、红花油、落花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或它们的混合物。用于口服给药的悬浮剂还可以包含分散剂和/或助悬剂。适合的助悬剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰基醇。适合的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨醇单或二油酸脂、硬脂酸酯或月桂酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖单或二油酸脂、硬脂酸酯或月桂酸酯，等等。用于口服给药的乳剂还可以包含一种或多种乳化剂。适合的乳化剂包括上文例举的分散剂或天然胶如瓜儿胶、阿拉伯树胶或黄蓍胶。制备可胃肠外给药组合物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的，例如在Remington'sPharmaceuticalScience(Remington药物禾斗学)，15thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pa.中有更详细的说明，在此通过引用将其并入本文。本发明的局部制剂包括活性成分和一种或多种可接受的载体，以及任选地任何其它治疗性成分。适合于局部给药的制剂包括适合于透过皮肤到达需要治疗部位的液体或半液体制剂，例如擦齐、洗齐、乳膏、软膏或贴剂，以及适合于眼、耳或鼻给药的滴剂。本发明的滴剂可以包含无菌水或油性溶液或悬浮液。可以通过将活性成分溶解在杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它适合的防腐剂的水性溶液中并任选地包括表面活性剂，来制备它们。然后可通过过滤来澄清得到的溶液，转移至适当的容器并灭菌。灭菌可以这样进行高压灭菌或在90°C-100°C维持半小时，或者通过过滤，然后通过无菌技术转移至容器。适合于包含在滴剂中的杀菌和杀真菌剂的实例为硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002%)、苯扎氯铵(0.01%)和醋酸洗必泰(0.01%)0适合于制备油性溶液的溶剂包括甘油、稀释的醇和丙二醇。本发明的洗剂包括适合于应用至皮肤或眼的那些洗剂。眼的洗剂可以含有无菌水性溶液，其任选地含有杀菌剂，并且可以按类似于上文描述的与制备滴剂有关的方法来制备。应用至皮肤的洗剂或擦剂也可以包括加速干燥和冷却皮肤的试剂，例如醇或丙酮，和/或增湿剂如甘油，或油如蓖麻油或花生油。本发明的乳膏、软膏或贴剂为用于外部应用的活性成分的半固体制剂。它们可以通过将细粉或粉末形式的、单独的或溶液中的或水性或非水性液体悬浮液中的活性成分与油脂或非油脂主成分混合来制备。该主成分可以包含烃类如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；黏胶；天然来源的油如杏仁油、玉米油、落花生油、蓖麻油或橄榄油，羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸如硬脂酸或油酸连同诸如丙二醇或聚乙二醇的醇。该组合物可以并入任何适合的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包括助浮剂如天然胶、纤维素衍生物或无机材料如硅石，以及其它成分，如羊毛脂。也可以给予脂质体形式的组合物。脂质体通常衍生自磷脂或其它脂质，并且通过分散在水性介质中的单或多薄层含水液体结晶形成。可以使用任何能够形成脂质体的无毒、生理学上可接受的和可代谢的脂质。脂质体形式的组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质为磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，无论是天然还是合成的。形成脂质体的方法在本领域是已知的，对此可具体参考Prescott，Ed.，MethodsinCellBiology(细胞生物学方法),VolumeXIV,AcademicPress,NewYork,N.Y.(1976)，p.33etseq.，通过引用将其内容并入本文。剂量适合于用在本发明方法中的本发明组合物可以治疗性或预防性地作为组合物给药。在治疗性应用中，组合物被给予已经患有疾病或状况的患者，其量足以治愈或至少部分地阻止该疾病或状况及其并发症。该组合物应提供足以有效治疗该患者的量的药剂。对于任意特定患者的治疗有效剂量水平将依赖于多种因素，包括正治疗的病症和病症严重性；所采用的化合物或药剂的活性；所采用的组合物；患者年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；药剂或化合物的吸收率(rateofsequestration)；治疗持续时间；与该治疗组合或同时使用的药物，以及药学中公知的其它相关因素。本领域技术人员能够通过常规实验来确定治疗适当疾病所需的药剂或化合物的有效、无毒量。一般地，预期有效剂量范围为每kg体重每24小时约0.OOOlmg至约IOOOmg；典型地，每kg体重每24小时约0.OOlmg至约750mg；每kg体重每24小时约0.Olmg至约500mg；每kg体重每24小时约0.Img至约500mg；每kg体重每24小时约0.Img至约250mg；每kg体重每24小时约1.Omg至约250mg。更典型地，预期有效剂量范围为每kg体重每24小时约1.Omg至约200mg；每kg体重每24小时约1.Omg至约IOOmg；每kg体重每24小时约1.Omg至约50mg；每kg体重每24小时约1.Omg至约25mg；每kg体重每24小时约5.Omg至约50mg；每kg体重每24小时约5.Omg至约20mg；每kg体重每24小时约5.Omg至约15mg。可选择地，有效剂量可以多至约500mg/m2。一般地，预期有效剂量的范围为约25至约500mg/m2，优选约25至约350mg/m2，更优选地，约25至约300mg/m2，还更优选约25至约250mg/m2，甚至更优选约50至约250mg/m2，且还甚至更优选约75至约150mg/m2。在治疗性应用中，治疗一般在疾病状态或状况持续时进行。另外，对本领域普通技术人员显而易见的是，个体给药的最佳量和间隔将由正治疗的疾病状态或状况的性质和程度、给药形式、途径和部位、以及正治疗的特定个体的性质所决定。另外，这种最佳条件可以通过常规技术来确定。对本领域普通技术人员还显而易见的是，最佳的疗程，例如对于指定天数每天以组合物给药的次数，可以由本领域技术人员采用常规的疗程确定测试来确定。