专利名称：：使用固相和溶液相组合技术的促胰岛素肽合成法的制作方法使用固相和溶液相组合技术的促胰岛素肽合成法本发明涉及使用固相和溶液相方法制备促胰岛素肽(insulinotropicpeptide)，尤其艾塞那肽(exenatide)及其对应物的方法。本发明进一步涉及可在这些方法中使用的中间肽片段。在文献中描述了许多肽合成方法(例如，见美国专利号6，015，881；Mergler等人，(1988)TetrahedronLetters(四面体快报)29:4005_4008;Mergler等人，(1988)TetrahedronLetters(四面体快报)29:4009_4012;Kamber等人，(主编)，Peptides,ChemistryandBiology(肽，化学与生物学)，ESCOM，Leiden(1992)525-526;Riniker等人，(1993)TetrahedronLetters(四面体快报)499307-9320；Lloyd-ffiIliams等人，(1993)TetrahedronLetters(四面体快报)4911065-11133；和Andersson等人，(2000)Biopolymers(生物高分子)55:227_250。不同合成方法通过其中发生合成的相的物理状态来区分，即，液相或固相。在固相肽合成法(SPPS)中，氨基或肽基结合于固体支持物树脂。然后连续的氨基酸或肽基附着于支持物结合的肽直至形成目标肽物质。然后支持物结合的肽典型地从该支持物上裂解下来并进行进一步加工和/或纯化。在一些情况下，固相合成生成成熟肽产物；在其他情况下，从支持物上裂解的肽(即，“肽中间片段”)用于制备更大的成熟肽产物。由固相方法生成的肽中间片段可在固相或在液相合成方法(本文中称为“溶液相合成(solutionphasesynthesis)")中偶联在一起。溶液相合成可具体用于通过固相合成有用的成熟肽是不可能的或不实际的情况下。例如，在固相合成中，较长的肽最终可能采取不规则的构象，而仍然附着在固体支持物上，使得难以向生长链添加另外的氨基酸或肽物质。由于肽在支持物树脂上变得更长，加工步骤诸如偶联和脱保护的效率可能会降低。这，随之，除了增加起始物质诸如可活化的氨基酸、共试剂(co-reagent)和溶剂的损失以夕卜，可导致较长的加工时间来弥补这些问题。这些问题可随着肽的长度增加而增加。因此，找到仅使用固相步骤以单个片段合成的长度大于30个氨基酸的成熟肽是相对少见的。然而，各个片段可单独地在固相上合成，并然后在固相和/或溶液相中偶联以构建所需的肽产物。此途径需要细心地选择片段候选物。尽管一些一般原理可指导片段选择，但常常需要对片段候选物的经验性测试。在一种情况下能起作用的片段策略可能在其他情况下不能起作用。即使当发现适当的片段候选物时，对于合成策略仍然需要工艺的革新从而在商业上合理的条件下工作。因此，使用混合方案的肽合成经常是具有挑战性的，并且在许多情况下，难以预测合成方案中固有的问题直至进行实际的合成。在溶液相偶联中，两个肽中间片段，或一个肽中间片段(或“片段”)和反应性氨基酸在适当的溶剂中，通常在另外的促进偶联反应的效率和质量的试剂的存在下偶联。肽中间片段(或“片段”)反应性地排列，使得一个片段的N-末端变为与另一片段的C-末端偶联，或反之亦然。另外，在固相合成期间内存在的侧链保护基团通常在溶液相偶联期间内保持在片段上，以确保所述片段末端的特异反应性。这些侧链保护基团典型地不被去除直至形成成熟肽。总合成方案中的一个或多个步骤的适度改进可以意味着成熟肽的制备中的显著改进。这样的改进可总体上极大地节省时间和试剂，并且还可显著地提高最终产物的纯度和产率。对于此混合途径，正确选择化学策略是必需的，因为由于被完全保护的片段的溶解性差以及在溶液相偶联中容易发生差向异构化，使得该方法存在明显的缺陷。尽管对混合合成中改进的重要性的讨论适用于使用这些步骤生产的任意肽，但是其在治疗有效的和以用于商业医疗应用的规模制造的肽的情况下特别重要。较大生物分子药物诸如治疗性肽的合成，可以是非常昂贵的。除了其他因素以外，由于试剂成本、合成时间、众多合成步骤，这些较大生物分子药物的合成工艺中非常小的改进就可对是否在经济上可行地生产此类药物具有显著的影响。由于对于较大生物分子药物的高生产成本，这些改进是必需的，这一观点得到下列事实的支持，即，在许多情况下，存在很少，即便有，关于这些类型的较大生物分子药物的合适的治疗备选方案。这在促胰岛素肽诸如艾塞那肽及其功能性对应物的情况下显而易见。此类肽是治疗2型非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖症的治疗剂。该肽改善内源性胰岛素的初始快速释放，抑制胰腺释放胰高血糖素，调节胃排空，并且降低食欲_所有这些起降低血糖的作用。艾塞那肽是自调节的，即当水平升高时降低血糖，但当水平恢复至正常水平时不再继续降低血糖。天然艾塞那肽分离自希拉毒蜥(Gilamonster)，并且其长度为39个氨基酸残基。艾塞那肽的分子量为4186.6道尔顿(Dalton)。天然艾塞那肽，当通过合成而生成时被称为毒蜥外泌肽-4(exendin-4)，其以BYETTA的商品名在商业上销售，并且可表示为符号艾塞那肽(exenatide)(1-39)。此符号表明该肽具有从1(N-末端)至39(C-末端)的所有氨基酸。艾塞那肽具有根据SEQIDNO.1的氨基酸序列Hisl-Gly2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Leuio-Serll-Lys12-Gln13-Met14-Glu15-Glu16-Glu17-Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-GIy3o-Pro3i-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39在艾塞那肽的固相和溶液相合成中关键的挑战涉及在15、16和17位中的三个谷氨酸残基的序列。实际上，象这样在序列中具有至少两个谷氨酸残基的任意肽都将遇到这样的挑战。具体来说，难以化学合成非常远离这些谷氨酸残基的肽片段。不希望受理论的约束，重复Glu序列倾向于产生在固相中扭曲的片段部分。这使得相对难以有效地通过该Glu链继续生成片段尺寸。在常规的实践中，作为实际情况，具有两个或多个重复Glu残基的序列的片段可能仅能够在上游(朝向C末端)和/或下游(朝向N末端)具有1-3个氨基酸。该问题往往在该重复Glu链的下游更严重。这常常可能意味着在固相中生长的含有重复Glu残基的序列的肽片段往往相对短。在艾塞那肽的情形中，这个问题已经影响了固相片段策略。在一种情况下，片段断裂点可能位于Glu序列内，使得一个片段仅包括一个Glu残基。然而，此策略，在艾塞那肽背景下，仍然保留另一个具有两个连续的Glu残基的片段，并且在这些片段在溶液相中偶联之前可以至少在固相中的4片段合成策略。备选地，所有三个Glu残基可包括在一个片段中。然而，使用常规策略，这可能意味着在将第三个Glu残基添加到构建中的片段上后，可能只有向该片段添加Met、Met和Gln，或可能是Met，Gln和Lys残基是实际的，由此剩余的残基以单独的肽片段组装。此外，在片段在溶液相中偶联之前，这可以指示在固相中的4片段合成策略。尽管四片段合成途径在一些情况下可能是理想的，但重复Glu序列的常规处理甚至使这些策略产生的问题比期望的更多。简言之，实践中关于重复Glu序列的担心可能使合成策略借助额外的片段来确保引入重复Glu残基的片段相对短。非常需要能够使用固相合成来合成包括两个或多个连续的Glu残基的较长片段。除了这些担心以外，涉及对于肽的大规模生产的产物回收和产物纯度，以及试剂处理、储存和处置的问题，可极大地影响肽合成方案的可行性。因此，一直需要能够有效地以改进的产率大批量地生产商业上感兴趣的肽物质的肽合成工艺。本发明涉及使用固相和溶液相(“混合”)途径合成的肽的制备，其中该肽包括肽氨基酸序列中的两个或多个邻接的Glu残基。已经发现弓I入这些重复Glu序列的长的肽片段，在该片段也引入一个或多个假脯氨酸残基作为两个相应的氨基酸残基的置换物时，可以很容易地合成。不希望受理论约束，认为所述一个或多个假脯氨酸有助于加强生长的片段，使其更容易地继续向生长链上添加比在缺乏所述一个或多个假脯氨酸时可以实际实现的显著更多的氨基酸。示意性地，假脯氨酸可被认为是原位支架，其有助于将正在生长的肽片段保持为更易于将另外的氨基酸残基引入至正在生长的肽链中的结构构象。在脱保护期间，假脯氨酸很容易被修饰以生成起初假脯氨酸所置换的所需的氨基酸残基对。假脯氨酸可在上游(朝向C-末端)被置换，以允许更多的上游氨基酸残基在该重复Glu序列之前，或在下游(朝向N-末端)被置换，以允许更多的下游氨基酸残基被添加至Glu残基之后的肽片段上。下游是更优选地，因为其有益效果更突出。通常，如果将假脯氨酸引入至肽或肽片段中使得不超过8，优选地不超过5个间插氨基酸残基在假脯氨酸残基和重复Glu链和/或另一假脯氨酸链之间，则是理想的。假脯氨酸残基的有益效果可延及若干另外的氨基酸残基，因此在将一个以上的假脯氨酸引入肽或肽片段中的那些实施方案中，至少两个或更多个氨基酸残基位于假脯氨酸残基之间的理想的。本发明的原理适用于促胰岛素肽诸如艾塞那肽，其包括15、16和17位中的三个Glu残基的重复序列，以及其天然和非天然对应物，和这些的的中间肽片段。例如，通过使用至少一个假脯氨酸，很容易地使用固相化学以仅三个不同的肽中间片段来合成艾塞那肽及其对应物。然后使用溶液相化学来向片段之一添加另外的氨基酸物质。然后使这些片段在溶液相中偶联在一起。在艾塞那肽片段之一中使用假脯氨酸使得片段非常长，即使该片段可以包括重复Glu残基的序列，便于固相合成该片段，并且还便于随后该片段与其他片段的溶液相偶联。不使用至少一个假脯氨酸，需要至少4个肽片段来有效地应用混合合成。例如，诸如艾塞那肽(1-17)、艾塞那肽(1-19)和艾塞那肽(1-20)(它们都包括Glu-Glu-Glu序列)的片段非常容易地使用假脯氨酸置换以高产率和纯度来合成，而在不使用假脯氨酸置换时仅可以相似的产率和纯度合成短很多的包括Glu-Glu-Glu序列的片段。在一个方面，本发明涉及促胰岛素肽片段，包括包含至少两个直接连续(indirectsequentce)的谷氨酸残基(Glu-Glu)的氨基酸序列，并且还包括至少一个假脯氨酸结构部分的残基，所述片段任选地含有侧链保护。优选地，至少第一假脯氨酸残基在谷氨酸残基的重复序列和该片段的N-末端之间。此外，如上所限定的促胰岛素肽片段是优选，其中在假脯氨酸残基和谷氨酸残基的重复序列的最近的Glu残基之间存在至少两个氨基酸残基。在一个优选的方面，促胰岛素肽还包括位于第一假脯氨酸残基下游(S卩，靠近N-末端)的第二假脯氨酸残基。优选地，如上所限定的片段包括至少15个氨基酸的残基，其中每个引入至该片段中的假脯氨酸残基计数为两个氨基酸残基。更优选地，促胰岛素肽片段包括至少17个氨基酸的残基。优选如上所限定的促胰岛素肽片段，其中谷氨酸残基的重复序列邻接该片段的C-末端。还优选如上所限定的促胰岛素肽片段，其中不超过两个氨基酸残基在谷氨酸残基的重复序列和该片段的C-末端之间。更优选地，如上所限定的片段包括至少三个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu-Glu)。在本发明的优选方面，如上所限定的促胰岛素肽包括SEQIDNo.34的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中选自Gly-Thr(4-5)、Phe_Thr(6-7)、Thr_Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一个位置被假脯氨酸置换，所述片段任选地含有侧链保护。优选选自由下列各项组成的组的促胰岛素肽片段SEQIDNo.2His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.4His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.5His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.6His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.7His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.8His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.9His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.10His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.11His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.15His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.16His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.17His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.18His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.19His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.20His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.21His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.25His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.26His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.27His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.28His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.29His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.30His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.31His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位处的假脯氨酸X4-X5对应于Gly-Thr或其对应物；6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thre或其对应物；7和8位处的假脯氨酸X7_X8对应于Thr-Ser或其对应物；以及10和11位处的假脯氨酸X10-X11对应于Leu-Ser或其对应物。特别优选下式的促胰岛素肽片段SEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6—X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位处的假脯氨酸X6_X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸X10-X11对应于Leu-Ser或其对应物。进一步优选的促胰岛素肽片段是具有下式的那些SEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu_Glu，或SEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位处的假脯氨酸X6_X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸x10-x11对应于Leu-Ser或其对应物。