与黑麦的cbf转录因子相关的调节元件的制作方法

专利名称：与黑麦的cbf转录因子相关的调节元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域，更具体而言，涉及植物中基因表达的调节。
背景技术：
植物宿主中异源DNA序列的表达取决于在该植物宿主中有功能的可操作地连接的调节元件的存在。调节元件的选择将确定异源DNA序列在有机体中表达的时间和位置。 当在整个植物细胞和/或整个发育中期望连续表达时，使用组成型启动子。相反地，当期望 对刺激应答的基因表达时，诱导型启动子是调节元件的选择。当期望在特定组织或器官中 的表达时，可以使用组织特异性或组织优选启动子(tissue-preferredpromoters)。S卩，它 们可以专门或优选在特定组织或器官中驱动表达。这些启动子暂时是组成型或诱导型的。 在任何情况下，可以将核心启动子序列上游和/或下游的其他调节序列包括在转化载体的 表达构建体中，以使转基因植物中异源核苷酸序列的表达水平发生变化。由于这个领域的发展以及可以获取更多的基因，所以亟需用多基因转化的植物。 这些外源多基因通常需要不同的调节序列来进行控制。而且，某些基因需要组成型调节，而 其他基因应当在转基因有机体的某些发育阶段或位置表达。因此，亟需具有不同作用的各 种调节序列。还亟需多调节序列(multiple regulatory sequences)来避免利用相同的调节序 列来控制多于一个基因所导致的不期望的分子相互作用。与非生物应激应答相关的早期感知基因(sensing genes)和信号基因的转基因 调节要求转基因暴露于应激早期时表达且以中等水平表达。此外，需要在应激暴露的较晚 阶段关闭这类转基因的表达，从而避免下游靶标的连续诱导，这是一种容易导致产量损失 (penalty)的方案。本发明提供了调节序列，其可用来早期表达和严紧调节用于植物应激耐 性的转基因调节的信号基因与感知基因。本发明人在本文中公开了与应激相关转录因子相关的启动子的分离和表征，该启 动子能够充当分离的感兴趣的核苷酸序列表达的调节元件，借此影响植物的各种性状。可 选择地或另外地，该启动子可用于驱动可评分的标志物。发明概述本发明提供了调节转录且响应非生物应激而被诱导的植物启动子。在某些实施方案中，所述启动子以应激应答的方式驱动转录，其中所述启动子包 含选自以下的核苷酸序列a)与编码黑麦(黑麦(Secale cereale))的CBF31转录因子的DNA天然相关并调 节其表达的序列；b) SEQ ID NO 1所列的核苷酸序列；c)包含SEQ ID NO=I所列核苷酸序列的片段的序列；以及d)具有与SEQ ID NO :1足够的同一性以作为应激应答启动子发挥功能的核苷酸 序列。其他实施方案涉及包含上述核苷酸序列的表达盒、转化载体、植物、植物细胞和植物部分。本发明还涉及在植物和植物细胞中使用所述序列的方法。本发明的实施方案还包 括可操作地连接至可检测标志物的上述核苷酸。附图简述

图1是表示在黑麦的秧苗芽(seedling shoots)中的ScCBF31的基因表达的RNA 印迹(Northern blot)，如实施例4所述，对该黑麦进行了时程(time-course)的冷诱导。图2表示ScCBF31的调节序列(1949个碱基对)。标记了推断的顺式作用元件，其 包括CAAT盒与TATA盒(双下划线)、CRT/DRE共有序列(方框和粗体)以及myc结合序列 (方框)。粗体和下划线表示翻译起始位点ATG，其后是一部分编码序列。在序列表中的SEQ ID NO 1也表示了调节区的全部特征。包括图2中所示的部分编码区，作为SEQ ID NO :6。发明详述本文所引用的全部公开都通过引用并入。除非另外定义，本文中所用的全部技术和科学术语都与本发明所属领域的技术人 员通常理解的具有相同的含义。除非另有指出，本文所用或包括的技术是本领域技术人员 熟知的常规方法。材料、方法和实例仅作为示例而不是限制。植物通过基因表达的调节来适应环境应激，例如，寒冷、干旱和盐度。应激诱导基 因的启动子区可以包含顺式作用元件，其是反式作用因子所识别的DNA片段。反式作用因 子包括植物激素刺激的蛋白，例如脱落酸(ABA)，已证实ABA结合ABA应答元件(ABRE)；参 见，例如 Yamaguchi-Shinozaki，et al. ， (2005) Trends in Plant Science 10(2) :88_94。 其他反式作用因子包括能够结合调节DNA并与其他分子相互作用的核蛋白，特别是DNA聚 合酶III，以起始可操作地连接至所述调节DNA的DNA的转录。这些转录因子可以作为共 享DNA结合结构域的相关蛋白的家族存在。转录因子基因自身可以被应激诱导。而且，顺 式调节的基因的下游靶标可以是转录因子，从而产生基因应答级联的复杂网络。DRE/CRT(脱水应答元件/C-重复)顺式元件对应激应答而起作用，并且在许 多植物物种中得到了鉴定，例如拟南芥、大麦、芸苔、柑桔、棉、桉树、玉米、甜瓜、胡椒、水 稻、大豆、烟草、番茄和小麦。DRE/CRT元件包含核心结合位点即A/GCCGAC，其被称为 DREBl (DRE-结合)和CBF(C-重复结合因子)的反式作用因子识别。接近顺式元件和/或 多顺式因子的次级结构看起来是应激诱导表达所需的其他成分。(综述参见，Agarwal，et al.，(2006)Plant Cell Rep 25 :1263_1274 ；Yamaguchi-Shinozakiand Shinozaki,(2005) Trends in Plant Science 10(2) :88_94)。CBF/DREB基因的启动子区可以包含顺式作用 元件，例如 ICErl 和 ICEr2(Zarka，et al.，(2003) Plant Physiol. 133 910-918 ；Massari and Murre, (2000)Mol. Cell. Bio. 20 429-440)。其他转录因子诱导MYC和MYC样蛋白(参见，例如，Zhu, et al.，(2003) J. Biol. Chem. 278(48) :47803_47811)。本发明提供的核苷酸序列使得能调节对应激应答的转录。本发明的序列包含与应 激应答多核苷酸相关的调节元件。因此，本发明的组合物包含与编码ScCBF31的核苷酸序 列天然相关的植物调节元件的新核苷酸序列。已经公开了黑麦CBF31编码区的序列(SEQ ID NOS 121和122，美国专利申请公开号2003/0233680，其中该序列被称为CBF7)。ScCBF31属于DREBl类型的转录因子，其在暴露于生物应激早期而被诱导，例如寒 冷、干旱和盐。已知拟南芥CBF3基因的启动子含有5个myc-结合位点，并且结合称为ICEl的碱性螺旋-环-螺旋蛋白(CBF表达的诱导物)，其是CBF的上游调节蛋白。ScCBF31的 调节区的鉴定将(a)使得其用于早期感知基因和信号基因的应激诱导表达和严紧调节，以 及(b)有助于通过酵母单杂交筛查来鉴定ICEl转录因子的直系同源物，或有助于确认通过 利用电泳迁移率变动分析的序列同源性所鉴定的直系同源物的功能。将ScCBF31调节元件可操作地连接至感兴趣的序列，这将提供植物表型的修饰。 这种修饰包括调节内源产物有关量、相对分布等的产生，或者提供新功能或表达产物。例 如，这种启动子用于调节编码包括其他转录因子在内的应激诱导的蛋白的序列的表达。另外，将应激诱导的启动子与标志物连接，特别是与可视的标志物连接，可用于追踪所连接的 感兴趣的基因的表达。
本发明提供了利用本文所公开的调节序列在植物中表达分离的核苷酸序列的方 法。所述方法包括用包含可操作地连接至本发明的植物调节序列的分离的核苷酸序列的转 化载体转化植物细胞，并由转化的植物细胞再生稳定转化的植物。以这种方式，所述调节序 列用于以应激诱导的方式，控制内源以及外源产物的表达。通常，期望在有机体的组织中，或在某些环境条件下优选表达DNA序列。例如，可 通过下述方式增强植物的昆虫攻击抗性对植物的基因组进行遗传操作以包含可操作地连 接至异源杀虫基因的组织特异性启动子，从而在易感植物的组织中特异性地表达阻止昆虫 (insect-deterring)的物质。可通过下述方式增加对非生物应激的耐性对植物的基因组 进行遗传操作以包含可操作地连接至植物激素的生物合成或调节基因的应激诱导的启动 子，从而特异性地合成激素或者在应激条件下调节其合成。异源核苷酸序列在合适的组织 或在合适条件下的优选表达，减少了植物资源的消耗(drain)，当组成型启动子在整个植物 细胞和/或在全部条件下起始异源核苷酸序列转录时，发生该消耗。或者，期望抑制植物组织中DNA序列的表达，以获得期望的表型。例如，包含全部 或部分ScCBF31启动子的发夹构型可用于下调天然应激应答的ScCBF31。当应激应答的多 核苷酸的这种下调被合适地靶向时，例如，通过生殖组织优选启动子，某些植物组织可以避 免应激的不良影响。表达盒被设计为表达与其自身杂交的RNA分子以形成包含单链环区域 和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区域包含对应于启动子的所选区域的正义序列， 以及与该正义序列完全或部分互补的反义序列。发夹的表达使得可操作地连接至所述选择 的启动子的编码序列沉默。参见，例如，Mette，et al.，(2000)EMBO J 19(19) :5194_5201。 所述可操作地连接的编码序列可以是天然的或异源的。在另一实例中，将ScCBF31启动子可操作地连接至反义核苷酸序列或部分或全长 的编码序列的发夹构型，从而该反义序列或该发夹构型的应激诱导的表达，在全部植物细 胞或其子集中，产生干扰相应DNA序列的mRNA的翻译的RNA转录物。因此，分子的碱基配 对茎区通常决定RNA干扰的特异性。发夹方法在抑制靶基因的表达中非常有效。参见，Waterhouse andHelliwell, (2003)Nat. Rev. Genet. 4 =29-38,以及本文所引用的参考文献。定义对于本发明的目的，除非另外指明或从上下文显而易见，“个体植物”或“个体植物 细胞”是已实施了有关感兴趣的基因的诸如转化的遗传改变的“个体植物”或“个体植物细 胞”，或者是来源于被如此改变的植物或植物细胞且包含所述改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量个体植物或植物细胞的变化的参考点。