以下将参照具体实施例来描述本发明，这些实施例不应以任何方式理解为限制本发明的范围。实施例实施例1鉴定参与肥大细胞活化的含推定的SH2/SH3/PH结构域蛋白基于计算机的方法被用于鉴定活化的肥大细胞中编码细胞内信号产物的新基因。这通过就从静息和活化骨髓来源人肥大细胞获得的基因表达数据筛选编码SH2和/或SH3和/或PH结构域的基因而实现。按Liuetal.(J.AllergyClinImmunol118:496-503，(2006))中所述产生骨髓来源肥大细胞(BMMC)，从静息和IgE交联刺激的BMMC分离mRNA，并按Luietal.(JAllergyClinImmunol118:496_503，(2006))中阐释的Affymetrix标准操作进行基因表达阵列分析。采用用于基因序列扫描的基于LINUX的平台进行结构域序列查询，以鉴定BMMC表达的含SH2/SH3/PH结构域蛋白。在肥大细胞中被表达的近15000Affymetrix探针中，207个基因编码具有SH2、SH3和/或PH结构域的蛋白，其中的23个(11%)被发现在FcεRl交联后上调或下调。基于报道的基因序列特征和在其它细胞类型中的生物学功能，多个编码之前未被鉴定为肥大细胞IgE信号途径成员的分子的基因被认为可能在肥大细胞活化过程中起作用。其中，NEDD9(神经前体细胞表达的发育下调基因9)和PHLDAl基于它们的结构特征和生物学活性而被选择用于进一步的研究。实施例2:NEDD9和PHLDAl在肥大细胞活化中的作用(i)NEDD9，一种参与信号转导的高选择性锚定蛋白人NEDD9基因(神经前体细胞表达的发育下调基因9)(GenBank,IDsNM_006403.2和NM_182966.2，EnsemblID:ENSG00000111859,Entrez基因ID4739和UniprotIDQ14511)，也称为CasL(Crk相关底物淋巴细胞类型)和HEFl(人成丝增强子1)，编码表达未加工的834氨基酸前体蛋白。NEDD9含有SH3结构域和富含SH2结合位点的结构域。NEDD9同工型1具有UniProt识别号Q14511，与同工型CRA_b(UniProt识别号Q5T9R4)相同。NEDD9同工型1在位置10-64处具有SH3结构域，在位置633-656处具有CC基序，在位置92、166、177和189处具有三个磷酸化位点，并且在位置363处具有切割位点。同工型CRA_a(UniProt识别号Q5T9R4)也为834氨基酸蛋白，与同工型1的区别在于序列位置2、3和4。它属于Cas家族，如同所有的家族成员，以N末端SH3结构域为特征，该结构域包含对应REFSEQ登录号NM_006403.2(其为同工型1(Q14511))所定义的序列中残基7至66的60个氨基酸。它还含有包含多个可能的SH2结合位点的中心结构域和具有不同螺旋-环-螺旋(HLH)基序的C末端结构域。推测该SH2结合位点结合CRK、NCK和ABLSH2结构域。HLH基序赋予了与HLH蛋白ID2、E12和E47的特异相互作用。细胞周期调节的加工导致的翻译后修饰从同工型1产生了4种蛋白pll5、pl05、p65和p55。蛋白同工型1pll5产生于同工型1pl05磷酸化，在细胞周期中较晚出现。同工型1p55作为caspase切割相关位点处切割的结果产生于同工型1pl05，特定出现在有丝分裂中。人NEDD9基因转录本的剪接差异可以产生蛋白同工型2(UniProt:Q5XKI0)、同工型CRA_c(REFSEQ:EAW55302.1)和同工型CRA_d(REFSEQ:EAW55303.1)。HEFl蛋白同工型CRA_c包含800个氨基酸，类似于同工型1和CRA_a，差别在于中心富含SH2基序结构域中丢失了小量潜在的配体基序。CRA_d的转录本编码缺乏N末端SH3结构域的688氨基酸蛋白。相比之下，同工型2为仅174氨基酸蛋白，与HEFl同工型1的1至154N末端残基相同，基本上仅为SH3结构域和大大减少的SH2配体结构域。其它的人NEDD9编码蛋白变体列在UniProt数据库中，包括残基Pro-148后截短的蛋白(UniProt:Q5TI59)，其基本上是同工型2的稍稍缩小的形式。除了CRA_d同工型外，N末端SH3结构域存在于上文提到的每一NEDD9同工型中。NEDD9为参与细胞内信号传播的多功能锚定蛋白，在多种组织的细胞核、细胞质和如高尔基体和板状伪足的结构中被表达。NEDD9的SH3结构域(aa2-64)和卷曲螺旋(coiled-coil)结构域(aa633-656)赋予以高选择性与三种细胞表面受体下游信号转导分子Lck、Lyn和Fyn相互作用的可能性。其它的蛋白相互作用基序为富含丝氨酸结构域(aa400-558)和含螺旋-环-螺旋(HLH)基序的保守C末端结构域(aa710-760)。NEDD9的SH3折叠由成直角的两反向平行β片层组成。在该折叠内有两可变环，称为Rl^Pn-Src环。当SH3结合其配体时，富含脯氨酸配体采取聚L-脯氨酸II型螺旋构象，其中PPII螺旋结构被结合螺旋转角的SH3结构域表面上的一对凹槽所识别。该SH3凹槽由一系列几乎平行的、高度保守的芳香残基构成。已鉴定NEDD9与几种参与细胞信号转导的细胞内蛋白相互作用。表1描述了相互作用蛋白、相互作用类型和用于鉴定的实验方法。表1相互作用者名称实脸类型类型—ABL__体内、体夕卜__直接乳腺癌抗雌激素抗性3_jM__直接CRK__体内、体夕卜__直接CRK相关底物__体内、酵母双杂交__直接CRKL__体内、体夕卜__直接钙粘蛋白ι___直接CasL相互作用分子__体内、体外_直接胆碱乙酰转移醇____直接FAK_体内、体外、酵母双杂交直接DNA结合抑制剂2_体内、酵母双杂交__直接痒同源物E3泛素蛋白连接酵__体内、体外、酵母双杂交直接Lck____直接Lyn__体内__直接NCKl__体内、体夕卜__直接PTK2B蛋白酪氨酸激酶2β____直接桩蛋白(Paxillin)__^__直接蛋白酪氨酸碌酸酶非受体类型12____直接SH2D3CI体内、体外丨直接SHP2_I体内、体外_直接SMAD,母亲抗DPP同源物2(果蝇)体内直接SMAD3_体内、体外、酵母双杂交直接Sma和Mad相关蛋白1_体内、酵母双杂交__直接曱状腺激素受体相互作用者6__酵母双杂交__直接转录因子3__酵母双杂交__直接斑联蛋白_体内、体外、酵母双杂交直接成丝增强子1_体内、体外、酵母双杂交直接睾精子结合蛋白1酵母双杂交~HSA9761__酵母双杂交__直接Fyn__体内、体夕卜__直接i嘌呤核苷酸释放因子2I体内、体外I直接(ii)PHLDAl，一种参与受体结合下游细胞内信号的分子人PHLDAl基因(Entrez基因ID22822；Pleckstrin同源样结构域家族A成员1)，也称为TDAG51(T细胞死亡相关基因51)，编码表达5913核苷酸转录本，NCBIREFSEQ登录号NM_007350，有报道称cDNA序列可以翻译为401(REFSEQ:NP_031376)或400(REFSEQEAW97312.1)氨基酸的蛋白。