还有下式的促胰岛素肽片段SEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位处的假脯氨酸X6_X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸x10-x11对应于Leu-Ser或其对应物。此外优选下式的促胰岛素肽片段SEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,或SEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位处的假脯氨酸X6_X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸x10-x11对应于Leu-Ser或其对应物。另一优选的促胰岛素肽片段具有下式SEQIDNo.4:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val,其中6和7位处的假脯氨酸X6_X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸x^-x11对应于Leu-Ser或其对应物。还优选下式的促胰岛素肽片段SEQIDNo.2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val，或SEQIDNo.3:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val。在另一个方面，本发明涉及一种制备促胰岛素肽的方法，包括以下步骤a)制备包括氨基酸序列的第一肽片段或其对应物，所述氨基酸序列包括至少两个直接连续的谷氨酸(Glu-Glu)并还包括假脯氨酸；和b)将所述肽片段引入至促胰岛素肽中。“将所述肽片段引入至促胰岛素肽中”指将该肽片段与第二肽片段偶联以获得促胰岛素肽。优选地，该方法采用如上所限定的第一肽片段来进行，其中至少第一假脯氨酸残基在谷氨酸残基的重复序列和该片段的N-末端之间。在本发明的优选方面，该方法采用选自由下列各项组成的组的片段来进行SEQIDNo.2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.4:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.5:His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.6:His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.7:His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.8:His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.9:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.10His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.11His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.15His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.16His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.17His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.18His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.19His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.20His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.21His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.25His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.26His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.27His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.28His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.29His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.30His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.31His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位处的假脯氨酸X4-X5对应于Gly-Thr或其对应物；6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thre或其对应物；7和8位处的假脯氨酸X7-X8对应于Thr-Ser或其对应物；以及10和11位处的假脯氨酸Xltl-X11对应于Leu-Ser或其对应物。更优选地，该方法采用下式的第一肽片段来进行SEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物。在另一优选方面，该方法采用选自由下列各项组成的组的第一肽片段来进行SEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物。还优选这样的方法，其中使用下式的第一肽片段SEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物。此外，优选如上所限定的方法，其中使用选自由下列各项组成的组的第一肽片段SEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物。在进一步优选的方面，该方法采用下式的第一肽片段来进行SEQIDNo.4His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val,其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物。还优选采用选自由下列各项组成的组的第一肽片段来进行的方法SEQIDNo.2His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val，其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thr或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物。在另一方面，本发明涉及一种促胰岛素肽，其包括假脯氨酸的至少一个残基；至少两个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu)；和任选至少一个保护基团。优选地，促胰岛素肽是艾塞那肽(1-39)的对应物。更优选地，该肽与艾塞那肽(1-39)的不同之处在于将假脯氨酸的所述至少一个残基引入至该肽中的修饰。在另一方面，本发明涉及一种促胰岛素肽，其包括假脯氨酸的至少一个残基；至少两个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu)；和任选至少一个保护基团，其中该肽至少包括根据SEQIDNo.1-79的任意一个的氨基酸序列或其对应物。更优选地，本发明涉及一种促胰岛素肽，其包括假脯氨酸的至少一个残基；至少两个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu)；和任选至少一个保护基团，其中该肽至少包括根据SEQIDNo.2-31的任意一个的氨基酸序列或其对应物。特别优选的是一种促胰岛素肽，其包括假脯氨酸的至少一个残基；至少两个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu)；和任选至少一个保护基团，其中该肽至少包括根据SEQIDNo.2、3、4、12、13、14、22、23和24的任意一个的氨基酸序列或其对应物。在另一方面，本发明涉及肽片段，其选自由根据SEQIDNo.35_39的任意一个的片段组成的组，或其对应物。在另一方面，本发明涉及肽片段，其选自由根据SEQIDNo.40_42的任意一个的片段组成的组，或其对应物。在另一方面，本发明涉及肽片段，其选自由根据SEQIDNo.43_45的任意一个的片段组成的组，或其对应物。在另一方面，本发明涉及肽片段，其选自由根据SEQIDNo.46_49的任意一个的片段组成的组，或其对应物。在另一方面，本发明涉及一种制备促胰岛素肽的方法，包括以下步骤a)提供第一、第二和第三肽片段，所述第一肽片段包括至少两个重复Glu残基的序列并且包括假脯氨酸的至少一个残基，并且其中所述片段的任意一个任选地包括至少一个保护基团；b)将丝氨酸残基与所述第三肽片段偶联以获得第四肽片段；c)将所述第四片段与所述第二片段偶联以获得第五片段；d)将所述第五肽片段与所述第一肽片段偶联以获得促胰岛素肽。在优选的方面，该方法进一步包括分离所述肽的步骤，即e)层析纯化所述肽；和f)沉淀所述纯化的肽。优选地，如上所限定的步骤a)包括提供包括SEQIDNo.34的氨基酸序列的第一肽片段His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中选自Gly-Thr(4-5),Phe-Thr(6-7),Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一个位置被假脯氨酸置换，所述片段任选地含有侧链保护。更优选地，步骤a)包括提供选自由根据SEQIDNo.2-31的任意一个的片段组成的组的第一肽片段。在优选的方面，本发明涉及制备如上所限定的促胰岛素肽的方法，包括以下步骤a)提供选自由根据SEQIDNo.2-31的任意一个的片段组成的组的第一肽片段或其对应物，选自由根据SEQIDNo.35、37-39的任意一个的片段组成的组的第二肽片段或其对应物和选自由根据SEQIDNo.41或42的片段组成的组的第三肽片段或其对应物。b)将丝氨酸残基与所述第三肽片段偶联以获得第四肽片段；c)将所述第四片段与所述第二片段偶联以获得第五片段；d)将所述第五肽片段与所述第一肽片段偶联以获得促胰岛素肽。优选地，所述第一、第二和第三片段使用固相合成技术合成，而所述第四和第五片段以及所述促胰岛素肽在溶液相中形成。还优选这样的方法，其中步骤(b)包括使用至少乙醇来引起沉淀。此外优选如上所限定的方法，其中使用具有根据SEQIDNo.2、3、4、12、13、14、22、23和24的任意一个的氨基酸序列的第一肽片段或其对应物。还优选如上所限定的方法，其中使用具有根据SEQIDNo.35_39的任意一个的氨基酸序列的第二肽片段或其对应物。另外，优选如上所限定的方法，其中使用具有根据SEQIDNo.40_42的任意一个的氨基酸序列的第三肽片段或其对应物。图1是根据本发明的合成方案(10)的示意图。第一肽片段(12)、第二肽片段(14)和第三肽片段(16)在固相上制备(步骤a)。第四片段(20)由第三片段(16)通过与丝氨酸偶联制备(步骤b)。然后第四片段(20)与第二片段(14)偶联以提供第五片段(22)(步骤C)。最后，第五片段(22)与第一片段(12)偶联以获得促胰岛素肽(11)(步骤(1)。下面描述的本发明的实施方案并非意在是穷尽的，或将本发明限于下面详述中公开的精确形式。而是，选择和描述各实施方案，使得本领域其他技术人员可理解和获知本发明的原理和实施。本发明涉及用于制备肽和肽片段的合成方法，所述肽和肽片段在肽的氨基酸序列中包括两个或更多个邻接的Glu残基，优选三个或更多个邻接的Glu残基的。本发明的肽分子可以是被保护的、未保护的或部分保护的。保护作用可包括N-末端保护、侧链保护和/或C-末端保护。在优选的实施方案中，本发明主要针对合成具有此重复Glu残基的促胰岛素肽及其对应物，片段及其对应物，以及这些的融合产物及其对应物。最优选地，本发明用来合成毒蜥外泌肽诸如艾塞那肽，艾塞那肽的对应物，及其片段。如本文中所使用的“对应物”指肽的天然或非天然类似物、衍生物、融合化合物、盐类等。如本文中使用的，肽类似物通常指相对于另一肽或肽对应物具有诸如通过一个或多个氨基酸置换、缺失、倒位和/或添加作用修饰的氨基酸序列的肽。置换作用可涉及一个或多个天然或非天然氨基酸。置换作用优选地可以是保守的或高度保守的。保守置换指氨基酸用另一个通常具有相同的净电荷并通常具有相同的大小和形状的氨基酸来置换。例如，具有脂族或置换的脂族氨基酸侧链的氨基酸在其侧链中的碳原子和杂原子总数目区别不超过约4个时具有近似相同的大小。当其侧链中的支链数目区别不超过大约1个或两个时，它们具有近似相同的形状。在其侧链中带有苯基或置换的苯基的氨基酸被认为具有相同的大小和形状。下面列举了五组氨基酸。化合物中氨基酸被来自相同组的另一氨基酸替换通常导致保守置换。I组甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、甲硫氨酸和具有C1-C4脂族或C1-C4羟基置换的脂族侧链(直链或单支链的)的非天然存在的氨基酸。II组谷氨酸、天冬氨酸和具有羧酸置换WC1-C4脂族侧链(无支链的或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。III组赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和具有胺或胍基置换的C1-CJg族侧链(无支链的或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。IV组谷氨酰胺、天冬酰胺和具有酰胺置换的C1-C4脂族侧链(无支链的或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。V组苯丙氨酸、苯甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。如本文中所使用的，术语“对应物”更优选地指肽的盐类或指其在C-末端被酰胺化的衍生物。“高度保守置换”是氨基酸用在侧链中具有相同的官能团并具有几乎相同大小和形状的另一氨基酸替换。具有脂族或取代的脂族氨基酸侧链的氨基酸在其侧链中的碳原子和杂原子的总数目区别不超过两个时，具有几乎相同的大小。当它们在其侧链中具有相同数量的支链时，它们具有几乎相同的形状。高度保守置换的实例包括缬氨酸置换亮氨酸，苏氨酸置换丝氨酸，天冬氨酸置换谷氨酸，以及苯甘氨酸置换苯丙氨酸。“肽衍生物”通常指具有一个或多个其侧基、α碳原子、末端氨基和/或末端羧酸基团的化学修饰的肽、肽类似物或其他肽对应物。通过举例，化学修饰包括，但不限于，添加化学结构部分、建立新键和/或去除化学结构部分。氨基酸侧基处的修饰包括但不限于，赖氨酸e-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸和天冬氨酸羧酸基团的烷基化，谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺。末端氨基的修饰包括但不限于，脱氨、N-低级烷基、N-二低级烷基和N-酰基(例如，-CO-低级烷基)修饰。末端羧基的修饰包括但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。因此，部分或完全保护的肽构成肽衍生物。在本发明的实施中，如果化合物能够刺激，或导致刺激或有助于导致刺激胰岛素激素的合成或表达，则该化合物具有“促胰岛素”活性。在优选的实施模式中，可根据美国专利号6，887，849和6，703，365中所述的测定法证实促胰岛素活性。