对照植物或对照植物细胞可包含，例如，(a)野生型植物或植物细胞，即，与遗传改 变的起始材料相同的导致个体植物或个体植物细胞的表型；(b)与起始材料的表型相同的 植物或植物细胞，但是已经用空构建体进行了转化(即，用不含对感兴趣的特征具有已知 效果的构建体进行转化，例如，含有标志基因的构建体)；(c)植物或植物细胞，其是个体植 物或个体植物细胞的后代之间的未转化的分离子(segregant) ； (d)与所述个体植物或个 体植物细胞基因相同的植物或植物细胞，但是其没有暴露于诱导感兴趣的基因表达的条件 或刺激物；或者(e)处于感兴趣的基因未被表达的条件下的所述个体植物或个体植物细胞 自身。“应激诱导的”旨在表示在植物的应激的条件下优选的表达，特别是非生物应激， 例如，干旱、含量、高温或高盐度条件。“调节元件”旨在表示负责相关的编码序列表达的序列，包括但不限于启动子、终 止子、增强子、内含子等。“终止子”旨在表示使RNA聚合酶从DNA脱离的DNA的调节区，从而导致转录的终止。“启动子”旨在表示DNA的调节区，其能够调节与其连接的序列的转录。启动子通 常包含能够指导RNA转录酶II在特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒.启动子还可以包含通常位于TATA盒的上游或5’的其他识别序列，称为上游启动 子元件，其影响转录起始速率并且还包括影响连接的核苷酸序列的空间和时间表达的元 件。已经认识到，对于本文公开的启动子区已经鉴定的核苷酸序列，分离和鉴定本文所鉴定 的特定启动子区的5’上游区域其他调节元件在现有技术范围内。因此，本文所公开的启动 子区可以包含上游调节元件，例如负责编码序列的组织和时间表达的上游调节元件，并且 可以包含增强子、转录调节蛋白的DNA应答元件、核糖体结合位点、转录开始和终止序列、 翻译开始和终止序列、激活序列等。以同样的方式，能够鉴定、分离允许应激条件下表达的启动子元件，并且该启动子 元件能够与其他核心启动子一起使用。核心启动子表示起始转录所需的最小序列，例如称 为TATA盒的序列，其为编码蛋白的基因的启动子所共有。因此，ScCBF31的上游启动子能 够任选地与其自身或其他来源的核心启动子协同使用。在发现启动子的细胞中，启动子可 以是天然的或非天然的。能够修饰本发明的分离的启动子序列，以提供分离的核苷酸序列的一定范围的表 达水平。能够使用小于全部的启动子区，并且保持驱动应激诱导的表达的能力。应当认识 至|J，能够用启动子序列部分的特定缺失来调节HiRNA的表达水平。因此，能够将启动子修饰 为弱启动子或强启动子。通常，“弱启动子”旨在表示以低水平驱动编码序列的表达的启动 子。“低水平”旨在表示约1/10，000的转录至约1/100，000的转录至1/500，000的转录。 相反地，强启动子以高水平或约1/10的转录至约1/100的转录至约1/1，000的转录来驱动 编码序列的表达。通常，用分离的启动子的至少约20个核苷酸驱动核苷酸序列的表达。应当认识到，为了增加转录水平，增强子能够与本发明的启动子区联合使用。增强 子是起增加启动子区表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，并且包括SV40增强子区域、35S增强子元件等。本发明的启动子能够分离自其天然编码区的5’区域或5’未翻译区域(5’ UTR)。 同样，终止子能够分离自位于其各自终止密码子侧翼的3’区域。术语“分离的”意指诸如 核酸或蛋白的材料，(1)其基本上或实质上不含某种组分，该组分通常伴随在天然存在的环 境中发现的材料或与该材料相互作用，或者，(2)如果所述材料处在其天然的环境中，则该 材料的组成已经被故意的人为介入改变和/或被置于细胞中的位置而不是该材料天然的 位置。分离启动子区的方法在本领域是已知的。黑麦CBF31启动子列于SEQ ID NO 1中，并且长度为1949个核苷酸。在ScCBF31启动子中鉴定的基序示于图2和序列表中。可以根据基于序列同源性的已知技术，从其他植物分离启动子序列。在这些技术 中，将全部或部分编码序列用作探针，该探针与存在于来自所选的有机体的克隆的基因组 DNA片段(即，基因组文库)的群体中的其他序列选择性杂交。用于核酸序列杂交的方法 在本领域可容易地获得。在下述文献中可找到核酸杂交的广泛指导=Tiissen, Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular BioloRY—Hybridization with Nucleic AcidProbes, Part I, Chapter 2 (生物化学和分子生物学实验室技术-核酸探针的杂交， 第一部分，第二章)“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays (核酸探针测定的杂交和策略的指导综述)”，Elsevier, New York (1993)禾口 Current Protocols in Molecular BioIory, Chapter 2 (现代分子生物 学实验技术，第二章)，Ausubel，et al.，Eds. (Ausubel 等编辑)，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York (1995)。调节序列的“功能性变体”也包括在本发明的组合物中。功能性变体包括，例如， 本发明的天然调节序列，其具有一个或多个核苷酸取代、缺失或插入，并且在类似于天然启 动子具有活性的条件的条件下驱动可操作地连接的序列的表达。本发明的功能性变体可通 过定点诱变、诱导突变来产生，或者可以作为等位基因变体存在(多态性)。如本文所用，“功能性片段”是通过较大的调节元件的一个或多个缺失形成的 截短的调节序列。例如，如 Opsahl-Sorteberg，H-G.，et al.，(2004) "Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directingaleurone cell specific expression (指导糊粉细胞特异性表达的HvLTP2启动子的49_bp片段的鉴定)”Gene 341 49-58所述，转录起始位点附近的启动子的5’部分，一直到TATA盒，可以缺失而不完全破 坏启动子活性。这类片段应当保持启动子活性，特别是驱动应激诱导的表达的能力。能 够通过RNA印迹分析、利用转录融合物时的报道基因活性测量等来测量活性。参见，例如， Sambrook, et al.，(1989)Molecular CloninR :A LaboratoryManual (分子克隆实验室手 册)(2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY),在此处通过应 用将其并入。能够通过下述方法来获得功能性片段使用限制性内切核酸酶切割本文公开的天 然存在的调节元件核苷酸序列；通过从天然存在的DNA序列合成核苷酸序列；或通过使用 PCR 技术获得。参见，特别是，Mullis, etal.，(1987)Methods Enzymo 1. 155 :335_350，和 Erlich (1989)编辑的 PCRTechnology (PCR 技术)(Stockton Press, New York)。例如，去除部分DNA序列的常规方式是使用外切核酸酶联合DNA扩增来产生双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于此目的的商业试剂盒以Ex0-SizeTM(NeW England Biolabs, Beverly, Mass.)商品名销售。简言之，这种方法需要将外切核酸酶III与DNA—起孵育， 以便逐步地以3’至5’的方向去除DNA模板的5’突出端、平末端或缺口的核苷酸。然而， 外切核酸酶不能去除3’，4碱基突出端的核苷酸。用这种酶定时消化克隆，产生单向嵌套缺 失。完全的启动子序列或其部分可以用作能够与基因组DNA中相应启动子序列特异性地杂交的探针。或者，所述探针代表与启动子序列天然相关的编码序列的片段。为了实现 在各种条件下的特异性杂交，这种探针包含独特的序列，并且长度优选为至少约10个核苷 酸，并且长度最优选为至少约20个核苷酸。这种探针能够用于通过聚合酶链式反应(PCR) 的熟知方法来从所选的有机体中扩增相应的序列。这种技术能够用于从期望的有机体分离 其他启动子序列，或者用作确定有机体中启动子序列存在的诊断测定。实例包括平板DNA 文库(plated DNA libraries)的杂交筛查(噬斑或菌落；参见，Innis，et al.，(1990)PCR Protocols, A Guide toMethods and Applications (PCR 方法，方法禾口应用指导)，eds.， AcademicPress)。当本发明公开的应激诱导的调节元件及其变体和片段与分离的感兴趣的核苷酸 序列可操作地连接时，本发明公开的应激诱导的调节元件及其变体和片段在任何植物的遗 传操作中是有用的，所述分离的核苷酸序列的表达受到控制以实现期望的表型应答。“可操作地连接”旨在表示启动子与第二序列间的功能性连接，其中启动子序列起 始并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。表达盒包括可操作地连接至至少一种感兴趣 的序列的本发明的调节序列。在一典型的实施方案中，在过量表达盒的环境中，可操作地连接表示，被连接的核 苷酸序列是相邻的，并且当需要连接两个或更多个蛋白编码区时，被连接的核苷酸序列是 邻接的并且处在相同的读框中。当表达盒在相同的读框中含有以邻接的方式连接的两个或 更多个蛋白编码区的情况下，本文将编码的多肽定义为“嵌合多肽”或“融合多肽”。表达盒 还可以含有待共转化至有机体的至少一种另外的编码序列。或者，所述另外的编码序列能 够在多表达盒上提供。本发明的调节元件能够以本领域技术人员已知的几种方法中的任何方法可操作 地连接至分离的感兴趣的核苷酸序列。能够利用如美国专利6，187，994号所述的位点特异 性性整合，将分离的感兴趣的核苷酸序列插入基因组中本发明启动子的3’的位点，在此将 该专利通过引用并入。本发明的调节元件能够和分离的感兴趣的核苷酸序列一起可操作地连接在表达 盒中，以用于植物中的表达。这种表达盒提供了多个限制性位点，用于在调节元件的转录控 制之下插入感兴趣的核苷酸序列。通过本发明的调节元件表达的分离的感兴趣的核苷酸，能够用于指导植物组织中 序列的表达。这能够通过增加内源或外源产物的表达实现。或者，结果能够通过提供一种 或多种内源产物，特别是酶或辅因子表达的减少来实现。这种下调能够通过本领域技术人 员已知的许多不同方法来实现，该方法包括反义、共抑制、使用发夹形成或其他以及下文讨 论的。应当认识到，调节元件可以与其天然编码序列或其他编码序列一起使用，来增强或减 少转化的植物或种子中可操作地连接的序列的表达。