PHLDAl基因编码蛋白的首选名称为Pleckstrin同源样结构域家族A成员1(PHLDAl)，具有UniProt识别号Q8WV24。PHLDAl在多种组织的细胞质、细胞质囊泡膜、细胞核和和核仁中被表达，以N末端pleckstrin同源或PH结构域为特征，该结构域包含对应REFSEQ登录号NP_031376所定义的序列中残基9至141的133个氨基酸。PHLDAl还含有15(脯氨酰谷氨酰胺酰_)重复序列，朝向C末端紧接有14(脯氨酰组氨酰_)重复序列。该PH结构域自身包括15(NP_031376)或14(EAW97312.1)残基聚(谷氨酰氨)元件。UniProt知识库中列出的蛋白没有翻译后修饰。UniProt知识库仅描述了圈定为变体的259氨基酸蛋白(Q8WV24)，在Entrez数据库中为PHLDAlCRA_a(例如REFSEQAAH18929.3、ΑΑΙ10821·1和ΑΙ26426.2)。该蛋白缺乏所预测的较长形式的N末端起的141残基序列，且与ΝΡ_031376的区别在于在PH结构域中聚(谷氨酰氨)重复序列开始处具有单谷氨酰氨残基缺失，在这种形式中其为14残基长度。蛋白名称PHLDAl—般指这种259残基的较短形式。预测cDNA序列(REFSEQ:AAI30428)编码312残基的蛋白，其PH结构域包括在残基62至194中。该PH结构域存在于以上描述的所有同工型中，并通常地包含约100个氨基酸。PH结构域具有由两垂直的反平行β片层和其后的C末端两亲螺旋构成的共同结构。连接β链的环在长度上有很大区别，使得PH结构域的检测相对困难。存在有pleckstrin同源样结构域家族A的三个成员，PHLDAl至PHLDA3，它们中的每一个在组成部分PH结构域的氨基酸序列上差异显著。PHLDAl不同于其它的A家族成员，因为其在环中包含了另外的43氨基酸插入，所述环包括聚(谷氨酰氨)元件。表2列出了一些已知与PHLDAl基因产物PHLDAl相互作用的分子，以及相互作用类型和用于鉴定的实验方法。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>实施例3=IgE刺激后人和小鼠肥大细胞的NEDD9的表达动力学在IgE刺激人和小鼠肥大细胞(衍生自人或小鼠骨髓干细胞)后评估NEDD9的表达动力学。让细胞与抗DNP/IgE单抗(10-500ng/ml)—起孵育2小时，并通过与DNP/白蛋白溶液(lOOng/ml)交联特定时长(O至4小时)进行FcεRI活化。采用用于两物种的NEDD9特异引物通过定量实时PCR测量基因表达，并采用相对定量的比较Ct法进行分析(参见LivakandSchmittgen,Methods25:402-408，(2001))。在人肥大细胞IgE交联后早期，NEDD9上调，2.5小时时达到峰值，5小时后下降至仅高于基线表达的稳态表达(图1A)。在人肥大细胞中也发现PHLDAl的表达水平应答IgE交联而上调，IgE刺激后5小时时达到峰值(图1B)。类似地，在小鼠肥大细胞IgE刺激后不久，观察到NEDD9和PHLDAl表达的早期上调，对于NEDD9在IgE刺激后1小时达到峰值，对于PHLDAl为30分钟，二者都在6小时前降至基线(图IC和图1D)。实施例4:RBL-2H3细胞中应答FcεRI交联和离子霉素刺激的NEDD9和PHLDAl表达动力学在表达FcεRI的大鼠肥大细胞系RBL-2H3细胞中评估NEDD9和PHLDAl的表达动力学。采用每一基因的特异引物通过基于SYBR绿的定量实时PCR测量基因表达。对每一引物采用三次重复来测定每一实验样品，包括用作内标的肌动蛋白特异引物。缺乏cDNA模板的阴性对照与每次测定一起进行以评估特异性。引物表达软件(AppliedBiosystems)被用于引物设计。对每一样品确定阈值循环数(Ct)。将终点时显示非特异产物的PCR测定排除在进一步的数据分析之外。采用比较Ct法的相对定量被用于结果分析(参见LivakandSchmittgen,Methods25402-408,(2001))。NEDD9和PHLDAl的表达应答通过FcεRI交联的细胞活化而显著上调(图2Α和图2C)。简言之，让5X106RBL-2H3细胞与抗DNP/IgE单抗(lOOng/ml)在补充了5%胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素的F15组织培养基中一起孵育2小时。接着以DNP/白蛋白溶液(lOOng/ml)交联FcεRI指定时长。FcεRI交联后的表达动力学分析显示两基因在刺激后早期发挥作用，提示其参与了调节导致肥大细胞活化的级联事件。尽管大多数的特异肥大细胞活化途径包括FcεRI结合的IgE在细胞表面上的聚集，但是肥大细胞也可通过各种手段活化，包括FcyR、Toll样受体(TLR)和其它IgE非依赖触发物。因此，评估了NEDD9和PHLDAl是否参与了除了产生自FcεRI交联的细胞内信号级联之外的其它细胞内信号级联。离子霉素为将钙从细胞外转移至细胞内空间的离子载体，其导致细胞内游离钙增加并随后刺激肥大细胞效应子功能，包括释放预先形成的颗粒内的内容物。让肥大细胞与1μM离子霉素一起孵育，通过QRT-PCR在不同时间点分析NEDD9和PHLDAl的表达水平。两种情况下，在所有分析的时间点都发现基因表达水平应答离子霉素而上调(30、60和120min)(图2B和图2D)。类似于通过FcεRI交联的活化，对应答离子霉素的表达动力学的分析显示NEDD9和PHLDAl在刺激后早期发挥作用，从而再次支持它们参与了调节导致肥大细胞活化的级联事件。实施例5体外和体内沉默NEDD9表达后增加的肥大细胞脱粒肥大细胞脱粒测定被用于评估沉默NEDD9表达是否能体外影响肥大细胞效应子功能。让RBL-2H3大鼠肥大细胞与DNP-IgE在3种不同的靶向NEDD9基因表达的siRNA存在下一起孵育30分钟，这些siRNA特异设计成干扰NEDD9表达。从AMBIONSilencerValidated(沉默子验证)siRNA购买siRNA，采用推荐的操作进行转染(www.ambion.com)。不靶向任何基因的其它SiRNA用作对照。与IgE/DNP孵育过夜后，通过以DNP/白蛋白偶联物交联活化FcεRI。