为了举例说明，现在将参照图1在合成具有下式(SEQ.IDNO.1)的艾塞那肽(11)的情况下说明本发明的原理Hisl-Gly2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Leuio-Serll-Lys12-Gln13-Met14-Glu15-Glu16-Glu17-Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-GIy3o-Pro3i-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39认为图1的方案10特别适合于毒蜥外泌肽及其对应物的扩大规模的合成(scaled-upsynthesis)0典型地执行扩大规模的工序以提供用于商业分销的肽量。例如，在扩大规模的工序中肽的量可以为500g/批次，或Ikg/批次，并且更典型地数十kg至数百kg/批次或更多。在优选的实施方案中，本发明的方法可提供这样的改进，即减少加工(合成)时间，提高产物产率，提高产物纯度，和/或减少所需的试剂和起始原料的量。图1中所示的合成方案10使用固相和溶液相技术的组合来制备肽产物(11)。参照图1，方案10涉及在固相上合成肽中间片段(12)、(14)和(16)。另外的氨基酸与片段(16)在溶液相中偶联以制备片段(20)。然后，所得的三个片段在溶液相中组装以制备全尺寸肽(11)。片段(12)通常包括至少8个氨基酸残基，并且更理想地从His1经由15、16和17位处的至少一个，优选至少两个，和更优选至少全部三个Glu残基延伸。将一个或多个假脯氨酸有利地引入至片段(12)中以便促进此相对大的肽片段的合成。直到进行脱保护步骤之前，以此方式使用的假脯氨酸残基将被引入到该片段中或引入该片段的较大肽中，视情况而定。如在本发明的实施中使用的，术语“假脯氨酸”指包括羟基功能性氨基酸的残基诸如Ser或Thr的二肽，其中羟基功能性侧链被保护为α_氨基和侧链羟基之间的脯氨酸样，TFA不稳定，噁唑烷环。噁唑烷环的结果是，二肽用作可逆的脯氨酸模拟物。假脯氨酸通常在构建中被置换入肽片段中替换靶片段的两个邻接的氨基酸残基。位于C-末端的假脯氨酸的部分通常对应于噁唑烷环保护的Ser或Thr，而邻接部分可对应于任意其他的氨基酸。因此，当被引入至肽中时典型的假脯氨酸残基或结构部分可表示为通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中靠近N-末端的Φ代表任意氨基酸的残基，并且R1和R2各自独立地是适当的二价连接结构部分。通常，R1是具有下式的二价结构部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中R3和R4各自独立地是一价结构部分诸如H或低级烷基诸如甲基。R3和R4还可以是环结构的共同成员(co-member)。理想地，R3和R4各自独立地是甲基或H。更优选地，R3和R4是甲基。对于噁唑烷环保护的Ser，R2是二价结构部分CH2,而对于Thr，R2是二价结构部分-(CH3)CH-。在脱保护期间，R1结构部分被裂解以提供根据下式的二肽残基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中R2如上限定。当应用于图1中所示的艾塞那肽(1-39)(11)的片段(12)时，可将一个或多个此假脯氨酸置换入15，16和17位处的Glu残基下游的片段中，以便促进相对长的片段的合成。如从SEQID.No.1中可见，在Glu-Glu-Glu残基的下游5、7、8和11位处有Ser或Three残基。这表明一个或多个假脯氨酸可在Gly-Thr(4_5)、Phe-Thr(6_7)、Thr-Ser(7-8)、和/或Leu-Ser(10-11)位处被置换入片段12中。优选地，在Phe-Thr(6-7)和/或Leu-Ser(10-11)位的至少一位中使用假脯氨酸。更优选地，在Phe-Thr(6_7)和Leu-Ser(IO-Il)位的各个位处使用相应的假脯氨酸。尽管如果需要可使用第三和第四个假脯氨酸，但在这两个优选的位置处使用一个或两个假脯氨酸提供相对简便地构建片段12的合适性能而不需要额外的假脯氨酸的作用。在具体的说明性的实施模式中，适合用于替换10和11位处Leu-Ser的FMOC-保护的假脯氨酸具有式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中末端OH表示可用于在C-末端处偶联的酸功能性。此假脯氨酸可由符号Fmoc-Leu-Ser(ΨMe’Mepro)-OH来标识。类似地，适合用于替换6和7位处Phe-Thr的Fmoc-保护的假脯氨酸具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中末端OH表示可用于在C-末端处偶联的酸功能性。此假脯氨酸可由符号Fmoc-Phe-Thr(￥Me'Mepro)-OH来标识。第一片段(12)理想地具有式X^i艾塞那肽(1-m)片段，其中j和k被定义为残基位置4和5，6和7，7和8，以及/或10和11，条件是假脯氨酸存在于这些位置中的至少一个位置处；各个X独立地是假脯氨酸结构部分；并且m为15-20，优选地17-19，更优选地17或19。因此，可以理解的是，第一片段格外地长，即使优选实施方案将Glu-Glu-Glu的序列引入靠近C-末端，在此处扭曲效应可能是对于固相合成的最大问题。根据常规实践，一个或多个氨基酸残基可包括侧链保护基团。在一些实施方案中，肽片段(12)可经C-末端与树脂结合。该片段任选地可带有N-末端和/或C-末端保护基团。就肽片段的固相合成而言，Fmoc,Alloc和Z结构部分分别应该是特别有用的N-末端保护基团。Fmoc代表芴基-甲氧基-羰基结构部分。Alloc指烯丙氧基羰基保护基团。Z指苄氧基-羰基保护基团。在代表性的实施方案中，片段(12)可包括如下的一种或多种肽片段SEQIDNo.2His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.4His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.5His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.6His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.7His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.8His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.9His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.10His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.11His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.15His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.16His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.17His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.18His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.19His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.20His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.21His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.25His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.26His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.27His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.28His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.29His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.30His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.31His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位处的假脯氨酸对应于Gly-Thr或其对应物；6和7位处的假脯氨酸对应于Phe-Thre或其对应物；7和8位处的假脯氨酸对应于Thr-Ser或其对应物；以及10和11位处的假脯氨酸对应于Leu-Ser或其对应物。采用脱保护形式，含假脯氨酸的根据SEQIDNo.2_11的片段具有根据SEQIDNo.32的艾塞那肽(1-19)的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa-Val采用脱保护形式，含假脯氨酸的根据SEQIDNo.12_21的片段具有根据SEQIDNo.33的艾塞那肽(1-18)的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa采用脱保护形式，含假脯氨酸的根据SEQIDNo.22_31的片段具有根据SEQIDNo.34的艾塞那肽(1-17)的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu固相合成通常以片段(12)的C-末端至N-末端的方向进行。因此，如果片段(12)包括17个氨基酸残基，则存在于片段的C-末端部分上的17位氨基酸(Glu-)，是与固相树脂支持物偶联的第一个氨基酸残基。然后固相合成通过以与所需序列对应的方式连续地添加氨基酸而继续进行。在N-末端残基(例如，N-末端组氨酸残基(His)已加入至新生肽链后，肽中间片段的合成完成。片段(14)是第二肽片段，其通常可由符号艾塞那肽(n-q)来识别，其中η为m+1(其中m在上面关于第一片段而限定，为15-20)，并且q为25-30。因此，片段(14)的N-末端可以是艾塞那肽或其对应物的16-20位中任意一个位置处的氨基酸残基，并且C-末端可以位于艾塞那肽或其对应物的25-30位中任意一个位置处。在优选的实施方案中，η为18-20，并且q为26-30。根据常规实践，片段(14)的一个或多个氨基酸残基可包括侧链保护基团。在一些实施方案中，肽片段(14)可经C-末端与树脂结合。该片段任选地可带有N-末端和/或C-末端保护基团。就肽片段的固相合成而言，Fmoc,Alloc和Z结构部分分别应该是特别有用的N-末端保护基团。在代表性的实施方案中，片段(14)可以具有如下的氨基酸序列SEQIDNo.35Alal8-Vali9-Arg2o-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26SEQIDNo.36Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly30SEQIDNo.37Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29SEQIDNo.38Vali9-Arg2o-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26SEQIDNo.39Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29如前所述，固相合成通常以片段(14)的C-末端至N-末端的方向进行。因此，如果片段(14)在26位处结束，则存在于该片段的C-末端部分上的亮氨酸(Leu)氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一个氨基酸残基。然后固相合成通过以与所需序列对应的方式连续地添加氨基酸而继续进行。在N-末端残基(例如，在片段(14)在18位处结束的情况下，为N-末端丙氨酸残基(Ala))已加入至新生肽链后，肽中间片段的合成完成。片段(16)是第三肽片段，其可通常由符号艾塞那肽(q+1-38)来识别，其中q在上面关于第二片段而限定。注意到，片段(16)通过在天然艾塞那肽的C末端的39残基位中尚不包括丝氨酸(Ser)残基。丝氨酸经常随后在溶液相中与片段(16)的C末端偶联，其优选地使用带有侧链保护的丝氨酸。根据常规实践，片段(16)的一个或多个氨基酸残基可包括侧链保护基团。在一些实施方案中，肽片段16可经C-末端与树脂结合。该片段任选地可带有N-末端和/或C-末端保护基团。就肽片段的固相合成而言，Fm0C、All0C和Z结构部分分别应该是特别有用的N-末端保护基团。在代表性的实施方案中，片段(16)可具有如下的氨基酸序列SEQIDNo.40Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38SEQIDNo.41Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38SEQIDNo.42Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38固相合成通常以片段(16)的C-末端至N-末端的方向进行。因此，存在于该片段的C-末端部分上的Pro38氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一个氨基酸残基。然后固相合成通过以与所需序列对应的方式连续地添加氨基酸而继续进行。在N-末端残基(例如，在片段(16)包括艾塞那肽(27-38)的实施方案中，为N-末端赖氨酸残基(Lys27))已加入至新生肽链后，肽中间片段的合成完成。根据常规实践，片段(16)的合成中使用的任意一个氨基酸可包括侧链保护。继续参照图1，片段(12)、(14)和(16)以及丝氨酸组装在一起以完成所需的肽(11)，其理想地使用溶液相偶联技术。要达到使该片段携带侧链保护基团并引入假脯氨酸残基的程度，在液相偶联期间适当地保持这些保护作用。反应物的N-末端和C-末端也在合适时被保护。为了实现这些偶联，在溶液相中将丝氨酸添加至片段(16)上以产生中间片段(20)。通过举例，向片段(16)的各个实施方案添加Ser39可产生一个或多个片段(20)，诸如下列序列SEQIDNo.43Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.44Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.45Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39然后(14)和(20)在溶液相中偶联以生成中间保护的片段(22)。通过举例，下列是优选的片段(22)的优选实施方案SEQIDNo.46Alal8-Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-PrO31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.47Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.48Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-SeT32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.49Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly3o-Pro31-Ser32-SeT33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39然后肽片段(12)和(22)在溶液相中偶联以生成含假脯氨酸的肽(11)。为了达到使其他氨基残基携带侧链保护的程度，需要在此步骤中自始至终保留该保护作用。