用于本发明目的感兴趣的基因的一般种类，包括例如，与如锌指形成相关的基因； 与联系相关的基因，如激酶；以及与持家相关的基因，如热激蛋白。更具体的转基因的种类 包括编码农学、昆虫抗性、抗病性、除草剂抗性的重要性状以及谷物特征的基因。转基因仍 然的其他种类包括诱导外源产物的合成的基因，所述外源产物如酶、辅因子和来自植物及 其他真核或原核有机体的激素。影响谷物性状的修饰包括，增加油酸的含量，或改变饱和及不饱和脂肪酸的水平。 同样，能够提高蛋白的水平，特别是可以改善植物营养值的修饰的蛋白的水平。这通过表达 具有氨基酸含量增加的这类蛋白来实现。期望增加赖氨酸和含硫氨基酸的水平以及修饰种子中淀粉的类型和含量。1997年 4月10日提交的WO 9416078、1997年3月26日提交的WO 9638562、1997年3月26日提交 的WO 9638563以及1997年12月30日授权的美国专 利5，703，049号描述了 Hordothionin 的修饰。另一实例是1996年3月20日提交的WO 9735023所述的由大豆2S白蛋白编码的 富含赖氨酸和/或硫的根蛋白，和来自大麦的糜蛋白酶抑制剂，WilliamS0n，et al.，(1987) Eur.J. Biochem. 165 :99_106。能够通过改变下述基因的表达改善农学性状在环境应激期间影响根、植物或种 子生长和发育应答的基因，Cheikh-N，et al.，(1994) PlantPhysiol. 106(1) :45_51 ；和玉米 中控制碳水化合物代谢以减少谷粒败育(abortion)的基因，Zinselmeier，et al. , (1995) Plant Physiol. 107(2) :385_391。应当认识到，能够将包括天然编码序列在内的任何感兴趣的基因可操作地连接至 本发明的调节元件，并在植物中表达。作为示例，而不是意图限制，下文是能够与本发明的调节序列联合使用的基因类 型的实例。1.赋予昆虫抗性或抗病性的转基因，并且其编码(A)植物抗病性基因。植物防御通常由植物中抗病性基因(R)的产物与病原 体中相应无毒性(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。能够用克隆的抗性基 因转化植物品种来改造抵抗特定病原株的植物。参见，例如，Jones，et al. , (1994) Science 266 :789 (cloning of the tomato Cf-9 genefor resistance to Cladosporium fulvum(用于抵抗黄枝孢菌的番茄Cf-9基因的克隆))；Martin, et al.，(1993) Science 262 1432 (tomato Pto gene forresistance to Pseudomonas syringae pv.tomato encodes a protein kinase (抵抗番茄细菌性斑点病菌的番茄Pto基因编码蛋白激酶))； Mindrinos, et al. , (1994)Cell 78 1089 (Arabidopsis RSP2 gene for resistance to Pseudomonassyringae (抵抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的拟南芥 RSP2 基 因))；McDowell and ffoffenden,(2003)Trends Biotechnol. 21(4) 178-83 andToyoda,et al.，(2002) Transgenic Res. 11(6) :567_82。抵抗疾病的植物与野生型植物相比，更加抵抗 病原体。(B)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或模拟其合成 的多肽。参见，例如，Geiser，et al.，(1986)Gene 48 :109，其公开了 Bt δ内毒素基因 的克隆和核苷酸序列。而且，编码δ内毒素基因的DNA分子可以购自美国菌种保藏中 心(Rockville，MD)购买，例如，ATCC 登录号为 40098、67136、31995 和 31998。其他基因工程苏云金芽孢杆菌转基因的实例参见下列专利或专利申请，且为了本发明的目的，将其 在此通过引用并入美国专利 5，188, 960,5, 689, 052,5, 880, 275, PCT 申请 WO 91/14778、 WO 99/31248、WO 01/12731、WO 99/24581、W097/40162 及美国专利申请系列 10/032,717、 10/414，637 及 10/606，320。(C)昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮激素、保幼激素、其变体、其类似物，或其拮 抗剂或激动剂。参见，例如，Hammock，et al. , (1990) Nature 344 :458公开了杆状病毒表达 的克隆保幼激素酯酶，其是保幼激素灭活剂。(D)表达时破坏了受影响的害虫的生理学的昆虫特异肽。例如，参见公开的 Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269 :9 (表达克隆产出编码昆虫利尿激素受体的DNA) ；Pratt, et al. , (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 1243 (在 Diploptera puntata 中鉴定 了 咽侧体 Φ制激素(allostatin)) ；Chattopadhyay, et al.，(2004)Critical Reviews inMicrobiology 30(1) 33-54 ；Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2) 300-310 ；Carlini and Grossi-de-Sa, (2002)Toxicon 40(11) 1515-1539 ；Ussuf, et al. , (2001)Curr Sci. 80(7) :847-853 以及 Vasconcelos and Oliveira(2004)Toxicon 44(4) :385_403。也 可参见Tomalski等的美国专利5，266，317号，其公开了编码昆虫特异性毒素的基因。(E)负责单萜、倍半萜、类固醇、桂皮酸、苯丙型衍生物或另一个具有杀虫活性的非 蛋白分子的超积累的酶。(F)与生物活性分子的修饰有关的酶，包括翻译后修饰；例如，糖酵解酶、蛋白 水解酶、脂解酶、核酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、 弹性蛋白酶，几丁质酶或葡聚糖酶，无论是天然的或合成的。参见，Scott等的PCT申请 W093/02197，公开了过氧化氢酶基因的核苷酸序列。可以获得含有编码几丁质酶序列的DNA 分子,例如，从ATCC登录号39637和67152获得。也可参见，Kramer，et al.，(1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23 :691，其讲解了编码钩虫烟草几丁质酶的cDNA的核苷酸序列；以 ^Kawalleck, et al.，(1993) Plant Molec. Biol. 21 673 ；Kawalleek et al.，(1993) Plant Molec. Biol. 21 :673，其提供了香菜ubi4_2多聚遍在蛋白基因的核苷酸序；美国专利申请 系列 10/389，432、10/692，367 及美国专利 6，563，020 号。(G)刺激信号转导的分子。例如，参见 Botella，et al.，(1994)PlantMolec. Biol. 24:757公开的绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列；及Griess，et al. , (1994) Plant Physiol. 104 :1467，其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。(H)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide) 参见，PCT 申请 W095/16776 及美 国专利5，580，852 (公开了抑制植物真菌病原体的鲎素肽衍生物)及PCT申请WO 95/18855 和美国专利5，607，914 (讲述了赋予抗病性的合成抗微生物肽)。(I)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂。例如，参见Jaynes，et al. , (1993) Plant Sci. 89:43，其公开了抗菌肽-β溶肽类似物的异源表达，产生抗青枯假单胞菌 (Pseudomonas solanacearum)白勺胃—因 ^ ·。(J)病毒侵袭蛋白或由其衍生的复合毒素。例如，通过，在转化的植物细胞中积累 病毒外壳蛋白赋予对衍生外壳蛋白基因的病毒以及相关病毒的所招致的抗病毒感染和/ 或疾病发生。