然后通过己糖胺酶释放计算肥大细胞脱粒，并将其用作应答FcεRI交联的肥大细胞效应子功能的指示。如图3所示，与SiRNA阴性对照相比，通过siRNA抑制NEDD9蛋白表达导致肥大细胞脱粒百分比增加。然后采用被动皮肤过敏(PCA)反应体内评估减弱NEDD9和PHLDAl表达的作用。以NEDD9siRNAs或PHLDAlsiRNAs(来自AMBION的沉默子验证siRNA)与IgE-DNP的组合，在耳根部皮下注射Lewis大鼠。对照siRNA/DNP-IgE注射在左耳内。通过24小时后以DNP/白蛋白静脉内激发而诱导FcεRI交联。30分钟后通过Evan蓝恢复来测量耳肥大细胞脱粒。与以siRNA对照处理的左耳相比，对右耳的局部NEDD9或PHLDAlsiRNA给药导致增加的脱粒(图4A和图4B)。实施例6靶向NEDD9的SH3结构域的肽在体外和体内中和肥大细胞活化材料与方法⑴肽设计SH3结构域识别参与了组装细胞内信号复合物以及信号转导和细胞活化中的调节过程的富含脯氨酸线性基序。NEDD9的SH3结构域在跨越人至蝇类的物种中保守(同源基因(Hom0I0gene)NCBI和图5)，提示其在信号转导活性中的重要性。N末端SH3结构域的序列对应REFSEQ登录号NM_006403.2(HEF1同工型1UniProt:Q14511)定义的序列中的残基7至66。HEFl同工型1(UniProt:Q14511.1)的残基7-66，人NEDD9(Entrez基因ID4739)编码的N末端SH3结构域MARALYDNVP1(IECAEELAFRK2(IGDILTVIEQN3。TGGLEGffffLC40SLHGRQGIVP50GNRVKLLIGP60(SEQIDNO7)构建NEDD9竞争肽以特异破坏NEDD9SH3结构域与靶配体的结合。在AustralianNationalUniversityAustralianCancerResearchFoundationBiomolecularResourceFacility(澳大利亚国立大学澳大利亚癌症研究基金会生物分子资源研究室)化学合成肽。采用标准Fmoc(9-芴甲氧羰基)方法在Symphony肽合成仪(RaininInstrumentCompanyOaklandCA)上进行Rink树脂(4_(2，，4，_二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)-苯氧基聚苯乙烯)上的固相合成，并通过反相HPLC纯化。对纯化产物的鉴定通过质谱学来证实。构建了20聚体肽(MDDl)，其对应于图5中显示的NEDD9SH3结构域的人序列(HS)的残基3-22。该肽MDDl被首先选来用于活性测试，因为其包括SH3结构域的RT(可变)环中的带负电残基簇。通过针对所有物种的肽blast证实了该MDDl肽为NEDD9特异的。MDDl的序列在包括智人、小家鼠、褐家鼠、黑猩猩、欧洲牛、家犬和红原鸡在内的哺乳动物以及红原鸡中是保守的(图5-参见突出显示的序列)。也合成在错义序列(scrambledsequence)中含有相同氨基酸的肽(MDDlsraam)来确定保持天然序列的必要性。将它们合成为N-乙酰基α-羧胺的形式以抑制末端离子化和被外肽酶降解。也生成生物素化的形式。以下详细列出这些肽序列MDDl肽RALYDNVPECAEELAFRK⑶(SEQIDNO:8)MDDlscramEALPGEDCAFRKDANRLVEY(SEQIDNO9)也合成两另外的类似物，MDD1S10和MDD1A10，二者缺乏位置10处的半胱氨酸残基。(ii)MDDl被RBL-2H3摄取让RBL-2H3细胞在补加了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的F15培养基中生长。用细胞刮刀小心地从培养瓶剥离细胞并以5XIO5细胞/孔的浓度接种在96孔微量滴定板中。细胞与各种浓度的生物素化MDDl(0.lmM、0.OlmM和0.OOlmM)一起孵育过夜。根据制造商的说明(BectonDickinson,BD)，采用链霉亲和素-APC在经组合的cytofix/cytoperm固定和透化溶液试剂盒预先处理的单细胞悬浮液中检测肝细胞对生物素化MDDl的摄取。然后采用BDFACscan流式细胞仪分析细胞。(iii)RBL-2H3脱粒测定采用β-己糖胺酶释放法测量肥大细胞脱粒。让RBL-2H3细胞在补加了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的F15培养基中生长。用细胞刮刀小心地从培养瓶剥离细胞，以5Χ105细胞/孔的浓度接种在96孔微量滴定板中，并在MDDl或SCR肽存在下孵育过夜。然后让RBL-2H3细胞与500ng/ml抗DNPIgEmb(SIGMA)37°C孵育2小时。洗涤后，以100ng/mlDNP/白蛋白刺激细胞30分钟。对于非IgE特异刺激，仅将InM离子霉素添加至培养物30分钟。接着收集上清液，并采用0.1%TritonX_100制备细胞裂解液。将裂解液和上清液样品(10μ1)转移至96孔板，向每孔添加50μ1的含ImM对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷的50mM柠檬酸盐缓冲液，并在黑暗中37°C孵育1小时。通过向每孔添加100μ10.IMNaHCO3A).IMNa2CO3而终止反应，在405nm处测量吸收值。通过下式计算脱粒百分比OD上清液/(0D上清液+OD裂解液)X100。(iii)OVA诱导的哮喘模型用含IOyg卵清蛋白抗原(OVA)的盐水腹膜内致敏C57BL/6小鼠，隔日给药，共7次。首次致敏给药后40天，用鼻内OVA(每鼻孔20μ1的5mg/mlOVA盐水溶液)激发小鼠。小鼠在第一次以OVA激发后的第3和第6天再接受两次鼻内OVA激发。对照小鼠以OVA致敏，但是以盐水鼻内激发。接受胃肠外MDDl治疗的小鼠组静脉内注射8mg/Kg的MDDl共3次，在每次OVA激发前的6小时进行。雾化的MDDl或MDDseram(SCR)肽在每次OVA激发前6小时给予，其通过以8ml的lmg/mlMDDl或对照肽让每笼5只小鼠雾化吸入。在最后的OVA激发后1天进行肺功能分析和器官收集。在增加β-乙酰甲胆碱剂量后，在麻醉的小鼠中测量肺阻力。通过手术暴露气管，插入导管并连接至啮齿动物呼吸机(flexivent；Scireq)。让小鼠稳定，以盐水气雾剂激发，接着增加乙酰甲胆碱的浓度。采用Buxco提供的设备和软件，通过体积描记术测量肺阻力。肺阻力值表示为针对每一乙酰甲胆碱剂量的每组小鼠的均值。对于每只小鼠，通过对每一乙酰甲胆碱剂量计算收集数据(每5秒1次，持续5分钟)的均值来计算各个值。