通过举例，下列是所得的优选的肽(11)的优选实施方案SEQIDNo.50His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.51His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.52His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VBl-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp24-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GlY34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.53His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.54His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VBl-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GlY34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.55His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.56His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.57His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.58His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VBl-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GlY34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.59His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.60His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.61His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.62His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.63His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2l-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-PrO31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.64His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.65His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.66His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.67His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.68His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.69His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-ATg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.70His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.71His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.72His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.73His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly28-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.74His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.75His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.76His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.77His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu34-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.78His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.79His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-ATg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39在SEQIDNo.50-79中，如上所限定，X4_X5，X6-X7,X7-X8和Xltl-X11对分别构成假脯氨酸残基。在进行图1的反应方案中，可通过工业中已知的标准方法来进行固相和溶液相合成。在代表性的实施模式中，利用氨基酸从C-末端至N-末端添加的化学性质在固相中合成肽。因此，靠近特定片段的C-末端的氨基酸或肽基团首先被添加至树脂上。这通过所述氨基酸或肽基团的C-末端功能性与树脂支持物上的互补功能性的反应而发生。所述氨基酸或肽基团的N-末端侧被掩蔽以防止不需要的副反应。所述氨基酸或肽基图案也期望还包括侧链保护。然后连续的氨基酸或肽基图案附着于与支持物结合的肽物质，直至形成目的肽。根据常规实践，这些中的大多数也包括侧链保护。随着各自连续的偶联，与树脂结合的肽物质的N-末端处的掩蔽基团被去除。其然后与N-末端被掩蔽的下一氨基酸的C-末端反应。由此，固相合成的产物是结合于树脂支持物的肽。可使用适合实施固相肽合成的任意类型的支持物。在优选的实施方案中，支持物包括可由下列各项制成的树脂一种或多种聚合物、共聚物或聚合物的组合，诸如聚酰胺、聚磺酰胺、置换的聚乙烯、聚乙二醇，酚醛树脂、多糖或聚苯乙烯。聚合物支持物也可以是对肽合成中使用的溶剂充分地不溶和惰性的任意固体。固体支持物典型地包括连接结构部分，在合成期间正在生长的肽与其偶联，并且其在所需的条件下可被裂解以从支持物上释放肽。合适的固体支持物可具有连接体，该连接体是可光裂解的(photo-cleavable)、可TFA裂解的(TFA-cleavable)、可HF裂解的(HF_cleavabIe)、可氟离子裂解的(fluorideion-cleavable)、可还原裂解的(reductively-cleavable)；可Pd(O)-裂解的(Pd(O)-CleavabIe)；可亲核裂解的(nucleophilically-cleavable)；或可自由基裂解的(radically-cleavable)。优选的连接结构部分是可在这样的条件下裂解的，所述条件是裂解的肽的侧链基团仍然基本上被完全保护。在一个优选的合成方法中，肽中间片段在包括三苯甲基的酸敏固体支持物上合成，和更优选地在包括具有悬垂氯基团(pendentchlorinegroup)的三苯甲基的树脂例如，2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂(Barlos等人，(1989)TetrahedronLetters(四面体快报)30(30)=3943-3946)上合成。实例还包括三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂、4-氨基丁-1-醇2-氯三苯甲基树脂、4-氨基甲基苯甲酰2-氯三苯甲基树脂、3-氨基丙-1-醇2-氯三苯甲基树脂、溴乙酸2-氯三苯甲基树脂、氰基乙酸2_氯三苯甲基树脂、4-氰基苯甲酸2-氯三苯甲基树脂、glicinol2-氯三苯甲基树脂、丙酸2-氯三苯甲基树脂、乙二醇2-氯三苯甲基树脂、N-Fmoc羟胺2-氯三苯甲基树脂、胼2-氯三苯甲基树脂。一些优选的固体支持物包括聚苯乙烯，其可与二乙烯基苯共聚合以形成其上锚定有反应性基团的支持物材料。在固相合成中使用的其他树脂包括“Wang”树脂，其包括带有4-羟甲基苯氧基甲基锚定基团(anchoringgroup)的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物(Wang，S.S.1973，J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志))，以及4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂(Richter等人，(1994)，TetrahedronLetters(四面体快报)35(27):4705_4706)。Wang树脂、2-氯三苯甲基氯树脂和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂可购自，例如，Calbiochem-NovabiochemCorp.,圣地亚哥,加利福尼亚。为了制备用于固相合成的树脂，树脂可在适当的溶剂中预洗。例如，将诸如2-CTC树脂的固相树脂加入至肽室内并且用适当的溶剂预洗。预洗溶剂可基于偶联反应中使用的溶剂(或溶剂的混合物)类型来选择，或反之亦然。适合用于洗涤，并且也适合随后的偶联反应的溶剂包括二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、二甲基甲酰胺(DMF)等，以及这些试剂的混合物。其他有用的溶剂包括DMS0、吡啶、氯仿、二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮及其混合物。一些情况下，偶联可在二元溶剂体系，诸如体积比范围为91-19，更常见地41-14的DMF和DCM的混合物中进行。除非另外注明，本发明的合成优选地在合适的保护基团的存在下进行。保护基团的性质和应用在本领域中是公知的。通常，适当的保护基团是可有助于防止其附着的原子或结构部分，例如，氧或氮，在加工和合成期间参与不需要的反应的任意类型的基团。保护基团包括侧链保护基团和氨基或N-末端保护基团。保护基团也可防止羧酸、硫醇等的反应或结合。“侧链保护基团”指与氨基酸的侧链(S卩，氨基酸通SH2N-C(R)(H)-COOH中的R基)偶联的化学结构部分，其有助于防止侧链的一部分与肽合成、加工等的步骤中使用的化学物质反应。侧链保护基团的选择可取决于多种因素，例如，进行的合成的类型，肽将要进行的加工，以及所需的中间产物或终产物。侧链保护基团的性质也取决于氨基酸本身的性质。通常，选择在固相合成期间的α-氨基脱保护期间不被去除的侧链保护基团。因此，α-氨基保护基团和侧链保护基团典型地是不相同的。在一些情况下，并且根据固相合成和其他肽加工中使用的试剂的类型，氨基酸可以不需要侧链保护基团的存在。这些氨基酸典型地在侧链中不包括反应性的氧、氮、或其他反应性结构部分。侧链保护基团的实例包括乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、叔-丁基(tBu)、三苯基甲基(三苯甲基)、四氢吡喃基、苄醚(Bzl)和2，6_二氯苄基(DCB)、叔-丁氧羰基(Boc)、4-硝基苯磺酰基(Ns)、对-甲苯磺酰基(Tos)、五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)、金刚烷氧羰基(adamantyloxycarbonyl)、咕吨基(xanthyl)(Xan)、苄基、2，6_二氯苄基、甲酯、乙酯和叔-丁酯(OtBu)、苄氧羰基(Z)、2_氯苄氧羰基(2-C1-Z)、叔-戊氧基羰基(t-amyloxycarbonyl)(Aoc)，以及芳香族或脂族氨基甲酸乙酯(urethan-)型保护基团，光不稳定基团(photolabilegroup)诸如硝基藜声氧羰基(nitroveratryloxycarbonyl)(NVOC)；以及氟化物不稳定基团(fluoridelabilegroup)诸如三甲基甲硅氧基羰基(trimethylsilyloxycarbonyl)(TEOC)。优选的侧链基团为叔-丁基(tBu)、三苯基甲基(三苯甲基)、叔-丁氧羰基(Boc)、对-甲苯磺酰基(Tos)、五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、叔-丁酯(OtBu)和苄氧羰基(Z)。对于在本发明的实施中普遍用于合成艾塞那肽的氨基酸，优选的侧链保护基团显示在下面的表A中表A氨基酸侧链保护基tfAla无Arg无或pbf*Asp叔-丁酯(OtBu)~Gln三苯甲基(trt)GluOtBuGly1His三苯甲基(trt)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*pbf指五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。保护的氨基酸为N-a-Fmoc-NG-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基-L-精氨酸，并且具有下式<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>“氨基末端保护基团”包括与氨基酸的α氨基偶联的化学结构部分。典型地，在添加待加入至正在生长的肽链的下一个氨基酸之前，氨基末端保护基团在脱保护反应中被去除，但当肽从支持物上被裂解时其可以维持。氨基末端保护基团的选择可取决于多种因素，例如，进行的合成的类型和所需的中间产物或终产物。氨基末端保护基团的实例包括⑴酰基型保护基团，诸如甲酰基、烯丙酰基(Acr)、苯甲酰基(Bz)和乙酰基(Ac)；(2)芳香族氨基甲酸乙酯型保护基团，诸如苄氧羰基(Z)和置换的Z，诸如对-氯苄氧羰基、对_硝基苄氧羰基、对_溴苄氧羰基、对_甲氧基苄氧羰基；(3)脂族保护基团诸如叔-丁氧羰基(Boc)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧基羰基、乙氧羰基、烯丙氧羰基；(4)环烷基氨基甲酸乙酯型保护基团诸如9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)、环戊氧羰基、金刚烷氧羰基和环己氧羰基；(5)硫代氨基甲酸乙酯型(thiourethan-type)保护基团，诸如苯基硫代羰基。优选的保护基团包括9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)、2-(4-联苯基)_丙基(2)氧羰基(Bpoc)、2-苯基丙基(2)-氧羰基(Poc)和叔-丁氧羰基(Boc)。Fmoc或Fmoc样化学性质是对固相肽合成高度优选的，因为裂解处于别保护状态的所得肽是使用温和的酸性裂解剂相对简单地来进行的。就所得的副产物、杂质等而言，此类裂解反应是相对干净的，使其在技术上和经济上适宜从溶胀和缩水洗涤物(swellingandshrinkingwashes)中大规模回收肽，从而提高产率。如本文中所使用的，关于肽合成的“大规模”通常包括在至少500g/批次，更优选至少2kg/批次范围内的肽合成。大规模合成典型地在大型反应容器诸如钢反应容器中进行，所述容器可容纳大量的试剂诸如树脂、溶剂、氨基酸、用于偶联和脱保护反应的化学品，其尺寸允许生产处于千克至公吨范围内的肽。