参见，Beachy，et al. , (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28 4510 赋予转化植物 对抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒，烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒外壳蛋白介导的抗性，同上。(K)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠中的关键代谢功能 的抗体将失活受影响的酶，从而杀死昆虫。Cf.，Taylor，etal.，#497摘要，Seventh Int' 1 Symposium on Molecular Plant-microbelnteractions (第七届国际分子植物微生物相互 作用研讨会，Edinburgh, Scotland, 1994)(转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶促失 活)。(L)病毒特异性抗体。例如，参见 Tavladoraki，et al. (1993)，Nature366 :469， 其表明，表达重组抗体基因的转基因植物免于病毒的攻击。(M)由病原体或寄生虫自发产生的发育抑制蛋白(developmental-arrestive protein) 0因此，真菌内切α-1，4D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁高-α _1， 4D-半乳糖醛酸酶促进真菌建群和植物营养释放。参见，Lamb，et al. , (1992)Bio/ Technology 10:1436。编码抑制豆多聚半乳糖醛酸内切酶蛋白的基因的克隆和表征，由 Toubart, et al.，(1992)Plant J. 2 367 做了描述。
(N)由植物自发产生的发育抑制蛋白。例如，Logemann，et al.，(1992)Bio/ Technology 10:305已证明，表达失活大麦核糖体基因的转基因植物增加了抗真菌病的抗性。(0)与系统获得性抗性(SAR)应答相关的基因和/或发病相关的基因。Briggs， (1995)Current Biology,5 (2) 128-131 ；Pieterse and Van Loon(2004)Curr. Opin. Plant Bio. 7(4) :456-64，以及 Somssich，(2003) Cellll3 (7) :815_6。(P)抗真菌基因(Cornelissen and Melchers, (1993)PI. Physiol. 101 :709_712 ； Parijs, et al.，(1991)Planta 183 :258_264 ；以及 Bushnell，et al.，(1998)Can. J. of Plant Path. 20 (2) : 137-149。也可参见美国专利申请 09/950，933。(Q)脱毒基因，如伏马毒素、白僵菌素、串珠镰刀菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相 关衍生物的脱毒基因。例如，参见美国专利5，792，931号。(R)半胱氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。参见，美国专利申请 10/947，979。(S)防卫素基因。参见，PCT申请WO 03/000863及美国专利申请系列10/178,213号。(T)赋予线虫抗性的基因。参见，PCT 申请 WO 03/033651 及 Urwin，et al.，(1998) Planta 204:472-479 ；WiIliamson(1999)Curr Opin PlantBio. 2(4) :327_31。(U)赋予疫霉根腐病(Phytophthora Root Rot)抗性的基因，如 Rpsl、Rps l_a、 Rps l_b、Rps l_c、Rps l_d、Rps l_e、Rps l_k、Rps 2、Rps 3_a、Rps 3_b、Rps 3_c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7 及其他 Rps 基因。参见,例如，Shoemaker, et al. , Phytophthora Root Rot ResistanceGene Mapping in Soybean (^^ΜΦ^^^^ ^βΙ^^Ι^Η ), PlantGenome IV Conference (植物基因组第四次大会)，San Diego，CA (1995)。(V)赋予大豆茎褐腐病(Brown Stem Rot)抗性的基因，如美国专利5，689，035号 所述。2.赋予除草剂抗性的转基因，例如(A)抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮或磺酰尿。这一种类的示例性基因分别编码例如，如 Lee，et al.，(1988)EMBO J. 7:1241 ；and Miki, et al.，(1990) Theor. Appl. Genet. 80 449所述的突变体ALS和AHAS酶。还参见，美国专利5,605,011、 5，013，659、5，141，870、5，767，361、5，731，180、5，304，732,4, 761，373、5，331，107、 5，928，937 和 5，378，824 号以及 PCT 申请 WO 96/33270。(B)草甘膦(分别由突变的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶合酶(EPSP)基 因和aroA基因所赋予的抗性)，和诸如草胺膦(glufosinate)的其他膦酰基化合物(膦 丝菌素乙酰转移酶(PAT)基因和吸水链霉菌(Str印tomyces hygroscopicus)膦丝菌素 乙酰转移酶(bar)基因)，及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环异己酮(cycloshexone) (ACC酶 抑制剂编码基因)。例如，参见Shah，et al.的美国专利4，940，835号，其公开了能够 赋予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列。Barry，et al.的美国专利5，627，061号 也描述了编码EPSPS酶的基因。还参见，美国专利6，566，587,6, 338，961,6, 248，876B1、 6，040，497,5，804，425,5，633，435,5，145，783,4，971，908,5，312，910,5，188，642, 4，940，835,5，866，775,6，225，114,6，130，366,5，310，667,4，535，060,4，769，061, 5，633，448,5, 510，471、Re. 36，449,RE 37，287 E 和 5，491，288 号以及国际公开 EP1173580、 WO 01/66704、EP1173581和EP1173582。还可将草甘膦抗性赋予表达编码草甘膦氧化还原 酶基因的植物，更详细描述于美国专利5，776，760及5，463，175号中。另外，能够通过编 码草甘膦N-乙酰转移酶的基因的过量表达来赋予植物草甘膦抗性。参见，例如美国专利 申请序号10/427，692。编码突变的aroA基因的DNA分子能够以ATCC登录号39256获得， 并且Comai的美国 专利4，769，061号公开了突变基因的核苷酸序列。Kumada，et al.的 欧洲专利申请0 333 033号和Goodman，et al.的美国专利4，975，374号公开了谷氨酰 胺合酶基因的核苷酸序列，其赋予除草剂如L-膦丝菌素抗性。Leemans，et al.的欧洲专 利0 242 246和0 242 236号提供了膦丝菌素乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef, et al. , (1989)Bio/Technology 7 :61描述了编码膦丝菌素乙酰转移酶活性的嵌合bar基 因的转基因植物的产生。还参见，美国专利5，969，213,5, 489，520,5, 550，318,5, 874，265、 5，919，675,5, 561，236,5, 648，477,5, 646，024,6, 177，616 和 5，879，903 号。赋予诸如稀禾 定(Sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的苯氧基丙酸和环己酮抗性的示例性基因是 Marshall，et al.，(1992)Theor. Appl. Genet. 83 435 所述的 Accl-Sl、Accl_S2 和 Accl_S3 基因。(C)抑制光和作用的除草剂，例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基 因)。Przibilla, et al.，(1991)Plant Cell 3 :169 描述了用编码突变的 psbA 基因的质 粒转化衣藻(Chlamydomonas)。Stalker的美国专利4，810，648号公开了腈水解酶基因的 核苷酸序列，并且以ATCC登录号53435、67441和67442可获得含有这些基因的DNA分子。 Hayes, et al.，(1992) Biochem. J. 285 173描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA分子的克 隆和表达。(D)被导入各种植物的乙酰羟酸合酶，已经发现其使得表达这种酶的植物抵抗多 种类型的除草剂(参见，例如Hattori，et al.，(1995)Mol GenGenet 246:419)。赋予除草 剂抗性的其他基因包括编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还 原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota,et al.，(1994) Plant Physiol. 