免疫染色，细胞因子表达制备血涂片，并通过May-GrtowaldGiemsa染色后的形态学标准计算嗜酸性细胞百分比。通过气管插管术在轻轻按摩胸腔的同时以ImlHANKS溶液灌洗气道两次，来重获支气管肺泡灌洗液(BAL)。收集肺左下叶并勻浆。通过细胞过滤网过滤细胞并在染色培养基(PBS，含1%FCS)中制备细胞悬浮液。让BAL和肺样品与抗⑶lib、抗CCR3、抗⑶4和抗B220单抗标志物一起孵育，用于采用配备了CellQuest软件的FACScan进行流式细胞术分析。收集肺右上叶并在冰上勻浆。采用Trizol(GIBCO，Invitrogen)制备总RNA。RNA的纯度通过A260/A280来确定。采用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen)将每一样品的5ygRNA逆转录为cDNA。细胞因子特异的预设计TaqMan基因表达测定(AppliedBiosystems)被用于测量细胞因子相对基因表达，其按制造商的说明进行(AppliedBiosystems)。每一实验样品以三次重复进行测定。肌动蛋白特异的引物用作内标。无空cDNA模板的阴性对照与每次测定一起操作以评估特异性。循环条件如下95°C10分钟1个循环，接着是PCR扩增的40个循环，每一个循环由95°C15秒和60°C45秒构成。序列检测软件(SDSν1.2.2,AppliedBiosystems)被用于结果分析。为每一样品确定阈值循环数(Ct)。将终点时显示出非特异产物的PCR测定排除在进一步的数据分析之外。采用比较Ct法的相对定量被用于结果分析。结果表示为相对于未过敏小鼠的值的相对倍数变化。血清Ig水平OVA特异的IgE检测在4°C用抗小鼠IgE包被96孔maxisorp板过夜。2%脱脂乳被用于非特异结合封闭。将预先稀释的血清样品孵育过夜，让板负载OVA-生物素1.5小时并采用ABTS按制造商的说明显示比色反应。对于OVA特异的IgG，用0.2%戊二醛预处理96孔maxisorp微量滴定板，并以含10μg/mlOVA的IOmM碳酸盐缓冲液(pH9.6)在37°C包被3小时。在加湿室内以含2%BSA的IOmM碳酸盐缓冲液(pH9.6)在4°C封闭孔过夜。血清样品于37°C孵育1小时。相继将过氧化物酶偶联的抗大鼠IgG和ABTS用于显示比色反应。采用405nm滤色片读取酶标板中的光密度。IgE和IgG的水平表示为OD单位。小鼠中的被动皮肤过敏测定(PCA)左耳以DMSO处理，右耳以含0.2%MDDl或含0.1%地塞米松的DMSO处理，每天两次，持续4天。然后以抗DNP致敏小鼠-采用胰岛素注射器通过皮内注射将20μ1IgE抗体给予耳部。通过应答注射后24小时FcεRI交联的染色恢复来测量局部肥大细胞活化静脉内注射含100μgDNP-白蛋白/1%Evans蓝的PBS，并将30分钟后取得的耳活检组织于80°C在Iml甲酰胺中孵育2小时。在620nm测量上清液吸收值。结果(i)MDDl肽在体外有生物学活性发现MDDl肽渗入细胞膜。MDDl肽直接偶联至生物素并给予至RBL-2H3肥大细胞。MDDl肽摄取通过采用将链霉亲和素APC用作荧光染料的细胞内FACS染色来检测。所有的细胞都对MDDl肽呈阳性，并且观察到水平随肽浓度增加(图6)。(ii)MDDl肽抑制IgE受体交联后RBL-2H3细胞内的脱粒观察到MDDl肽(SEQIDNO8)在IgE受体交联后以及非特异刺激后(数据未示出)抑制肥大细胞活化。未经MDDl肽预处理的RBL-2H3细胞在IgE受体交联后脱粒(图7)。但是，观察到以MDDl肽预处理RBL-2H3细胞会抑制IgE受体交联时的脱粒(图7)。以错义肽MDDlseram(SEQIDNO9)预处理RBL-2H3细胞仅对IgE受体交联后的脱粒有较次要的抑制作用(图7)。(iii)MDDl肽改善以β-乙酰甲胆碱激发后OVA致敏小鼠中的肺功能在肥大细胞活化驱使的小鼠哮喘模型中测试MDDl肽在控制哮喘反应中的功效。这种模型中的肺炎症和哮喘反应依赖于肥大细胞活化，因为无肥大细胞的小鼠不出现这种疾病。与以对照肽处理的小鼠相比，在接触抗原时以MDDl处理的OVA致敏小鼠在β-乙酰甲胆碱激发后具有改善的肺功能(图8)。在增加β-乙酰甲胆碱剂量后测量以MDDl肽或对照(SRC)肽处理的OVA致敏小鼠的肺阻力。与以对照肽处理的小鼠相比，以MDDl肽处理的小鼠肺阻力(RL)减小。当肽静脉内给予(图8Α)或采用雾化的鼻内途径局部给予肺(图8β)时观察到这种作用。(iv)MDDl肽减弱以β-乙酰甲胆碱激发后OVA致敏小鼠哮喘反应期间的炎性反应MDDl肽减弱哮喘反应中的总体炎性反应，这通过与对照处理的小鼠相比减少的血液中嗜酸性粒细胞增多(图9α)、支气管肺泡灌洗液中的细胞结构(图9β)、炎性病灶中的细胞因子产生(图9CA)和过敏小鼠血清中抗原特异的IgE水平(图9D)来证实。在一些测试的参数中MDDl肽表现好于地塞米松治疗(2mg/kgi.p.)(图9)。(ν)局部给予MDDl肽减弱变应性反应特应性皮炎和其它变应性皮肤状况被认为是肥大细胞反应所驱动的。局部给予MDDl肽被证实会稳定皮肤肥大细胞。在以抗DNPIgE抗体IgE局部致敏之前，将0.2%MDDl肽/DMSO制剂局部涂至每只小鼠的一耳。来自经MDDl肽/DMSO处理耳的活检组织中的肥大细胞被发现在IgE受体交联后具有降低的活化水平，这通过与仅以DMSO处理的对侧耳相比的染料外渗来确认(图10)。MDDl局部起作用，具有最小的全身效应，而局部地塞米松处理导致全身免疫抑制。实施例7=PHLDAl基因产物的PH结构域的肽竞争者中和肥大细胞活化材料与方法⑴肽设计PHLDAl的PH结构域包含133个氨基酸，范围为REFSEQ登录号ΝΜ_006403.2定义的序列中氨基酸残基9至141。该序列在哺乳动物中是高度保守的。该PHLDAlPH结构域包括大环插入序列，其如以下所示(参见加粗斜体序列残基37至79)。PHLDAl(UniProt:Q8WV24.1)的残基9-141，人PHLDAl(Entrez基因ID22822)编码的ph结构域AlkegvlekriqSdgllqlwkk20kccilteegl30llippkqlqh40QQQQQQQQQQsoqqqqpgqgpa6oepsqpsgpav70asleppvklk肌Elhfsnmktv90Dcverkgkym100Yftvvmaegk110εidfrcpqdq120gwnaeιTlqm130vqy(seqidno:10)两人同工型中以及哺乳动物物种之间的序列变异位于聚(谷氨酰胺)元件侧翼，并且均聚序列的长度也是可变的。为了特异干扰PHLDAl的PH结构域的活性，设计并合成了两竞争肽序列(MPX741、MPX742和MPX743)。