另外，Fmoc保护基团，相对于侧链保护基团，可选择性地与肽裂开，使得当Fmoc被裂解时侧链保护仍然保留在适当的位置。此种选择性在氨基酸偶联期间对最小化侧链反应非常重要。另外，侧链保护基团，相对于Fmoc，可被选择性裂解以被除去，使Fmoc保持在适当的位置。在下面进一步描述的纯化方案过程中有利地依赖后一种选择性。固相偶联反应可在一种或多种增强或改善偶联反应的化合物的存在下进行。可增加反应速率并减少副反应速率的化合物包括鳞和脲盐，它们可在叔碱例如二异丙基乙胺(DIEA)和三乙胺(TEA)的存在下，将被保护的氨基酸转化为活化的种类(例如，B0P、PyBOPO,HBTU和TBTU都生成HOBt酯)。其他试剂通过提供保护试剂而有助于防止外消旋化。这些试剂包括带有加成的辅助亲核体(例如，1-羟基_苯并三唑(HOBt)，1-羟基-氮杂苯并三唑(HOAt)或HOSu)的碳二亚胺(例如，DCC或WS⑶I)。还可采用利用带有或不带有加成的辅助亲核体的氯甲酸异丁酯的混合酐法，同样可以采用氮化物法，这归因于与其相关的低外消旋化。这些类型的化合物还可增加碳二亚胺介导的偶联速率，以及防止Asn和Gln残基的脱水。在确定偶联完成后，偶联反应混合物用溶剂洗涤，并且对肽物质随后的各个氨基酸残基重复偶联循环。为了偶联下一个氨基酸，典型地通过用试剂处理来实现从树脂结合物质上去除N-末端保护基团(例如，Fmoc基团)，所述试剂包括处于诸如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)的溶剂中的20-50%哌啶(基于重量)。去除Fmoc保护基团后，典型地进行数次洗涤以去除残余的哌啶和Fmoc副产物(诸如二苯并富烯及其哌啶加合物)。随后的氨基酸可以以相对于树脂支持物上肽物质的负荷系数(loadingfactor)的化学计量过量的氨基酸来使用。通常在偶联步骤中使用的氨基酸的量至少等于树脂上第一氨基酸的负荷系数(1倍等价(equivalent)或更大)。优选地，在偶联步骤中使用的氨基酸的量为至少1.3倍等价的(0.3倍超过量)或更大，并且最优选地约1.5倍等价的(0.5倍超过量)或更大。在一些情况下，例如，偶联步骤采用1-3倍范围内的等价量的氨基酸。在最终的偶联循环后，用溶剂诸如NMP洗涤树脂，然后使用惰性第二溶剂诸如DCM来洗涤。为了从树脂去除已合成的肽物质，以下列的方式进行裂解处理，即使得被裂解的肽物质仍然带有足够的侧链和末端保护基团。保持保护基团在合适的位置有助于在树脂裂解期间或之后防止肽片段的不需要的偶联或其他不需要的反应。在用Fmoc或类似的化学来合成肽的情况下，可以任意所需的方式来实现保护的裂解，诸如通过使用相对弱酸试剂诸如乙酸或在溶剂诸如DCM中的稀释TFA。典型地使用在DCM中的0.5-10重量％，优选1_3重量％TFA0参见，例如，美国专利号6，281，335。从固相树脂中裂解肽中间片段的步骤可沿着如下示例性的工艺路线来继续进行。然而，可使用有效地从树脂中裂解肽中间片段的任意适当的工艺。例如，约5-20，优选约10体积的含酸性裂解剂的溶剂加入到装有树脂结合肽物质的容器中。结果，树脂典型地以珠子形式浸没在试剂中。当在适当的温度下将液体内容物搅动适当的时间段时发生裂解反应。搅动有助于防止珠子凝集。适当的时间和温度条件将取决于一些因素诸如要使用的酸试剂，肽的性质，树脂的性质等。作为一般的原则，在约_15°C-约5°C，优选约-10°C-约0°C下搅拌约5分钟-2小时，优选地约25分钟-约45分钟将是合适的。裂解时间可在约10分钟-约2小时或甚至多至一天的范围内。期望裂解在此冷温度范围内进行，以提供可在反应期间典型地发生的反应放热曲线。另外，裂解反应的较低温度防止酸敏侧链保护基团，诸如trt基团在此阶段被去除。在裂解处理结束时，反应结束。这可例如，通过将裂解剂和适当的碱诸如吡啶等混合，并且继续搅动和搅拌一段额外的时间，诸如额外的5分钟-2小时，优选地约20分钟-约40分钟来完成。碱的加入和继续的搅动导致容器内容物的温度增加。在搅动结束时，容器内容物可处在约0°C-约15°C，优选地约5°C-约10°C的温度范围内。在总合成工艺中可任选地加入一些因素，诸如使树脂溶胀和缩水以便改善肽回收的多个方面。这些技术描述在，例如，美国专利公开号2005/0164912A1中。在一些方面，可制备裂解的肽片段，以用于与其他肽片段和/或氨基酸的溶液相偶联。溶液相中的肽偶联反应的综述见，例如，NewTrendsinPeptideCouplingReagents(f^K^O^irM^)；Albericio,Fernando；Chinchilla,Rafeal；Dodsworth,DavidJ.；禾口Najera,Armen；OrganicPreparationsandProceduresInternational(国际有机物制备与程序)(2003)，33(3)，203-303.肽片段优选地在采用溶液相偶联之前被分离。例如，根据适用于片段(12)的一个说明性的分离策略，片段(12)用水提取一次或多次。如果出现乳液，则本发明采用盐水溶液。说明性的盐水溶液是饱和NaCl溶液，需要被过滤以去除固体。盐水溶液有助于分解乳液，并在DCM和水相之间提供更好的分离层。可使用反提取来辅助获得较高的产率。使用蒸馏来减少二氯甲烷，所述二氯甲烷用于从树脂裂解和至少一些后继的洗涤和随后的庚烷添加，以便沉淀作为固体的产物，从而分离。任何剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至小于25体积％。沉淀的片段(12)用庚烷洗涤，并然后在至多35°C的温度下真空干燥以结束分离。相反，片段(14)可更容易地乳化。因此，对于片段(14)的分离不太需要水提取作为初始步骤。而是，说明性的分离策略首先通过蒸馏减少二氯甲烷(DCM)，然后加入处于水中的25%IPA(异丙醇)，并通过蒸馏进一步减少剩余的二氯甲烷至小于25体积％。分离沉淀的片段(14)，用25%IPA/水洗涤，然后在至多35°C的温度下真空干燥。片段(16)的分离类似于片段(12)的分离，因为当在水中提取时通常不形成片段(16)的乳液。因此，对于片段(16)，可以遵从上面关于片段(12)确定的分离方案。肽中间片段与其他片段或氨基酸在溶液相中的偶联可使用原位偶联剂来进行，所述原位偶联剂例如为B0P，6-氯-1-羟基苯并三唑(6-C1-H0BT)、o_(苯并三唑-1-基)-N，N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、HATU、二环己基碳二亚胺(DCC)、水溶性碳二亚胺(WS⑶I)或O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)。其他偶联技术使用预先形成的活性酯诸如诸如羟基琥珀酰亚胺酯(HOSu)和对硝基苯酚(HONp)酯；预先形成的对称的酐；非对称酐诸如N-羧酸酐(N-carboxyanhydrides)(NCAs)；或酸性卤化物诸如酰基氟以及酰基氯。在溶液相偶联反应中可使用适当的偶联溶剂。理解所用偶联溶剂可影响形成的肽键的外消旋化作用；肽和/或肽片段的溶解性；以及偶联反应速率。在一些实施方案中，偶联溶剂包括一种或多种水_易混溶性试剂。水_易混溶性试剂的例子包括，例如，DMSOJtt啶、氯仿、二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二噁烷或其混合物。在其他的实施方案中，偶联反应可包括一种或多种非水_易混溶性试剂。示例性的非水_易混溶性溶剂是二氯甲烷。在这些实施方案中，非水_易混溶性溶剂优选地与脱保护反应相容；例如，如果优选使用非水_易混溶性溶剂，则其不会有害地影响脱保护反应。在形成肽(11)后，产物可进行脱保护，层析纯化、冻干和/或沉淀，进一步加工(例如，与另一肽反应以形成融合蛋白)；这些工艺的组合，和/或类似工艺，如果需要。例如，根据本发明，侧链保护基团和一些末端保护基团典型地在整个固相合成期间保留在肽中间片段上，并且也进入并贯穿溶液相偶联反应。通常，在溶液相偶联步骤完成后，可进行一个或多个脱保护步骤以从肽上去除一个或多个保护基团。通过全面脱保护(globaldeprotection)去除保护基团典型地采用脱保护溶液，该脱保护溶液包括酸解剂(acidolyticagent)以裂解侧链保护基团。为了全面脱保护普遍使用的酸解剂包括纯三氟乙酸(TFA)、HC1、路易斯酸诸如BF3Et2O或Me3SiBr、液态氢氟酸(HF)、溴化氢(HBr)，三氟甲磺酸及其组合。脱保护溶液还包括一种或多种适当的阳离子清除剂，例如，二硫苏糖醇、茴香醚、对甲酚、乙二硫醇或二甲硫。脱保护溶液还可包括水。如在此使用的，在脱保护组合物中存在的试剂量典型地以比率来表示，其中单个组分的量表示为以“份”计的分子(numerator)，诸如“份重量”或“份体积”，并且分母是组合物的总份数。例如，含有9055(重量/重量/重量)的TFAH2ODTT的脱保护溶液具有90/100重量份的TFA，5/100重量份的H2O以及5/100重量份的DTT。在一些实施方案中，可进行脱保护反应，其中酸解剂优选TFA在脱保护组合物中的量大于90/100重量份。其他优选的脱保护组合物包括的酸解剂的量为93/100重量份或更大，或在93/100重量份-95/100重量份的范围内。粗固体沉淀物可以多种方式纯化。根据一个说明性的策略，将粗肽溶解在缓冲液中，并通过反相层析纯化。层析片段用水稀释，并然后在反相层析介质中浓缩。层析后，可使用一种或多种策略分离肽。根据一种策略，可使用常规的冻干策略。备选地，可使用沉淀策略来分离肽。沉淀作用是特别有利的。首先，沉淀作用比冻干更为经济，并且更易于以商业规模应用。此外，鉴于冻干提供很少，如果存在任何，进一步提高肽的纯度的机会，沉淀作用能提高肽纯度，因为盐和其他可溶性纯净物保留在溶液中。盐尤其容易地被洗掉。沉淀作用提供具有非常低的残余盐含量的纯化肽。典型的层析纯化提供处于包括水和乙腈作为主要组分的液体介质中的肽。此外，往往还存在TFA抗衡离子。为了实现沉淀，需要转换抗衡离子乙酸根、柠檬酸根、琥珀酸根、有机羧酸根和/或类似物，以用于制剂配制。此种转换很容易地使用反相柱或离子交换介质来实现。此类柱也倾向于浓缩肽并将溶剂体系改变为适合肽分离的一种或多种溶剂体系。典型的所得溶剂为约4-约8重量份的乙醇比1重量份的水。在此转换后，单独使用乙醇或结合其他醇类或有机溶剂诸如乙酸乙酯沉淀来自层析的洗脱馏分。沉淀物过滤，然后用乙醇洗涤并干燥，包装，储存，进一步加工和/或另外进行处理。在一段时间诸如约10-约50分钟内加入无水，纯或变性乙醇。此添加在受控温度下诸如在-10°c至-20°c范围内的温度下进行并混合/搅动，因为已经发现这产生具有较好过滤特征的肽。现在将参考下列说明性的实施例来进一步说明本发明的原理。在下列实施例中，除非另外特意地说明，所有百分数和比值均以体积计。实施例1-在N-末端处H有Fmoc{呆护的片段(12),^MMWt(1_17)0H的固相合成A.制备Fmoc-H-Glu-负载的2CTC树脂Fmoc-H-Glu-负载的2CTC树脂与二氯甲烷混合以便溶胀树脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(S卩，10克树脂在60mlDMF中)。B.在N-末端处具有Fmoc保护的片段(12)(AA1-170H)的固相肽合成1.氨基酸偶联负载在H-Glu-树脂上的下一氨基酸为Fmoc-L-Glu(tBu)OH0过量的被保护的氨基酸(例如，1.7-2.O倍等价量)、过量的N-羟基苯并三唑(Η0ΒΤ，例如，1.7-2.O倍等价量)和过量的二异丙基乙胺(DIEA，例如，1.9-2.2倍等价量)在DMF中组合并冷却至彡5°C。得到的溶液与过量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，例如，1.7-2.O倍等价量)的DMF溶液组合。此活化的氨基酸溶液与树脂组合，然后用二氯甲烷冲洗。混悬液在<25°C下搅拌直至获得阴性茚三酮测试(如下面所提供的)(典型地在3小时内)。茚三酮测试<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>2.从树脂裂解Fmoc和侧链保护的片段通过用处于DMF溶液中的哌啶(典型地5-20%)的处理来去除Fmoc保护基团。将溶液排出，并用DMF洗涤树脂以减少残余的哌啶。对于片段中的剩余氨基酸重复氨基酸偶联和Fmoc去除的循环。所有假脯氨酸偶联物均不含H0BT。下列被保护的氨基酸是以所示的次序为此片段偶联的那些氨基酸Fmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-MetOHFmoc-L-Gln(trt)OHFmoc-L-Lys(Boc)OHFmoc-L-Leu-Ser(假脯氨酸)Fmoc-L-Asp(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Phe-Thr(假脯氨酸)Fmoc-L-Thr(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-His(trt)OH在最终的偶联后，用DMF洗涤树脂得到结合树脂的Fmoc-保护的艾塞那肽(1_17)片段，其可用符号FmocAAl-17-树脂表示，其具有假脯氨酸置换，如上面列举的氨基酸中所7J\ο使用在二氯甲烷中稀释的(例如，1%)三氟乙酸(TFA)从树脂上裂解结合树脂的FAA1-170H彡llOmin。然后加入吡啶以中和TFA。去除液体并用二氯甲烷洗涤树脂。可通过另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理及然后用吡啶处理而重复树脂_裂解，且所得溶液与第一次裂解溶液组合。3.FmocAAl-70H的沉淀FmocAA1-17OH用水提取3次。有时观察到乳液。在此情况下，如果出现乳液，则使用盐水溶液(即，饱和NaCl水溶液)来代替纯水提取液。使用反提取(向水性提取物的收集液中加入DCM)以有助于确保良好的产率。通过蒸馏减少二氯甲烷。然后加入庚烷作为抗溶剂以沉淀肽产物。备选地，产物的DCM溶液可加入至庚烷中以引起沉淀。所需的添加次序通过评价沉淀物的性质，即，过滤性，来经验性地确定。剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%。分离沉淀的FAA1-170H，用庚烷洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例2-在N-末端处具有Fmoc保护的片段(14),艾塞那肽(18_26)OH的固相合成A.制备Fmoc-H-Leu-负载的2CTC树脂Fmoc-H-Leu-负载的2CTC树脂与二氯甲烷组合以便溶胀树脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(S卩，10克树脂在60mlDMF中)。B.固相肽合成1.氨基酸偶联负载在树脂上的下一氨基酸为Fmoc-Trp(Boc)OH0过量的被保护的氨基酸(例如，1.5倍等价量)、过量的N-羟基苯并三唑(H0BT，例如，1.5倍等价量)和过量的二异丙基乙胺(DIEA，例如，1.7倍等价量)在DMF中组合并冷却至彡5°C。得到的溶液与过量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，例如，1.5倍等价量)的DMF溶液混合。此活化的氨基酸溶液与树脂混合，然后用二氯甲烷冲洗。混悬液在<25°C下搅拌直至获得阴性茚三酮测试(如上所述)(典型地3小时)。2.Fmoc去除通过用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液处理去除Fmoc保护基团。将溶液排出，并用DMF洗涤树脂以减少残余的哌啶。对于片段中的剩余氨基酸重复氨基酸偶联和Fmoc去除的循环。下列被保护的氨基酸是以所示的次序为此片段偶联的那些氨基酸Fmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-IleOHFmoc-L-PheOHFmoc-L-LeuOHFmoc-L-Arg(pbf)OHFmoc-L-ValOHFmoc-L-AlaOH在最终的偶联后，用DMF洗涤树脂得到Fmoc-保护的结合树脂的艾塞那肽(18-26)片段，其可通过符号FmocAA18-26-树脂来标识。3.