106 17)，编码谷胱甘肽还 原酶和超氧化物岐化酶的基因(Aono，et al.，(1995)Plant Cell Physiol 36:1687)，以及编码各种磷酸转移酶的基因(Datta, et al.，(1992) Plant Mol Biol 20 :619)。(E)叶绿素的产生所必需的原卟啉原氧化酶(原卟啉原氧化酶(protox))，其对于 所有植物的成活是必需的。原卟啉原氧化酶充当各种除草化合物的靶标。这些除草剂还抑 制全部存在的不同种类植物的生长，从而导致其彻底摧毁。开发含有改变的原卟啉原氧化 酶活性的植物，其能抗这些除草剂，描述于美国专利6，288，306,6, 282，837及5，767，373号 及国际申请WO 01/12825中。3.赋予或促进改变的谷粒特征的转基因，例如(A)改变的脂肪酸，例如，通过(1)下调硬脂酰-ACP去饱和酶，增加植物的硬脂酸含量。参见，KnultZOn，et al.， (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :2624 和 PCT 申请号 WO 99/64579 (改变谷物脂质特征 的去饱和酶基因)，(2)通过FAD-2基因修饰增加油酸和/或通过FAD-3基因修饰减少亚麻酸(参见， 美国专利 6，063，947,6, 323，392,6, 372，965 号以及 PCT 申请号 WO 93/11245)，(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如PCT申请号W001/12800，(4)改变 LEC1、AGP、Dekl、Superall、milps、各种 Ipa 基因，例如 IpaU lpa3、 hpt 或 hggt。例如，参见 PCT 申请号 WO 02/42424、WO 98/22604、WO 03/011015、美国 专利6，423，886号、美国专利6，197，561号、美国专利6，825，397号、美国专利申请公 开号 2003/0079247、美国专利申请公开号 2003/0204870、PCT 申请号 WO 02/057439、WO 03/011015 以及 Rivera-Madrid，et. al.，(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92 :5620_5624。(B)改变的磷含量，例如，通过(1)导入肌醇六磷酸酶编码基因。这将增强肌醇六磷酸的分解，从而使转化的植物 增加更多的游离磷酸。例如，参见，Van Hartingsveldt, et al.，(1993)Gene 127 :87公开 了黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列。(2)上调减少肌醇六磷酸含量的基因。例如，在玉米中，能够通过如在Raboy，et al. , (1990)Maydica 35 :383中，克隆然后再导入与一个或多个等位基因相关的DNA来完 成这个目的，该等位基因例如在特征为低水平的肌醇六磷酸的玉米突变体中鉴定的LPA等 位基因；和/或通过改变肌醇激酶活性，如在PCT申请号WO 02/059324、美国专利申请公开 号2003/0009011、PCT申请号WO 03/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、PCT申请 号WO 99/05298、美国专利6，197，561号、美国专利6，291，224号、美国专利6，391，348号、 PCT申请号WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、PCT申请号WO 98/45448、 W099/55882.W0 01/04147 中。(C)改变的碳水化合物，例如通过改变影响淀粉的分支模式的酶的基因，或硫氧还蛋白的基因所致。(参见，美国专利6，531，648号)。参见，Shiroza，et al. , (1988) J. Bacteriol. 170 :810(变形链球菌(Sti^ptococcusmutans)果糖基转移酶基因的核苷 酸序列)；Steinmetz, et al.，(1985)Mol. Gen. Genet. 200 :220 (枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen，et al.，(1992)Bio/Technology 10: 292 (表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) α -淀粉酶的转基因植物的产生)； Elliot, et al.，(1993)Plant Molec. Biol. 21 515 (番茄转化酶基因的核苷酸序列)； S0gaard, et al.，(1993) J. Biol. Chem. 268 :22480(大麦 α -淀粉酶基因的定点诱变)；以及 Fisher，et al.，(1993) Plant Physiol. 102 1045 (玉米胚乳淀粉分支酶 II)，WO 申请号 99/10498 (通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、Fragile 1和2、Ref 1、HCHL, C4H改进消 化性和/或淀粉提取)；美国专利6，232，529号(通过修饰淀粉水平产生高油种子的方法 (AGP))。上文所述的脂肪酸修饰基因还可以通过淀粉和油途径的相互关系来用于影响淀粉 含量和/或组成。(D)改变的抗氧化剂含量或组成，例如生育酚或生育三烯酚的改变。例如，参见美 国专利6，787，683号，美国专利申请号2004/0034886以及PCT申请号WO 00/68393，其涉 及通过改变植物异戊二烯基转移酶(phytlprenyl transferase) (ppt)来控制抗氧化剂水 平，WO申请号03/082899，其通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)来控制抗氧化剂 水平。 (E)改变的必需种子氨基酸。例如，参见，美国专利6，127，600号(增加种子中必 需氨基酸的积累的方法)，美国专利6，080，913号(增加种子中必需氨基酸的积累的二元方 法(binary method))，美国专利5，990，389号(高赖氨酸)、PCT申请号WO 99/40209 (改 变种子中氨基酸组成)、PCT申请号WO 99/29882(改变蛋白的氨基酸含量的方法)，美国 专利5，850，016号(改变种子中氨基酸组成)，PCT申请号WO 98/20133 (增强水平的必 需氨基酸的蛋白质)，美国专利5，885，802号(高甲硫氨酸)，美国专利5，885，801号(高 苏氨酸)，美国专利6，664，445号(植物氨基酸生物合成酶)，美国专利6，459，019号(增 加的赖氨酸和苏氨酸)，美国专利6，441，274号(植物色氨酸合酶β亚基)，美国专利 6，346，403号(甲硫氨酸代谢酶)，第5，939，599号美国专利(高硫)，美国专利5，912，414 号(增加的甲硫氨酸)，PCT申请号WO 98/56935 (植物氨基酸生物合成酶)，PCT申请号WO 98/45458 (具有高百分比的必需氨基酸的改造的种子蛋白)，PCT申请号WO 98/42831 (增加 的赖氨酸)，美国专利5，633，436号(增加硫氨基酸含量)，美国专利5，559，223号(具有 含有可编程水平的必需氨基酸的定义的结构以改进植物的营养价值的合成储存蛋白质)， PCT申请号WO 96/01905 (增加的苏氨酸)，PCT申请号WO 95/15392 (增加的赖氨酸)，美 国专利申请公开号2003/0163838，美国专利申请公开号2003/0150014，美国专利申请公 开号2004/0068767，美国专利6，803，498号，PCT申请号WO 01/79516，和PCT申请号WO 00/09706 (Ces A 纤维素合酶)，美国专利6，194，638号(半纤维素)，美国专利6，399，859 号和美国专利申请公开号2004/0025203 (UDPGdH)，美国专利6，194，638号(RGP)。4.控制雄性不育的基因有几种赋予遗传雄性不育的方法，例如，如Brar等的美国专利4，654，465和 4，727，219号所公开的，在孵育雄性不育的基因组中分离位置的多个突变基因，和如 Patterson在美国专利3，861，709和3，710，511号中所述的染色体易位。除了这些方法以 夕卜，Albertsen等的美国专利5，432，068号描述了核雄性不育系统，其包括鉴定对雄性可 育关键的基因；沉默这个对雄性可育关键的天然基因；从该必需的雄性可育基因去除天然 启动子并用诱导型启动子代替；将这种遗传改造的基因插入回植物；因而产生雄性不育的 植物，因为该诱导型启动子没有“打开”从而获得没有被转录的雄性可育基因。通过导入或 “打开”该启动子恢复可育，这从而允许赋予雄性可育的基因的转录。(A)在绒毡层特异性表达启动子控制下及应用化学的N-Ac_PPT(PCT申请WO 01/29237)下导入脱乙酰基酶基因。