竞争肽的设计基于聚(谷氨酰胺)重复元件上游(即N-末端)和下游(即C末端)的序列。MPX741对应于聚(谷氨酰胺)元件N末端的序列(预测的用于磷脂酰脂质的结合位点)，MPX742对应于大概位于PHLDA1PH结构域中心的序列，而MPX743对应于聚(谷氨酰胺)元件C末端序列。将这些肽合成为N-乙酰基α-羧胺的形式以抑制末端离子化和被外肽酶降解。以下详细列出这些肽。ΜΡΧ741KRSDGLLQLWKKKCCILTEEGLLLIPPK(SEQIDNO11)ΜΡΧ742LEPPVKLKELHFSNMKTVD(SEQIDNO12)ΜΡΧ743PQDQGffNAEITLQMVQY(SEQIDNO13)ΜΡΧ741对应SEQIDNO11所示的PH结构域的残基9至36，其组成氨基酸中的15个与其它PHLDA家族成员的PH结构域存在差异。MPX742对应SEQIDNO12所示的PH结构域的残基73至91，其组成氨基酸与其它PHLDA家族成员的PH结构域仅共有4氨基酸。MPX742的N末端5氨基酸对应独特的PHLDAl环插入序列的C末端(这为PHLDAl的PH结构域所特有)。MPX743对应SEQIDNO:13所示的PH结构域的残基117至130，其组成氨基酸与其它PHLDA家族成员的PH结构域有11氨基酸的差异。在AustralianNationalUniversityAustralianCancerResearchFoundationBiomolecularResourceFacility(澳大利亚国立大学澳大利亚癌症研究基金会生物分子资源研究室)化学合成肽。采用标准Fmoc(9-芴甲氧羰基)操作在Symphony肽合成仪(RaininInstrumentCompanyOaklandCA)上进行Rink树月旨(4-(2，，4，-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)-苯氧基聚苯乙烯)上的固相合成，并通过反相HPLC纯化。对纯化产物的鉴定通过质谱学来证实。(ii)RBL-2H3脱粒测定采用β-己糖胺酶释放法测量肥大细胞脱粒。让RBL-2H3细胞在补加了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的F15培养基中生长。用细胞刮刀小心地从培养瓶剥离细胞，以5Χ105细胞/孔的浓度接种在96孔微量滴定板中，并在ΜΡΧ741肽或ΜΡΧ742肽存在下孵育过夜。然后让RBL-2H3细胞在37°C与500ng/ml抗DNPIgEmb(SIGMA)一起孵育2小时。洗涤后，以lOOng/mlDNP/白蛋白刺激细胞30分钟。对于非IgE特异刺激，仅将InM离子霉素添加至培养物30分钟。接着收集上清，并采用0.1%TritonX_100制备细胞裂解液。将裂解液和上清液样品(10μ1)转移至96孔板，向每一孔添加50μ1的含ImM对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷的50mM柠檬酸盐缓冲液，并在黑暗中于37°C孵育1小时。通过向每一孔添加100μ10.IMNaHC03/0.IMNa2CO3而终止反应，在405nm处测量吸收值。通过下式计算脱粒百分比0D上清液/(OD上清液+OD裂解液)X100。结果(i)MPX741和MPX742中和肥大细胞活化观察到MPX743(SEQIDNO13)溶解性差，因此在进一步测试前需要进行修饰。证实MPX741(SEQIDNO11)和MPX742(SEQIDNO12)显著减弱IgE受体交联后的脱粒(图11)。因此，以MPX741或MPX742处理RBL-2H3细胞会显著抑制肥大细胞活化。实施例8另外的NEDD9SH3结构域竞争肽在本文中肽MDDl被证实为肥大细胞活化的抑制剂，因此给予该肽提供了治疗和/或预防超敏反应的手段。如上文实施例6中所描述的，MDDl为对应NEDD9SH3结构域的人序列(显示在图5中)的残基3-22的竞争肽。涉及通过修饰MDDl肽中的一个或多个氨基酸残基而产生的变体将在很多情况下能仿效或改善该肽的一种或多种性能，例如使肥大细胞脱敏的能力、溶解性、化学和生物学稳定性、细胞摄取、毒性、免疫原性和降解产物的排泄。通过鉴定MDDl肽序列中可能为一种或多种特定目的性能的负面或正面决定基的一个或多个特定氨基酸，来设计具有类似或改善性能的MDDl肽的变体。可采用类似于以上实施例6中描述的方法以及本领域公知的其它方法来测试那些MDDl肽变体的功能活性。例如，侧链截断可用于以丙氨酸沿MDDl肽的序列一次置换一个氨基酸(例如Gautametal.1995,"Bindingofaninvariant-chainpeptide,CLIP,toI-AmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules(恒定链肽CLIP与I-A组织相容性复合物II类分子的结合)”procNatlAcadSciUSA,92:335_9中描述的)。待通过这种方法测试的MDDl肽变体包括示于SEQIDNOs33-49中的那些序列。另外，丙氨酸可沿MDDl肽置换多个残基，特别是存在带负电残基的位置(参见SEQIDN0s:24-26)。还涉及增加或减小MDDl肽的长度也将在很多情况下能仿效或改善该肽的一种或多种性能。因此将采用本文描述的方法和/或本领域公知的其它方法测试减小长度的MDDl变体对肥大细胞活化和超敏性的作用。这类MDDl肽变体的示例性序列示于SEQIDNOs18-19和122-144)。设计了并将测试其它的MDDl肽变体，这些变体包括MDDl肽序列的10位半胱氨酸残基被丝氨酸(SEQIDNO16)或丙氨酸(SEQIDNO17)置换的那些。还采用SEQIDNOs20-23和145-184所示的序列测试在残基10处包含丝氨酸或丙氨酸置换的MDDl肽的长度变体(即SEQIDN0:16禾口SEQIDN0:17的长度变体)。另外，根据SEQIDNOs:90_121所示的序列，将测试具有10位半胱氨酸残基置换(如SEQIDNO16或SEQIDNO:17中)以及沿该链其它一个或多个残基处的单/多丙氨酸置换的其它系列的MDDl变体肽。还涉及对应全长NEDD9SH3结构域(SEQIDNO7)以及NEDD9SH3结构域中其它特定区域的竞争肽将能够调节肥大细胞活化，因此影响到超敏反应。采用类似于上文实施例6中描述的方法和/或本领域公知的其它方法测试一系列重叠的20聚体肽(SEQIDNOs14、15和185-225)和12聚体肽(SEQIDNOs:226_273)。那些肽的具有沿该链的单/多丙氨酸置换的变体包括具有SEQIDNOs50-89)所示序列的变体。