从树脂的裂解使用在二氯甲烷中稀释的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)从树脂上裂解结合树脂的FmocAA18-260H彡IlOmin。然后加入吡啶以中和TFA。去除液体并用二氯甲烷洗涤树脂。可通过另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理及然后用吡啶处理而重复树脂_裂解，。4.FmocAA18-260H的沉淀FmocAA18-260H可很容易乳化。因此，不推荐水提取。而是，通过蒸馏将二氯甲烷减少至初始体积的<50%，加入处于水中的25%IPA(异丙醇)，并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<10vol%。分离沉淀的FAA18-260H，用25%IPA/水洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例3-在N-末端处具有Fmoc保护的片段(16),艾塞那肽(27_38)OH的固相合成A.制备Fmoc-H-L-Pro负载的2CTC树脂H-L-Pro树脂(2_C1_三苯甲基)与二氯甲烷组合以便溶胀树脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(S卩，10克树脂在60mlDMF中)。B.固相肽合成1.氨基酸偶联序列中的下一氨基酸Fmoc-L-Pro-OH、过量的被保护的氨基酸(例如，1.5倍等价量)、过量的N-羟基苯并三唑(Η0ΒΤ，例如，1.5倍等价量)和过量的二异丙基乙胺(DIEA，例如，1.7倍等价量)在DMF中组合并冷却至彡5°C。得到的溶液与过量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，例如，1.5倍等价量)的DMF溶液组合。此活化的氨基酸溶液与树脂组合，然后用二氯甲烷冲洗。混悬液在<25°C下搅拌直至获得阴性茚三酮测试(如上面实施例1中所提供的)(典型地3小时)。2.Fmoc去除通过用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液处理去除Fmoc保护基团。优选的步骤添加仲胺(哌嗪+HOBT(BP,5克哌嗪+1.5gHOBT/lOOmlDMF)，特别是在第二次和第三次Fmoc去除步骤之后)。将溶液排出，并用DMF洗涤树脂以减少残余的piperizine。对于片段中的剩余氨基酸重复氨基酸偶联和Fmoc去除的循环。对于片段中的剩余氨基酸重复该循环。下列被保护的氨基酸是以所示的次序为此片段偶联的那些氨基酸Fmoc-L-ProOHFmoc-L-AlaOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-ProOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Asn(trt)OHFmoc-L-Lys(Boc)OH在最终的偶联后，用DMF洗涤树脂，由此得到Fmoc-保护的结合树脂的艾塞那肽(27-38)片段，其可通过符号FmocAA27-38-树脂来标识。3.从树脂的裂解使用在二氯甲烷中稀释的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)从树脂上裂解结合树脂的FmocAA27-380H彡IlOmin。加入吡啶以中和TFA。去除溶液并用二氯乙烷洗涤树脂。可通过另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理及然后用吡啶处理而重复树脂_裂解，。4.FmocAA27-380H的沉淀FmocAA27-380H用水提取3次。如果观察到乳液，则推荐盐水溶液，如前所述。使用利用DCM的反提取，以有助于确保良好的产率。通过蒸馏减少二氯甲烷，加入庚烷并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%。分离沉淀的FAA27-38，用庚烷洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例4-溶液相肽合成向片段(16)添加丝氨酸上面实施例3中制备的片段16可通过加入(1.2倍等价量)，过量的6_氯羟基苯并三唑(6-C1-H0BT；例如，1.2-1.4倍等价量)，L_丝氨酸(tBu)酰胺(例如，1-1.2倍等价量)和DMF使丝氨酸酰胺附着于其上。溶液冷却至彡5°C并与过量的DIEA(例如，2.0倍等价量)和HBTU(例如，1.25倍等价量)组合。所得溶液保持在<0°C，直至反应完成(即，彡FmocAA27-380H，例如通过HPLC)。然后去除Fmoc保护基团。在一种方法中，将哌啶或哌嗪结合的树脂加入至反应混合物中，并且该溶液在<0°C下搅拌直至完成(即，彡FmocAA27-39NH2，例如通过HPLC)。在另一方法中，胺碱(例如，单乙醇胺、二甲胺、二丙胺、三乙胺)加入至反应混合物中，并使该溶液在下搅拌直至完成(即，<FmocAA27-39NH2，例如通过HPLC)。二氯甲烷溶液用磷酸盐缓冲液(典型地pH8-9)洗涤。二氯甲烷通过蒸馏减少。裂解溶液用水提取，然后用MTBE沉淀至圆底烧瓶中。备选地，可将肽的DCM溶液加入至MTBE中以沉淀肽。所需次序可通过评价使用各方法形成的沉淀物的特性来经验性地确定。剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%(例如，通过GC)。分离沉淀的HAA27-39NH2，用MTBE洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。(N-末端处的H参考该处的胺功能性。C-末端处的NH2参考该处的酰胺功能性。)实施例5-溶液相肽合成制备艾塞那肽(18-39)MU片段22)(C-末端处的NH2参考酰胺功能件)H-AA(27-39)NH2(1.25倍等价量)、Fmoc-AA(18-26)OH(1倍等价量)和过量的6-Cl-H0BT(例如，1.2-1.4倍等价量)溶解在DCM和DMF(191)中，并且所得溶液冷却至彡25°C。该混合物与过量的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)(4倍等价量)在DMF中组合。所得溶液保持在彡25°C，直至反应完成(8卩，彡总Fmoc-AA(18-26)0H，例如通过HPLC)。如果需要，可另外地投入原料和/或试剂。哌啶或哌嗪结合的树脂与该混合物组合，以去除Fmoc基团(g卩，彡1%Fmoc-AA(18-39)NH2；例如通过HPLC)。当完成时，该混合物与水在彡25°C下组合。将如前所述的盐水溶液加入到DCM溶液中，然后进行4次水提取。该溶液汽提干燥，并将DCM加回。通过蒸馏减少二氯甲烷。然后，加入甲基叔-丁醚(MTBE)或向MTBE中加入DCM以沉淀肽，并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%(例如，通过GC)。分离沉淀的HAA18-39NH2，用MTBE洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例6-艾塞那肽(1-39)NHJ片段11)(被完全保护的)的溶液相肽合成处于DCM中的片段22(艾塞那肽(18_39)NH2)(1倍等价量)、片段12(如上所制备的艾塞那肽(1-17))(1倍等价量)、过量的6-Cl-H0BT(例如，1.4-2倍等价量)与过量的EDAC(例如，3-4倍等价量)在彡0°C下组合。搅拌反应混合物直至反应完成(即，彡1.0%AA1-170H和彡1.5%HAA18_39NH2，例如，通过HPLC)。加入哌啶或哌嗪结合的树脂，以在彡25°C下在2小时期间内从AAF1-39NH2去除fmoc。反应物冷却至15°C。反应用水淬灭，并溶解在DCM中。然后对其进行水提取4次并汽提至干燥。任选地，可颠倒水提取和FMOC去除步骤。AAH1-39NH2溶解在DCM中。实施例7-全面脱保护AAl-39Mi为艾塞那肽来自前面实施例的二氯甲烷溶液与三氟乙酸、水和二硫苏糖醇(例如，1/0.08/0.012wt%)组合。混合物在彡24°C下搅拌至多3小时，然后冷却至彡0°C。混合物保持在氮气中。逐滴加入冷MTBE以从反应混合物中沉淀肽。产物浆料在0°C下搅拌lhr。通过过滤分离固体，用MTBE洗涤，并在彡35°C下真空干燥。实施例8-脱羧IPA，单乙醇胺或，DIEA和乙酸(例如，2811ν/ν/ν)与脱保护的肽在35°C下预混并搅拌3hr。反应物在0°C下冷却。过滤HAA1-39NH2，用IPA冲洗，并在彡35°C下真空干燥。实施例9-纯化实施例9描述通过在高pH下使用梯度#1的反相层析纯化粗制的全面脱保护的艾塞那肽。如下面的步骤中所述，在实施例9中使用下列的装置四元泵高效液相层析(QuaternarypumpHighPerformanceLiquidChromatography)(HPLC)系统，UV检测器禾口馏分收集系统。如下面步骤中所述，在实施例9中使用下列的试剂HPLC级乙腈(ACN)、蒸馏水、乙酸铵NH4OAcACS级，以及氢氧化铵NH4OHACS级。实施例9的步骤描述如下步骤1.如下制备流动相A和B流动相A通过将4gNH4OAc和2mLNH4OH混合到1700mLH2O中来制备。进行混合直至固体溶解。混合后，加入300mLACN。流动相B通过将4gNH4OAc和2mLNH4OH混合到500mLH2O中来制备。进行混合直至固体溶解。混合后，加入1500mLACN。步骤2.安装柱并设定下列的操作参数层析条件柱KromasilC4IOym2cmx250mm炉环境流速15.5mL/min检测器波长VWD:280nm注射体积800mg包含的艾塞那肽/50%样品/50%H2O0如在本说明书中使用的，术语“粗”指整个样品。术语“包含的”是在整个样品中的艾塞那肽的量。例如，如果粗产物为50%纯，则每称量Ig得到0.5g实际的艾塞那肽。运行时间62分钟+样品加样时间步骤3-在将样品加样至柱中之前将样品通过5μm疏水PTFE滤器过滤。步骤4-将样品加样至柱中。在加样之前，在初始条件下调节柱，直至获得稳定的基线。表9-梯度#1<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>运行后时间(Posttime)(再平衡时间):10min.步骤5.从10.0分钟至17.5分钟收集馏分，30-60个秒切片(secondslices)。步骤6.馏分汇集标准收集和汇集>97.0%面积归一化(areanormalization)的馏分以分离和沉淀。收集<97.0%面积归一化的物质如下收集在97.0%馏分作为前段(frontends)组合以前收集馏分，且在97.0%馏分作为后段(backends)组合之后收集馏分。然后，如果需要，将前段和后段再层析。实施例10-纯化实施例10描述通过在低pH下使用梯度#2的反相层析纯化粗制的全面脱保护的艾塞那肽。如下面的步骤中所述，在实施例10中使用下列的装置四元泵HPLC系统，UV检测器和馏分收集系统。如下面步骤中所述，在实施例10中使用下列的试剂HPLC级乙腈(ACN)、蒸馏水和三氟乙酸(TFA)。实施例10的步骤描述如下步骤1.如下制备流动相A和B流动相A通过将1802.3gH20,152.OgACN和3.OgTFA/2升流动相A(S卩，1800mLH2O,200mLACN,2mLTFA)组合来制备。流动相B通过将1005.2gH2CK773.7gACN和3.OgTFA/2升流动相B(即，IOOOmLH20，IOOOmLACN禾口2mLTFA)组合来制备。步骤2.安装柱并设定下列的操作参数层析条件柱PhenomenexLunaC18(2)2cmx250mm炉环境、流速5.OmL/min检测器波长VWD:218nm注射体积lg实际的粗艾塞那肽/20mLH20(360mg包含的艾塞那肽)运行时间60分钟+样品加样时间在将样品加样至柱中之前将样品通过5μm疏水性PTFE滤器过滤。步骤3-将样品加样至柱中。在加样之前，在初始条件下调节株，直至获得稳定的基线。表10-梯度#2:<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>运行后时间20min.步骤4.从18.5分钟至43.5分钟收集馏分，通过峰顶取15个秒切片，并且在峰的前侧和后侧上取30-60个秒切片。步骤5.汇集馏分如下为了前段，后段，(85%面积归一化，且为了在高pH柱上纯化，汇集彡85%。实施例11-纯化实施例11描述通过在低pH下使用梯度#3的反相层析纯化粗制的全面脱保护的艾塞那肽。如下面的步骤中所述，在实施例11中使用下列的装置四元泵HPLC系统，UV检测器和馏分收集系统。如下面步骤中所述，在实施例11中使用下列的试剂HPLC级乙腈(ACN)、蒸馏水、四氢呋喃(THF)、三氟乙酸(TFA)、冰乙酸HPLC，U.S.P.或ACS级，三水乙酸钠HPLC，U.S.P.或ACS级以及L-甲硫氨酸98%+或等价物。实施例11的步骤描述如下步骤1.如下制备流动相A和B流动相A通过将1802.3gH20,152.OgACN和3.OgTFA/2升流动相A(即，1800mLH2O,200mLACN,2mLTFA)组合来制备。流动相B通过将1005.2gH20,531.4gACN,261.5gTHF和3.OgTFA/2升流动相B(即，IOOOmLH20、700mLACN、300mlTHF禾口2mLTFA)组合来制备。注意THF不含过氧化物。过氧化物清除剂溶液制备1.63g三水乙酸钠、1.49gL-甲硫氨酸和1.08g乙酸加入至IOOOmLH2O中。步骤2.安装柱并设定下列的操作参数层析条件柱Kromasil100-10—C18lcmx250mm炉环境流速3.6mL/min检测器波长VWD:280nm注射体积IOOmg包含的艾塞那肽/20mL，流动相A运行时间50分钟+样品加样时间步骤3-在将样品加样至柱中之前将样品通过5μm疏水PTFE滤器过滤。步骤4-将样品加样至柱中。在加样之前，在初始条件下调节柱，直至获得稳定的基线。表11-梯度#3:时间流动~~~%A~~%BminmL/min初始361000加样Γθ000.01367003θΓθ~24.03622Γθ780~24.0122Γθ78Γθ~24.10O100.040.036O100.0运行后时间20min.步骤5.从16.0分钟至22.0分钟收集馏分，15-30个秒切片。步骤6.将等体积的清除剂溶液加入至收集的各馏分中，在N2和0_6°C下储存。步骤7.汇集馏分如下为了前段，后段，(85%面积归一化，且为了在高pH柱上纯化，汇集彡85%。实施例12-纯^实施例12描述通过在低pH下使用梯度M的反相层析纯化粗制的全面脱保护的艾塞那肽。如下面的步骤中所述，在实施例12中使用下列的装置四元泵HPLC系统，UV检测器和馏分收集系统。如下面步骤中所述，在实施例12中使用下列的试剂HPLC级乙腈(ACN)、蒸馏水和三氟乙酸(TFA)。实施例12的步骤描述如下步骤1.如下制备流动相A和B流动相A通过将1802.3gH20,152.OgACN和3.OgTFA/2升流动相A(即，1800mLH2O,200mLACN,2mLTFA)组合来制备。流动相B通过将1005.2gH20,773.7gACN和3.OgTFA/2升流动相B(即，IOOOmLH2O,IOOOmLACN禾口2mLTFA)组合来制备。步骤2.安装柱并设定下列的操作参数层析条件柱Kromasil100-10—C18lcmx250mm炉环境流速3.6mL/min检测器波长VWD:280nm注射体积IOOmg包含的艾塞那肽/20mL，流动相A运行时间60分钟+样品加样时间步骤3.在将样品加样至柱中之前将样品通过5μm疏水性PTFE滤器过滤。步骤4.将样品加样至柱中。在加样之前，在初始条件下调节柱，直至获得稳定的基线。表12-梯度#4时间~~流动~~%A~%BminmL/min初始Γθ1000加样Γθοο0.01Γθ78Γθ2Ζ0~~IToΓθ227ο78Γθ~~14.013Γθ227ο78Γθ~~14.103ΓθOO100.0~30.0ΓθOO100.0~运行后时间20min.步骤5.从14.0分钟至24.0分钟收集馏分，15-30个秒切片。步骤6.汇集馏分如下为了前段，后段，(85%面积归一化，且为了在高pH柱上纯化，汇集彡85%。实施例13-艾塞那肽(1-19)的固相肽合成Α.