(B)导入各种雄蕊特异性启动子(PCT申请号WO 92/13956, W092/13957) ο(C)导入 barnase 及 barstar 基因(Paul，et al.，(1992)Plant Mol. Biol. 19 611-622)。对于核雄性和雌性不育系统和基因的其他实例，还参见美国专利5，859，341 号、美国专利6，297，426号、美国专利5，478，369号、美国专利5，824，524号、美国专利 5，850，014号以及美国专利6，265，640号。5.为位点特异性DNA整合创建位点的基因这包括导入可用于FLP/FRT系统的FRT位点和/或用于Cre/Loxp系统的Lox位 点° 例如，参见，Lyznik, et al. , (2003) "Site-SpecificRecombination for Genetic Engineering in Plants (用于植物基因工程的位点特异性重组)” Plant Cell Rep 21: 925-932和PCT申请号WO 99/25821，其在此处通过引用被并入。其他可用的系统包括噬 菌体 Mu 的 Gin 重组酶(Maeser，et al.，(1991)Mol Gen Genet. 230(1-2) 170-6) ；Vicki Chandler, TheMaize Handbook (玉米手册)ch. 118 (Springer-Verlag 1994)，大肠杆菌 (E. coli)的 Pin 重组酶(Enomoto, et al.，1983)以及 pSRl 质粒的 R/RS 系统(Araki, et al.，(1992) J Mol Biol. 225(1) :25_37)。6.影响非生物应激抗性的基因(包括但不限于开花的调节，抽穗和种子发育，氮 利用效率的增强，改变的氮应答性，抗旱性或耐旱性，抗寒性或耐寒性以及抗盐性或耐盐 性)和增加应激下产量。例如，参见，PCT申请号WO 00/73475，其中通过改变苹果酸盐/酯改变水利用 效率；美国专利5，892，009号、美国专利5，965，705号美国专利、5，929，305号、美国专 利5，891，859号、美国专禾Ij 6，417，428号、美国专利6，664，446号、美国专利6，706，866 号、美国专利6，717，034号、美国专利6，801，104号、PCT申请号WO 2000/060089、WO 2001/026459、W02001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 98/09521和WO 99/38977所描述的基因，其包括CBF基因和有效地缓解 冷冻、高盐度和干旱对植物的不良影响以及赋予植物表型其他有利影响的转录因子；美国 专利申请公开号2004/0148654和PCT申请号WO 01/36596，其中改变了植物中的脱落酸 从而获得改进的植物表型，如产量增加和/或增强的对非生物应激的耐性；PCT申请号WO 2000/006341、WO 04/090143、美国专利申请号10/817，483和美国专利6，992，237号，其中 改变了细胞分裂素从而获得应激耐性增加的植物，如耐旱性和/或增加产量。还参见，PCT 申请号 WO 02/02776,WO 2003/052063、JP 2002281975，美国专利 6，084，153 号，PCT 申请号 WO 0164898，美国专利6，177，275号，以及美国专利6，107，547号(氮利用的增强和改变的 氮应答性)。对于乙烯改变，参见，美国专利申请公开号20040128719、美国专利申请公开号 20030166197和PCT申请号WO 2000/32761。对于植物转录因子或非生物应激的转录调节 子，参见，例如，美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852。可以将影响植物生长和农学性状，如产量、开花、植物生长和/或植物结构、营 养吸收，特别是植物的氮吸收、氮利用效率；耐旱性和水利用效率；根强度和根倒伏抗性； 土壤害虫控制、玉米根虫抗性的其他基因和转录因子导入或基因渗入植物中，参见，例如PCT 申请号 W097/49811(LHY)、WO 98/56918 (ESD4)、WO 97/10339 和美国专利 6，573，430 号(TFL)，美国专利 6，713，663 号(FT)，PCT 申请号 WO 96/14414 (CON)、WO 96/38560、 WO 01/21822(VRNl)、WO 00/44918(VRN2)、WO 99/49064 (GI)、WO 00/46358(FRI)、WO 97/29123，美国专利申请号 6，794，560,6, 307，126 (GAI)，PCT 申请号 WO 99/09174 (D8 和 Rht)和 W02004/076638 和 WO 2004/031349 (转录因子)。能够通过表达改变用于产生纸、织物、乙醇、聚合物或具有商业用途的其他材料的 淀粉或蛋白质的基因来创造植物的商业性状。增加或抑制蛋白的方法对本领域技术人员是已知的，作为示例，该方法包括转基 因表达、反义抑制、共抑制方法，其包括但不限于RNA干扰、利用转录因子和/或阻遏物的 基因激活或抑制，诱变，其包括转座子标签、定点和位点特异性诱变、染色体工程(参见， Nobrega，et. al.，(2004)Nature 431 :988_993)、同源重组、TILLING(定向诱导基因组局部 病变(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)) ；McCallum, et al. , (2000) Nature Biotechnol. 18 455-457)以及操纵蛋白表达的生物合成竞争。用于基因沉默的许多技术对本领域技术人员是已知的，其包括但不限 于敲除，例如通过插入转座元件，如Mu, Vicki Chandler, The MaizeHandbook ch. 118(Springer-Verlag 1994)，或其他遗传元件，如FRT、Lox或其他位点特异性整合 位点；RNA 干扰(Napoli, et al.，(1990)Plant Cell2 :279_289 ；美国专利 5，034，323 号，Sharp (1999)Genes Dev. 13 :139_ 141，Zamore, et al.，(2000)Cell 101 25~33 禾口 Montgomery, et al.，(1998)PNASUSA 95 15502-15507)；病毒诱导的基因沉默(Burton， et al.，(2000)PlantCell 12 :691_705，和美国专利 6，635，805 号(1999)Curr. Op. Plant Bio. 2 109-113)；靶 RNA 特异性核酶(Haseloff，et al.，(1988)Nature334 585-591)； 发夹结构(Smith, et al.，(2000) Nature 407 :319_320 ；PCT 申请号 WO 99/53050 和 WO 98/53083)；微 RNA(Aukerman and Sakai (2003)Plant Cell 15:2730-2741)；核酶 (Steinecke, et al. ， (1992)EMBO J. 11 1525, and Perriman, et al. ， (1993)Antisense Res. Dev. 3 253)；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如，PCT申请号WO 03/076574和WO 99/25853)；锌指靴向的分子(例如，PCT申请号WO 01/52620、WO 03/048345和WO 00/42219)；以及对本领域技术人员已知的其他方法或上述方法的组合。增加或抑制感兴趣的基因的表达的任何方法，都可以用于本发明中。下文更详细 地列出了一些作为示例目的的实例。可操作地连接至本文所公开的调节元件的核苷酸序列可以是靶基因的反义序列 (参见，例如，Sheehy，et al.，(1988)PNAS USA 85 :8805_8809 ；和美国专利 5，107，065、 5，453，566和5，759，829号)。“反义序列”旨在表示序列，其方向与该核苷酸序列的5，至 3’的正常方向相反。当被递送至植物细胞时，反义DNA序列的表达防止靶基因的DNA核苷 酸序列的正常表达。反义核苷酸序列编码RNA转录物，该RNA转录物与靶基因的DNA核苷 酸序列的转录所产生的内源信使RNA(mRNA)互补并且能够与其杂交。在这种情况下，抑制 了靶基因所编码的天然蛋白的产生，获得期望的表型应答。因此，本文所公开的调节序列可 以可操作地连接至反义DNA序列，来减少或抑制植物中天然蛋白的表达。如所指出的，影响植物中蛋白的表达的其他潜在方法包括，常规的共抑制，S卩，通 过由转化导入的相同结构的基因或基因片段的表达来抑制内源基因的表达(Goring，etal.，(1991)Proc. Natl. Acad Sci. USA88 :1770-1774 共抑制；Taylor (1997)Plant Cell 9 1245 Jorgensen(1990)Trends Biotech. 8(12) 340-344 ；Flavell(1994)PNAS USA 91: 3490-3496 ；Finnegan, et al.，(1994)Bio/Technology 12 :883_888 ；以及 Neuhuber, et al.，(1994)Mol. Gen. Genet. 244 230-241)。在一实例中，共抑制能够通过将启动子与DNA 片段连接来实现，从而该片段的转录物以正义方向产生并且当该转录物与感兴趣的内源基 因的转录物具有至少65%的序列同一性时，借此抑制了所述植物细胞中内源基因的表达。 (参见，美国专利5，283，184号)。靶向共抑制的内源基因可以是编码在感兴趣的植物物种 中积累的任何蛋白的基因。例如，当靶向共抑制的内源基因是50kD Y-玉米蛋白基因时， 利用包含50kD Y-玉米蛋白基因序列或其变体或片段的表达盒实现共抑制。共抑制的其他方法在本领域是已知的，并且能够类似地应用于本发明。这些方 法包括通过剪接的发夹RNA和称为RNA干扰的类似方法以及启动子沉默来沉默靶基因 (Smith, et al. , (2000)Nature 407 319-320, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4 29-38 ；ffaterhouse, et al. , (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964 ；Chuang and Meyerowitz (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 4985-4990 ； Stoutjesdijk, et al.，(2002)Plant Physiol. 129 1723-1731 ；和 PCT 申请号 WO 99/53050、WO 99/49029、WO 99/61631、WO 00/49035 和美国专利 6，506，559 号)。