对应于NEDD9SH3结构域(及其变体)的至少一部分的示例性肽序列示于SEQIDNOs:14-273，将合成它们并测试对肥大细胞活化的作用/对超敏反应的影响。实施例9衍生自NEDD9SH3结构域的其它竞争肽肽MPX741和MPX742在本文中被证实为肥大细胞活化抑制剂，因此给予这些肽提供了治疗和/或预防超敏反应的手段。如在上文实施例7中描述的，MPX741和MPX742为分别对应PHLDAlPH结构域的人序列PH结构域的残基9_36和残基73-91的竞争肽。涉及通过修饰MPX741和MPX742肽之一中的一个或多个氨基酸残基而产生的变体将在很多情况下能仿效或改善该肽的一种或多种性能，例如使肥大细胞脱敏的能力、溶解性、化学和生物学稳定性、细胞摄取、毒性、免疫原性和降解产物的排泄。通过鉴定MPX741和MPX742肽序列中可能为一种或多种特定目的性能的负面或正面决定基的一个或多个特定氨基酸残基，来设计具有类似或改善性能的MPX741和MPX742肽的变体。可采用类似于以上实施例6中描述的方法以及本领域公知的方法来测试这些MPX741和MPX742肽变体的功能活性。例如，侧链截断可用于以丙氨酸沿MPX741和MPX742肽的序列一次置换一个氨基W.(M女口Gautametal.1995,"Bindingofaninvariant-chainpeptide,CLIP,toI-AmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules(恒定链妝CLIP与I-A组织相容性复合物II类分子的结合)"procNatlAcadSciUSA,92:335_9中描述的)。待通过这种方法测试的MPX741和MPX742肽变体包括示于SEQIDNOs274-320的那些序列。另外，丙氨酸可沿MPX741和MPX742肽置换多个残基，特别是存在带负电残基的位置。还涉及增加或减小MPX741和MPX742肽的长度也将在很多情况下仿效或改善该肽的一种或多种性能。因此将采用本文描述的方法和/或本领域公知的其它方法测试减小长度的MPX741和MPX742变体对肥大细胞活化和超敏性的作用。这类MDDl肽变体的示例性序列示于SEQIDNOs:321-374。还涉及对应全长PHLDAlPH结构域(SEQIDNO:10)以及PHLDA1PH结构域中其它特定区域的竞争肽将能够调节肥大细胞活化，因此影响到超敏反应。采用类似于上文实施例6中描述的方法和/或本领域公知的其它方法测试一系列重叠的20聚体肽(SEQIDNOs14、15和185-225)和12聚体肽(SEQIDNOs=375-488)。也将测试这些肽的具有沿该链的单/多丙氨酸置换的变体。对应于PHLDAlPH结构域的示例性肽序列(及其变体)示于SEQIDNOs=274-488,将合成它们并测试其对肥大细胞活化/超敏性的作用。实施例10组合物(i)可注射的胃肠外组合物可通过将0.005mg至5g的再一种适合的药剂或本发明的化合物混合进10%体积比的丙二醇和水中，来制备适合于注射给药形式的本发明药物组合物。(ii)用于口服给药的组合物可以通过将0.005mg至5g的粉末形式药剂或化合物、IOOmg乳糖、35mg滑石粉和IOmg硬脂酸镁填充进标准的两件式硬明胶胶囊，来制备胶囊形式的本发明的再一种适合的药剂或本发明的化合物的组合物。(iii)吸入给药的组合物对于容量20_30mL的气雾剂容器将0.005mg至5g的再一种适合的药剂或本发明的化合物、0.5-0.8%重量比的润滑剂如聚山梨醇酯85或油酸的混合物分散在诸如氟利昂的推进剂中，并将其装入适当的气雾剂容器中用于鼻内或口腔吸入给药。权利要求调节肥大细胞活化的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。2.如权利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸。3.如权利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDNO:8或SEQIDNOs14-273中任一所示的氨基酸。4.如权利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDN0:11或SEQIDNO:12所示的氨基酸。5.如权利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDN0:10或SEQIDNOs:274_488中任一所示的氨基酸。6.抑制或预防个体中肥大细胞活化的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的蛋白，所述蛋白包含以下中的至少一种(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽。7.如权利要求6所述的方法，其中所述肥大细胞活化为IgE介导的。8.如权利要求6所述的方法，其中所述肥大细胞活化为非IgE介导的。9.治疗或预防个体中超敏疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的蛋白，所述蛋白包含以下中的至少一种(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽。10.如权利要求9所述的方法，其中所述超敏疾病或病症包括肥大细胞活化。11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述超敏疾病或病症包括炎性反应。12.如权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述超敏疾病或病症选自过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及呼吸疾病和病症。13.如权利要求12所述的方法，其中所述呼吸疾病或病症选自哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(C0PD)。14.调节个体中免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的蛋白，所述蛋白包含以下中的至少一种(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽。15.如权利要求6至14中任一项所述的方法，其中所述蛋白为NEDD9。16.如权利要求6至14中任一项所述的方法，其中所述蛋白为PHLDA1。17.