制备Fmoc-L-Val负载的树脂FmocL缬氨酸树脂(2_C1_三苯甲基)(1倍等价量)与二氯甲烷组合以便溶胀树月旨，并用N,N二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(即，10克树脂在60mlDMF中)。B.固相合成l.Fmoc(1-19)的氨基酸偶联负载在H-Val-树脂上的下一氨基酸为Fmoc-L-Ala0H。过量的被保护的氨基酸(例如，1.7-2.O倍等价量)、过量的N-羟基苯并三唑(H0BT，例如，1.7-2.O倍等价量)和过量的二异丙基乙胺(DIEA，例如，1.9-2.2倍等价量)在DMF中组合并冷却至彡5°C。得到的溶液与过量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，例如，1.7-2.O倍等价量)的DMF溶液组合。此活化的氨基酸溶液与树脂组合，然后用二氯甲烷冲洗。混悬液在<25°C下搅拌直至获得阴性茚三酮测试(如上所述)(典型地3小时)。2.Fmoc去除通过用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液处理去除Fmoc保护基团。将溶液排出，并用DMF洗涤树脂以减少残余的哌啶。对于片段中的剩余氨基酸重复氨基酸偶联和Fmoc去除的循环。所有假脯氨酸偶联物均不含HOBT。下列被保护的氨基酸是以所示的次序为此片段偶联的那些氨基酸Fmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-MetOHFmoc-L-Gln(trt)OHFmoc-L-Lys(Boc)OHFmoc-L-Leu-Ser(假脯氨酸)Fmoc-L-Asp(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Phe-Thr(假脯氨酸)Fmoc-L-Thr(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-His(trt)OH在最终的偶联后，用DMF洗涤树脂得到Fmoc-保护的结合树脂的艾塞那肽(1_19)片段，其可通过符号FmocAAl-19-树脂来标识，其具有假脯氨酸置换，如上面列举的氨基酸中所示。3.从树脂的裂解使用在二氯甲烷中稀释的(例如，1%)三氟乙酸(TFA)从树脂上裂解结合树脂的FAA1-190H≤llOmin。然后加入吡啶以中和TFA。去除液体并用二氯甲烷洗涤树脂。可通过另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理，及然后用吡啶处理来重复树脂_裂解，且所得溶液与第一次裂解溶液组合。4.FmocAAl-190H的沉淀FmocAAl-190H用水提取3次。如果观察到乳液，则推荐盐水溶液。使用DCM的反提取用于协助确保良好的产率。通过蒸馏减少二氯甲烷，加入庚烷以沉淀肽，并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%。分离沉淀的FAA1-19，用庚烷洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例14-Fmoc保护的艾塞那肽(20_29)的固相肽合成A.制备Fmoc-H-Gly-负载的树脂H-Gly-树脂(2_C1_三苯甲基)(1倍等价量)与二氯甲烷组合以便溶胀树脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(即，10克树脂在60mlDMF中)。B.固相合成1.氨基酸偶联负载在树脂上的下一氨基酸为Fmoc-Asn(trt)OH。过量的被保护的氨基酸(例如，1.5倍等价量)、过量的6C1N-羟基苯并三唑(6C1Η0ΒΤ，例如，1.5倍等价量)和过量的N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC，例如，1.7倍等价量)在DMFDMSO二甲基亚砜(11)中组合并冷却至<25°C。此活化的氨基酸溶液与树脂组合，然后用二氯甲烷冲洗。混悬液在^25°C下搅拌直至获得阴性茚三酮测试(如上所述)(典型地3小时)。2.Fmoc去除通过用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液处理去除Fmoc保护基团。将溶液排出，并用DMF洗涤树脂以减少残余的哌啶。对于片段中的剩余氨基酸重复氨基酸偶联和Fmoc去除的循环。下列被保护的氨基酸是以所示的次序为此片段偶联的那些氨基酸Fmoc-Lys(Boc)OHFmoc-LeuOHFmoc-L-Trp(Boc)OHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-IleOHFmoc-L-PheOHFmoc-L-LeuOHFmoc-L-Arg(Pbf)OH在最终的偶联后，用DMF洗涤树脂得到Fmoc-保护的结合树脂的艾塞那肽(20-29)片段，其可通过符号FmocAA20-29-树脂来标识。3.从树脂的裂解使用在二氯甲烷中稀释的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)从树脂上裂解结合树脂的FmocAA20-290H彡IlOmin。加入吡啶以中和TFA。去除液体并用二氯甲烷洗涤树脂。可通过另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理，及然后用吡啶处理来重复树脂_裂解，。4.FmocAA20-290H的沉淀FmocAA20-290H可以很容易乳化。因此，不推荐水提取。而是，通过蒸馏减少二氯甲烷，加入25%IPA(异丙醇)/水，并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%。分离沉淀的FAA20-290H，用25%IPA/水洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例15-艾塞那肽(30-38)的固相肽合成A.制备H-L-Pro-负载的树脂H-L-Pro树脂(2_C1_三苯甲基)(1倍等价量)与二氯甲烷组合以便溶胀树脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(即，10克树脂在60mlDMF中)。B.固相合成1.氨基酸偶联序列中的下一氨基酸Fmoc-L-Pro-OH，过量的被保护的氨基酸(例如，1.5倍等价量)、过量的N-羟基苯并三唑(Η0ΒΤ，例如，1.5倍等价量)和过量的二异丙基乙胺(DIEA，例如，1.7倍等价量)在DMF中组合并冷却至彡50C。得到的溶液和DMF溶液和过量2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，例如，1.5倍等价量)组合。此活化的氨基酸溶液与树脂组合，然后用二氯甲烷冲洗。混悬液在<25°C下搅拌直至获得如上所述的阴性茚三酮测试(典型地3小时)。2.Fmoc去除通过用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液处理去除Fmoc保护基团，只除了第二个和第三个Pro使用哌嗪以外。将溶液排出，并用DMF洗涤树脂以去除残余的碱。对于片段中的剩余氨基酸重复氨基酸偶联和Fmoc去除的循环。对于片段中的剩余氨基酸重复该循环。下列被保护的氨基酸是以所示的次序为此片段偶联的那些氨基酸Fmoc-L-ProOHFmoc-L-AlaOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-ProOHFmoc-L-GlyOH在最终的偶联后，用DMF和然后用二氯甲烷洗涤树脂得到Fmoc-保护的基于树脂的艾塞那肽(30-38)片段，其可通过符号FmocAA30-38-树脂来标识。3.从树脂的裂解使用在二氯甲烷中稀释的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)从树脂上裂解结合树脂的FmocAA30-380H^IlOmin0加入吡啶以中和TFA。去除液体并用二氯乙烷洗涤树脂。可通过另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理及然后用吡啶处理来重复树脂_裂解，。4.片段的沉淀艾塞那肽(30-38)OH用水提取3次。如果观察到乳液，则推荐盐水溶液。使用DCM的反提取用于确保良好的产率。通过蒸馏减少二氯甲烷，加入庚烷，并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%。分离沉淀的FAA30-38，用庚烷洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)O实施例16-艾塞那肽(30-39)Mi的溶液相肽合成FmocAA30-380H(l.2倍等价量)、过量的6_氯-1-羟基苯并三唑(6-C1-H0BT；例如，1.2-1.4倍等价量)，L-丝氨酸(tBu)酰胺(例如，1-1.2倍等价量)和DMF组合。该溶液冷却至≤5°C并与过量的DIEA(例如，2.O倍等价量)和HBTU(例如，1.2倍等价量)组合。所得溶液保持在≤0°C，直至反应完成(S卩，≤FmoCAA27-380H，例如通过HPLC)。反应混合物与稀释的乙酸水溶液(典型地3%-5%)在25°C下组合。二氯甲烷溶液用稀释的碳酸氢钠水溶液(典型地2%-3%)洗涤，并进行两次水洗涤，然后汽提至油。推荐采用二氯甲烷反提取。为了去除Fmoc保护基团，将哌啶或哌嗪结合树脂加入至反应混合物中，并且使溶液在≤0°C下搅拌直至完成(即，≤1%FmocAA30-39NH2；例如通过HPLC)。通过蒸馏减少二氯甲烷，加入甲基叔-丁醚(MTBE)以沉淀肽，并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%(例如，通过GC)。分离沉淀的HAA30-39NH2，用MTBE洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例17-ImSBflt(20-39)NH,的溶液相flt合成H-AA(30-39)NH2(1.25倍等价量)、Fmoc-AA(20-29)OH(1倍等价量)和过量的6-Cl-H0BT(例如，1.2-1.4倍等价量)溶解在DCM中。该溶液冷却至≤25°C，并与过量的DIEA(例如，2.7倍等价量)和HBTU(例如，1.2倍等价量)组合。所得溶液保持在<25°C，直至反应完成(即，≤总Fmoc-AA(20-29)0H，例如通过HPLC)。如果需要，可另外地投入原料和/或试剂。哌啶或哌嗪结合的树脂与该混合物组合以去除Fmoc基团(即，<Fmoc-AA(20-39)NH2；例如通过HPLC)。当完成时，该混合物与盐水洗涤液组合，并然后在<25°C下4x水洗涤。使用二氯甲烷的反提取用于提高产率。通过蒸馏减少二氯甲烷，加入甲基叔-丁醚(MTBE)，并且剩余的二氯甲烷进一步通过蒸馏减少至<25vol%(例如，通过GC)。分离沉淀的HAA20-39NH2，用MTBE洗涤，然后真空干燥(35°C，最大)。实施例18-艾塞那肽(1-39)NHJ被完全保护)的溶液相肽合成DCM中的HAA20-39NH2(1倍等价量)、AAF1_190H(1倍等价量)、过量的6-C1-H0BT(例如，1.5-2倍等价量)与过量的HBTU和DIEA在≤0°C下混合。搅拌反应混合物直至反应完成(即，≤1.0%AA1-190H和彡1·5%ΗΑΑ20-39ΝΗ2，例如，通过HPLC确定)。冷却反应器至15°C，用DCM猝灭，并暖化至25°C。用水进行水提取2次。浓缩DCM层。加入哌啶或哌嗪结合的树脂以去除Fmoc，从而在≤25°C下2小时的期间内提供AAF1-39NH2。AAH1-39NH2溶解在DCM中。备选的途径是在活化反应前5分钟时，使用处于DMF中的DIC(N，N，-二异丙基碳二亚胺)/代替HBTU/DIEA，将反应物冷却至0°C。活化后等待5分钟。然后暖化样品至室温(25°C)。进行水提取和然后去除Fmoc保护可增加wt/wt值。也可尝试Fmoc去除，和然后进行水提取。实施例19-艾塞那肽(1-39)Mi的全面脱保护来自前面步骤的二氯甲烷溶液与三氟乙酸、水和二硫苏糖醇(例如，1/0.08/0.012比值)组合。该混合物在<24°C下搅拌至多3小时，然后冷却至<0°C。一直保持在氮气中。逐滴加入冷MTBE以从反应混合物中沉淀肽。一旦所有肽在MTBE中，则搅拌lhr。通过过滤分离固体，用MTBE洗涤，并在彡35°C下真空部分干燥。实施例20-脱羧遵照上面实施例8概述的流程来对实施例19的脱保护的肽进行脱羧。实施例21-纯化分别遵照实施例9-12中概述的流程，以纯化实施例20的脱羧的肽。实施例22-层析后进行的浓缩和分离所有溶液在使用前应该通过用氮气吹扫至少10分钟来进行脱氧。将含有产物的所有溶液保持在氮气中。除非说明，所有操作均在室温下完成。1.通过卡尔费歇尔滴定法(KarlFischertitration)将肽溶液调节至<10%乙腈(ACN)。所有汇集的馏分用2体积水稀释。这提供校正的ACN浓度。也可使用真空蒸馏来去除乙腈。2.以约2ml/min向Amberchrome柱加样(见下面的柱制备)。3.用1柱体积的0.5M(38.5g/l)乙酸铵以约4ml/min洗涤以去除HPLC缓冲液。4.用1柱体积的2_5wt%乙酸溶液以约4ml/min洗涤。5.用1柱体积的水以约4ml/min洗涤。6.用8020(wt/wt)Et0H(2B)洗脱水处于约2ml/min的流速。7.收集馏分。肽应该在空隙体积(voidvolume)后立即洗脱。在洗脱期间可增加乙醇浓度，或可单独地收集尾段用于下一轮再注射。8.可通过用4柱体积水冲洗重建柱。9.可通过将乙醇/水共沸物蒸馏掉来进行进一步浓缩。10.向产物馏分中随着搅动加入乙醇(2B)以沉淀肽。约10-15体积乙醇用于沉淀。11.随着搅动冷却至<0°C并保持至少2小时。12.可使用有机共溶剂诸如甲苯、MTBE或乙酸乙酯来提高沉淀的产率。13.使用氮气压力通过标定1μm滤膜压力滤液。如果其混浊则将第一部分再循环。保持滤器冷却。14.用IOml/克Et0H(2B或可使用纯乙醇)冲洗。持续吹氮直至干燥。在干燥期间，滤器可升温至25°C。15.在减压下继续干燥直至达到所需的残留溶剂水平。16.在发现滤器和包装之前对残留溶剂取样。Amberchrome柱的制备1.Amberchrome在获得时为处于乙醇中的50%浆料，在加样前将浆料至少确认一次。2.沉降30min并倒掉细粒。加回等体积水。3.将浆料倒入柱中。打开阀门并排掉过量的液体。4.用2柱体积水洗柱。5.在加样前排掉高于树脂床的所有液体。实施例23下面是在层析后进行的艾塞那肽的实施例。2.5x17cmAmberchromeCM树脂装填在低压玻璃柱中并用去离子水平衡。含有4.7g纯化肽的体积为950ml的纯化肽溶液以至多4ml/分钟的速率加样至柱上。肽溶液应当被稀释至大于90%的水溶液浓度。当加样时，肽结合的树脂用120ml0.IM乙酸铵水溶液洗涤，然后用120ml2%乙酸水溶液洗涤。然后用51的乙醇水的溶液洗脱肽，并收集含产物的馏分。然后所收集的约150ml的浓缩溶液通过以约30ml/分钟的速率加入800ml乙醇而被沉淀。然后浆料冷却至_20°C并保持2小时。通过加入70ml乙酸乙酯并另外保持30分钟来完成沉淀作用。浆料通过多孔玻璃漏斗过滤，并用200ml乙醇洗涤。在氮气流和减压下，在室温下干燥湿饼直至完全干燥。这样产生了3.8克干燥的纯化肽。权利要求一种促胰岛素肽片段，包括包括至少两个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu)的氨基酸序列，并且还包括至少一个假脯氨酸结构部分的残基，所述片段任选地含有侧链保护。2.如权利要求1所述的促胰岛素肽片段，其中一个或两个假脯氨酸残基在所述谷氨酸残基的重复序列和所述片段的N-末端之间。3.如权利要求1所述的促胰岛素肽片段，其中所述片段包括至少15个氨基酸的残基，其中每个引入至所述片段中的假脯氨酸残基计数为两个氨基酸残基。4.如权利要求3所述的促胰岛素肽片段，其中所述片段包括至少17个氨基酸的残基。5.如权利要求1-4中任意一项所述的促胰岛素肽片段，包括SEQIDNo.34的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中选自Gly-Thr(4-5)、Phe-Thr(6-7)、Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一个位置被假脯氨酸置换，所述片段任选地含有侧链保护基团。