对于miRNA干扰，将表达盒设计为表达模拟内源基因的RNA分子。miRNA分子编码 形成含有22-核苷酸序列的发夹结构的RNA，该22-核苷酸序列与内源基因(靶序列)互 补。miRNA分子高度效抑制内源基因的表达，并且该miRNA分子诱导的RNA干扰被植物随后 的世代继承。在一实施方案中，待导入植物的多核苷酸包含抑制序列，其编码结合基因的锌 指蛋白，从而导致该基因表达的减少。在具体的实施方案中，锌指蛋白结合本发明的调 节区。在另外的实施方案中，锌指蛋白结合编码蛋白的信使RNA并防止其翻译。选择锌 指蛋白靶向位点的方法描述于例如美国专利6，453，242号中，并且例如美国专利公开号 2003/0037355，描述了利用锌指蛋白抑制植物中基因表达的方法。表达盒还可以在分离的感兴趣的核苷酸序列的3’末端包括在植物中有功能的转 录和翻译终止区域。终止区域可以是与本发明的启动子核苷酸序列天然存在的，可以是与 感兴趣的DNA序列天然存在的或者可以源自其他来源。任何常规终止区域都可以与本发明的启动子联合使用，并且可以获得自根癌 农杆菌(A. tumefaciens)的Ti-质粒，例如，章鱼碱合酶和胭脂氨酸合酶终止区域。还 参见，Guerineau，et al.，(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot (1991) Cell 64 671-674 ；Sanfacon, et al.，(1991)Genes Dev. 5 :141_149 ；Mogen, et al.，(1990) Plant Cell 2 1261-1272 ；Munroe, et al.，(1990)Gene 91 151-158 ；Ballas, et al.， (1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891_7903 Joshi, et al.，(1987)Nucleic Acid Res. 15 9627-9639。表达盒还可以含有5’前导序列。这类前导序列可以起增强翻译的作用。翻译前 导区在本领域是已知的，并且包括微小RNA病毒前导区，如EMCV前导区(脑心肌炎5’非编 码区)，Elroy-Stein，et al.，(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :6126_6130 ；马铃薯 Y 病 毒组前导区，如TEV前导区(烟草蚀纹病毒)，Allison，et al.，(1986) "The NucleotideSequence of the CodingRegion of Tobacco Etch Virus Genomic RNA :Evidence for the Synthesis ofa Single Polyprotein(烟草蚀纹病毒基因组RNA编码区的核苷酸序 列合成单个多蛋白的证据)”，Virology 154 9-20 ；MDMV前导区(玉米矮缩花叶病毒)； 人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak, et al.，(1991)Nature353 :90_94 ；来自苜蓿 花叶病毒外壳蛋白mRNA的未翻译的前导区(AMVRNA 4)，Jobling, et al.，(1987)Nature 325:622-625)；烟草花叶病毒前导区(TMV), Gallie, et al.，(1989)Molecular Biology of RNA, pages 237-256 ；以及玉米褪绿斑驳病毒前导区(MCMV)，Lommel, et al.，(1991) Virology81 :382_385。
# H， Della—Cioppa， et al. , (1987)Plant Physiology 84 965-968。表达盒还可以含有增强翻译和/mRNA稳定性的序列，如内含子。在当期望具有针对特定的细胞器，特别是质体、造粉体或内质网的分离的核苷酸序列的表达产物，或在细胞表面或细胞外的分泌产物时，表达盒还可以含有转运肽的编码 序列。这类转运肽在本领域是已知的，并且包括但不限于酰基载体蛋白、RUBIS⑶小亚基、 植物EPSP合酶等。在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，从而提供合适方向的，以及视情况而定，合适读框的DNA序列。所以，可以使用连接物(adapter)或连接体(linker)来连接DNA 片段，或者包括其他操作来提供常规的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为 此目的，可以包括体外诱变、引物修复、限制性消化、复性和再取代，如转换和颠换。如本文所指出，本发明提供能够在本发明的调节元件的控制下表达感兴趣的基 因的载体。通常，载体在植物细胞内应当是有功能的。有时，优选具有在大肠杆菌中有功 能(例如，产生增强抗体、DNA序列分析、插入的构建、获得核酸的量的蛋白)的载体。在 Sambrook, et al.(见上文)中讨论了用于在大肠杆菌中克隆和表达的载体和程序。转化载体还可以含有要待共转化于有机体中的基因的至少一个另外的核苷酸序 列，所述转化载体包含可操作地连接至表达盒中分离的核苷酸序列的本发明的调节序列。 或者，所述另外的序列可以在另外的转化载体上提供。在植物中有功能的载体可以是源自农杆菌(Agrobacterium)的二元质粒(binary plasmid)。这类载体能够转化植物细胞。这类载体含有整合入宿主(植物)染色体所需的 左和右边界序列。至少，这些边界序列之间是要在本发明的调节元件的控制下表达的基因。 在一实施方案中，还包括了可选的标志物和报道基因。为了容易地获得足够量的载体，可以 使用允许在大肠杆菌中复制的细菌来源。转化载体可以包括报道基因。合适的报道基因的实例在本领域中是已知的，并 且可以在下述文献中找到，例如，Jefferson, et al.，(1991) in PlantMolecular Biology Manual, ed. Gelvin, et al. , (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33 ；Deffet, et al., (1987)Mol.Cell. Biol. 7:725_737 ；Goff, et al.，(1990)EMBO J. 9 :2517_2522 ；Kain, et al.，(1995) BioTechniques 19 :650_655 ；以及 Chiu，et al.，(1996) Current Biology 6 325-330。转化载体可以包含用于选择转化的细胞或组织的可选的标志基因。这些可选的标 志基因包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的可选的标志基因的实例包括但不 限于编码氯霉素抗性的基因，HerreraEstrella，et al.，(1983)EMBO J. 2 :987_992 ；编码 甲氨蝶呤抗性的基因，Herrera Estrella, et al.，(1983)Nature 303 209-213 ；Meijer,et al.，(1991)Plant Mol. Biol. 16 807-820 ；编码潮霉素抗性的基因，ffaldron, et al.， (1985)Plant Mol. Biol. 5 103-108,Zhijian,et al.，(1995)Plant Sciencel08 :219_227 ； 编码链霉素抗性的基因，Jones, et al.，(1987)Mol. Gen. Genet. 210 :86_91 ；编码大观霉素 的基因，Bretagne-Sagnard，et al.，(1996)Transgenic Res. 5 :131_137 ；编码博来霉素 抗性的基因，Hille，et al.，(1990)Plant Mol. Biol. 7 :171_176 ；编码磺胺抗性的基因， Guerineau, et al.，(1990) Plant Mol. Biol. 15 :127_136 ；编码溴苯腈(bromoxynil)抗性 的基因，Stalker, et al.，(1988) Science 242 :419_423 ；编码草甘膦抗性的基因，Shaw, et al.，(1986) Science 233 :478_481 ；编码膦丝菌素抗性的基因，DeBlock，et al.，(1987) EMBO J. 6 :2513-2518。而且，当将本发明的启动子与编码可检测的蛋白的核苷酸序列连接时，可以追踪 连接的序列的应激诱导的表达，借此提供有用的所谓可筛查或可评分标志物。可以检测 连接的蛋白的表达，而不需要破坏组织。最近，对于可筛查或可评分标志物的兴趣增加 了。作为示例而不是限制，可将启动子连接至可检测的标志物，该标志物包括，葡糖 醛酸糖苷酶或UidA基因(⑶S)，其多种生色素物质因其编码的酶而知名(Jefferson，et al.，(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8447-8451)；氯霉素乙酰基转移酶；碱性磷酸 酶；R-基因座基因，其编码调节植物组织中花青苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta， et al. , (1988) in Chromosome Structure andFunction(染伊‘体结构与功倉κ )，Kluwer Academic Publishers, Appels andGustafson eds. , pp.263-282 ；Ludwig, et al. , (1990) Science 247 449) ；ρ-内酰胺酶(Sutcliffe, (1978)Proc. Nat' 1. Acad. Sci. U. S. Α. 75 3737)，其多种产色素底物因其编码的酶而知名(例如，PADAC，产色素头孢菌素)；xylE基因 (Zukowsky, et al.