抑制或预防个体中肥大细胞活化的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。18.治疗或预防个体中超敏疾病或病症的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。19.如权利要求18所述的方法，其中所述超敏疾病或病症包括肥大细胞活化。20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述超敏疾病或病症包括炎性反应。21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述超敏疾病或病症选自过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及呼吸疾病和病症。22.如权利要求21所述的方法，其中所述呼吸疾病或病症选自哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(C0PD)。23.调节个体中免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的肽，所述肽包含对应以下结构域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域。24.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述肽包含SEQIDNO7所示的氨基酸序列。25.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述肽包含SEQIDNO8所示的氨基酸序列。26.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述肽包含SEQIDN0:11所示的氨基酸序列。27.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述肽包含SEQIDNO12所示的氨基酸序列。28.抑制肥大细胞活化的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)结构域之一或二者与肥大细胞受体的结合。29.治疗或预防个体中超敏疾病或病症的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)结构域之一或二者与肥大细胞受体的结合。30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述抑制包括给予包含对应NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域或PHLDA1蛋白pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列的肽。31.如权利要求30所述的方法，其中所述对应NEDD9蛋白Src同源3(SH3)结构域的至少一部分的肽包含SEQIDN0:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。32.如权利要求30所述的方法，其中所述对应PHLDA1蛋白pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的肽包含选自SEQIDN0:10、SEQIDN0:11和SEQIDN0:12的氨基酸序列。33.包含(i)Src同源2(SH2)结构域，(ii)Src同源3(SH3)结构域，(iii)pleckstrin同源(PH)结构域，(iv)权利要求1-5中任一项所述的肽中的至少一种的蛋白在制备用于治疗超敏疾病或病症的药物中的用途。34.如权利要求33所述的用途，其中所述蛋白为NEDD9。35.如权利要求33所述的用途，其中所述蛋白为PHLDA1。36.包含对应(i)Src同源3(SH3)结构域，或(ii)pleckstrin同源(PH)结构域的至少一部分的氨基酸序列的肽在制备治疗超敏疾病或病症的药物中的用途。37.如权利要求36所述的用途，其中所述肽包含选自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDN0:11、SEQIDNO:12的氨基酸序列。38.如权利要求33至37中任一项所述的用途，其中所述超敏疾病或病症选自过敏反应、药物反应、皮肤变应性、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特应性皮炎、变应性接触过敏、食物变应性、变应性结膜炎、昆虫毒液变应性以及呼吸疾病和病症。39.如权利要求38所述的用途，其中所述呼吸疾病或病症选自哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(C0PD)。40.鉴定调节包含Src同源2(SH2)结构域、Src同源3(SH3)结构域或pleckstrin同源(PH)结构域中的至少一种的蛋白的活性的试剂的方法，所述方法包括(a)使候选试剂与所述蛋白在适合于允许所述候选试剂与所述蛋白相互作用的条件下接触；以及(b)测定所述蛋白的活性。41.筛选多种候选试剂以鉴定调节包含Src同源2(SH2)结构域、Src同源3(SH3)结构域或pleckstrin同源(PH)结构域中的至少一种的蛋白的活性的试剂的方法，所述方法包括(a)使多种候选试剂与所述蛋白在适合于允许所述候选试剂与所述蛋白相互作用的条件下接触；以及(b)测定所述蛋白的活性。42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述蛋白为NEDD9或PHLDA1。43.如权利要求40至42中任一项所述的方法，其中测定所述蛋白的活性包括测量肥大细胞活化的水平。44.如权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述候选试剂为所述蛋白的激动剂。45.如权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述候选试剂为所述蛋白的激动剂。全文摘要本发明涉及调节免疫反应的肽，所述肽包含对应于Src同源3(SH3)结构域、Src同源2(SH2)结构域或pleckstrin同源(PH)结构域之一的至少一部分的氨基酸序列。文档编号C07K14/435GK101835799SQ200880113181公开日2010年9月15日申请日期2008年8月25日优先权日2007年8月24日发明者大卫·利纳瑞斯·般丁,彼得·J·米尔伯恩,迭戈·席尔瓦申请人:麦莱克萨有限公司