6.如权利要求1-5中任意一项所述的促胰岛素肽片段，其中所述片段选自由下列各项组成的组His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.2)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.3)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.4)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.5)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.6)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.7)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.8)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.9)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.10)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.11)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.12)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.13)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xlo-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.14)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.15)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.16)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.17)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.18)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.19)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.20)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.21)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.22)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.23)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.25)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.26)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.27)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.28)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.29)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.30)，和His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.31)，其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位处的假脯氨酸X4-X5对应于Gly-Thr或其对应物；6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thre或其对应物；7和8位处的假脯氨酸X7-X8对应于Thr-Ser或其对应物；以及10和11位处的假脯氨酸Xltl-X11对应于Leu-Ser或其对应物。7.如权利要求1-6中任意一项所述的促胰岛素肽片段，其中所述片段具有下式His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thre或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物。8.一种制备促胰岛素肽的方法，包括以下步骤a)制备包括氨基酸序列的第一肽片段或其对应物，所述氨基酸序列包括至少两个直接连续的谷氨酸(Glu-Glu)并还包括假脯氨酸；以及b)将所述肽片段与第二肽片段偶联以获得所述促胰岛素肽。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一肽片段是包括SEQIDNo.34的氨基酸序列的片段His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中选自Gly-Thr(4-5)、Phe-Thr(6-7)、Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一个位置被假脯氨酸置换，所述片段任选地含有侧链保护。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述第一肽片段选自由下列各项组成的组His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.2)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.3)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.4)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.5)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.6)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.7)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.8)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.9)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.10)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.11)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.12)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.13)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X1c1-X11-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.14)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.15)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.16)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.17)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.18)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.19)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.20)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.21)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.22)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.23)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X1c1-X11-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.25)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.26)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.27)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.28)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.29)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.30)，和His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.31)，其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位处的假脯氨酸X4-X5对应于Gly-Thr或其对应物；6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thre或其对应物；7和8位处的假脯氨酸X7-X8对应于Thr-Ser或其对应物；以及10和11位处的假脯氨酸Xltl-X11对应于Leu-Ser或其对应物，并且所述片段任选地含有侧链保护基团。11.如权利要求8所述的方法，其中所述第一肽片段具有下式His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，其中6和7位处的假脯氨酸X6-X7对应于Phe-Thre或其对应物以及10和11位处的假脯氨酸Xici-X11对应于Leu-Ser或其对应物，所述片段任选地含有侧链保护基团。12.如权利要求8所述的方法，其中所述第二肽片段选自由下列各项组成的组Alal8-Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-S32er-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.46)，Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gl34y_Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.47)，Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-S33er-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.48)，Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-G34Iy-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.49)，所述片段任选地含有侧链保护基团。13.如权利要求8所述的方法，其中所述促胰岛素肽为艾塞那肽(exenatide)(1-39)或其对应物。14.一种促胰岛素肽，包括脯氨酸的至少一个残基；至少两个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu)；以及任选地至少一个保护基团。15.如权利要求14所述的促胰岛素肽，其中所述肽是艾塞那肽(1-39)的对应物。16.如权利要求14或15所述的促胰岛素肽，其中所述肽是艾塞那肽(1-39)的对应物，所述对应物与艾塞那肽(1-39)的不同之处在于将假脯氨酸的至少一个残基引入至所述肽中的修饰。17.根据权利要求33所述的促胰岛素肽，其中所述肽包括根据SEQIDNo.50-79的任意一个的至少一条氨基酸序列或其对应物。18.一种肽片段，其选自由根据SEQIDNo.35-39的任意一个的片段组成的组，或其对应物。19.一种肽片段，其选自由根据SEQIDNo.40-42的任意一个的片段组成的组，或其对应物。20.一种肽片段，其选自由根据SEQIDNo.43-45的任意一个的片段组成的组，或其对应物。21.一种肽片段，其选自由根据SEQIDNo.46-49的任意一个的片段组成的组，或其对应物。22.—种制备促胰岛素肽的方法，包括以下步骤a)提供第一、第二和第三肽片段，所述第一肽片段包括至少两个重复Glu残基的序列并且包括假脯氨酸的至少一个残基，并且其中所述片段的任意一个任选地包括至少一个保护基团；b)将丝氨酸残基与所述第三肽片段偶联以获得第四肽片段；c)将所述第四片段与所述第二片段偶联以获得第五片段；和d)将所述第五肽片段与所述第一肽片段偶联以获得促胰岛素肽。23.权利要求22所述的方法，还包括以下的步骤e)层析纯化所述肽；和f)沉淀所述纯化的肽。24.如权利要求22或23所述的方法，其中步骤a)包括提供包括SEQIDNo.34的氨基酸序列的第一肽片段His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中选自Gly-Thr(4-5)、Phe-Thr(6-7)、Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一个位置被假脯氨酸置换，所述片段任选地含有侧链保护。25.如权利要求22或23所述的方法，其中步骤a)包括提供第一肽片段，所述第一肽片段选自由根据SEQIDNo.2-31的任意一个的片段组成的组。26.如权利要求22或23所述的方法，其中步骤a)包括，提供选自由根据SEQIDNo.2-31的任意一个的片段组成的组的第一肽片段或其对应物，选自由根据SEQIDNo.35、37-39的任意一个的片段组成的组的第二肽片段或其对应物和选自由根据SEQIDNo.41或42的片段组成的组的第三肽片段或其对应物。27.如权利要求22或23所述的方法，其中所述第一、所述第二和所述第三片段利用固相合成技术合成。28.如权利要求22或23所述的方法，其中所述第四和第五片段以及所述促胰岛素肽在溶液相中形成。29.如前文中所述的发明。全文摘要本发明涉及使用固相和溶液相(“混合”)途径合成的包括至少两个直接连续的谷氨酸残基(Glu-Glu)的促胰岛素肽的制备。一般地，该途径包括使用固相化学合成三个不同的肽中间片段。然后使用溶液相化学将另外的氨基酸物质添加至片段之一上。然后这些片段在溶液相中偶联在一起。在片段之一中使用假脯氨酸便于该片段的固相合成，并且还便于随后该片段与其他片段的溶液相偶联。本发明对于形成促胰岛素肽诸如艾塞那肽(exenatide)(1-39)及其对应物是非常有用的。文档编号C07K1/107GK101835794SQ200880112874公开日2010年9月15日申请日期2008年10月17日优先权日2007年10月27日发明者保罗·亚当·白瑞,布拉德利·S·德霍夫,理查德·A·加贝尔,约翰·爱德华·卡里德尔,罗伯特·萨德·卡尔二世,贝利·托马斯·金申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司