，(1983) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. U. S. A. 80 :1101)，其编码能够转化生 色的儿茶酚的 儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta, et al. , (1990) Biotech. 8 241)； 酪氨酸酶基因(Katz, et al.，(1983) J. Gen. Microbiol. 129 :2703)，其编码能够将酪氨酸 氧化成DOPA和多巴醌(dopaquinone)的酶，该多巴醌随后缩合形成容易检测的化合物黑 色素；绿色荧光蛋白(GFP)基因(Sheen, et al.，(1995)Plant J. 8 (5) :777_84)；发光酶 基因(lux gene)，其编码荧光素酶，该荧光素酶的存在可以利用，例如X射线膜、闪烁计数 (scintillation counting)、荧光分光光度法、低光摄影机(low-light videocamera)、光 子计数摄像机(photon counting camera)或多孔发光测定法(multiwell luminometry) 来检测(Teeri, et al.，(1989)EMBO J. 8 343) ；DS-RED EXPRESS (Matz, et al.，(1999) Nature Biotech. 17 969-973,Bevis,et al. ， (2002)Nature Biotech 20 83-87, Haas,et al.，(1996)Curr. Biol. 6 315-324)；纽扣珊瑚(Zoanthus sp)黄色荧光蛋白(ZsYellow), 其已经被改造为更亮的荧光(Matz，et al.，(1999)Nature Biotech. 17 :969_973，可购自 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA, catalog no. K6100-1)；以及青色荧光蛋白 (CYP) (Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117 :943_54 andKato，et al.，(2002)Plant Physiol 129:913-42)。包含本发明的具体调节序列的转化载体，可用于转化任何植物，该调节序列操作 地连接至表达盒中分离的感兴趣的核苷酸序列。以这种方式，可以获得基因修饰的植物、 植物细胞、植物组织等。转化方法根据植物或植物细胞类型而不同，即，转化所靶向的单子 叶植物或双子叶植物。转化植物细胞的合适方法包括显微注射，CroSSWay，et al. , (1986)Biotechniques 4 :320_334 ；电穿孔，Riggs，et al. , (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 5602-5606 ；农杆菌介导的转化，参见，例如Townsend等的美国专利5，563，055号；直接基 因转化，Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J. 3 :2717_2722 ；以及弹道粒子加速(ballistic particle acceleration)，参见，例如 Sanford 等的美国专利 4，945，050 号，Tomes，et al.， (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture fundamental Methods (才直·_■、 组织和器官培养基础方法)，ed. Gamborg and Phi 11 ips (Springer-Verlag, Berlin)； 禾口 McCabe, et al.，(1988)Biotechnology 6 :923_926。还参见，ffeissinger, et al.， (1988)Annual Rev. Genet. 22 :421_477 ；Sanford,et al., (1987)ParticulateScience and Technology 5:27_37(洋葱)；Christou, et al.，(1988)Plant Physiol. 87 :671_674(大 豆)；McCabe, et al.，(1988) Bio/Technology 6 :923_926(大豆)；Datta, et al.，(1990) Bio/Technology 8 :736_740 (水稻)；Klein, et al. , (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (玉米)；Klein, et al.，(1988) Biotechnology 6 :559_563 (玉米)；Klein, et al.，(1988) Plant Physiol. 91 :440_444 (玉米)；Fromm, et al.，(1990) Biotechnology 8 833-839 ；Hooydaas-Van Slogteren, et al.，(1984)Nature(London) 311 :763_764 ； Bytebier, et al.，(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5345_5349(百合)；Deffet 等
(1985)在G.P. Ghapman等编H白勺The Experimental Manipulationof Ovule Tissues ( 组织实验操作)(Longman, New York)，第 197-209 页(花粉)中；Ka 印 pler，et al.，(1990) Plant Cell Reports 9:415-418;禾口 Ka印pier，et al. , (1992) Theor. Appl. Genet. 84 560-566 (晶须(whisker)介导的转化)；D. Halluin, et al.，(1992) Plant Cell 4 1495-1505 (电穿孔)；Li, et al.，(1993)Plant Cell Reports 12 :250_255 和 Christou, et al. , (1995) Annals of Botany75 :407_413 (/K 稻)；Osjoda, et al. , (1996) Nature Biotechnology 14 745-750 ((Agrobacterium tumefaciens)白勺 )。可以根据常规方法使已转化的细胞在植物中生长。参见，例如McCormick，et al.,
(1986)PlantCell Reports 5:81-84。然后，可以使这些植物生长并用相同的转化株或不 同株授粉。然后可以鉴定具有期望的表型特征的应激诱导表达的所得的植物。可以生长两 代或更多代，以确保期望表型特征的应激诱导表达稳定地保持并继承。如美国专利申请公 开2003/00221212所述的功能分析系统可以用于有效地评价转基因品系。作为示例而不是作为限制，提供下文的实施例。
实施例实施例1 黑麦CBF31启动子的分离利用设计为针对拟南芥和玉米CBF蛋白中的保守AP2结构域的正向引物(SEQ ID NO :2和3)及为dT17连接物引物的反向引物(SEQ ID NO :4)，从冬黑麦分离和克隆 ScCBF31的编码区的部分序列。将因此获得的编码区的部分序列用作探针，来确定黑麦 CBF31基因的冷诱导表达(图1)。在鉴定冷诱导时程中基因的严紧调节时，分离了该基 因的5’调节区。对于这个调节区的分离，从黑麦制备了 GenomeWalke/IClontech)文 库。通过GenomeWalker (Clontech)文库，利用位于部分编码序列中的基因特异性引物和 GenomeWalker 试剂盒所提供的连接物引物(SEQ ID NO :5)来分离该5，调节区。将该分 离的5’调节区克隆并测序。分析分离的启动子区的顺式元件，并与拟南芥、玉米和水稻CBF启动子进行比较(图2和表1)。
表1.拟南芥、水稻和黑麦之间CBF/DREB启动子的比较 实施例2通过粒子轰击转化玉米。
用含有表达盒的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟的玉米胚，该表达盒包含 可操作地连接至感兴趣的基因的ScCBF31启动子。该质粒还包含可选的标志基因，例如 PAT (ffohlleben, et al.，(1988)Gene 70 :25_37)，其赋予除草剂双丙氨磷(bialaphos)抗 性。或者，在分离的质粒上提供可选的标志基因。按照如下步骤进行转化。培养基配方提 供如下。将谷穗剥皮，并在30% Clorox 漂白剂加0. 5% Micro除垢剂中进行表面灭菌20 分钟，然后用无菌水漂洗两次。将该未成熟的胚切下，胚轴朝下(胚盘向上朝上)，每板25 个胚，在560Y培养基中放置5小时，然后排列在2. 5cm靶区内准备轰击。制备质粒载体，其包含可操作地连接至感兴趣的基因的ScCBF31启动子序列。利 用如下的CaCl2沉淀步骤，将这种质粒DNA加含有PAT可选的标志物的质粒DNA沉淀在 1. 1 μ m(平均直径)小钨球上100 μ 1在水中制备的钨颗粒；10 μ 1 Tris EDTA缓冲液中的 DNA(1 μ g) (1μ g 总 DNA) ； 100 μ 1 2. 5Μ CaCl2 ；以及 10 μ 1 0. IM 亚精胺。在复式管旋流器(multitube vortexer)上保持时，将每种试剂顺序地添加至钨颗 粒悬浮液中。将最终混合物短暂地进行超声处理并在恒定涡旋下孵育10分钟。沉淀完毕 后，将离管短暂地离心，去除液体，用500mll00%的乙醇洗涤，并离心30秒。再次去除液体， 并向最终钨颗粒团添加105μ 1 100%乙醇。为了进行粒子枪轰击，将钨/DNA颗粒短暂地进 行超声处理，并将10 μ 1涂至每个大载体(macrocarrier)的中心，在轰击前干燥2分钟。将样品板在粒子枪#HE35_1或#HE35_2中，以#5级进行轰击。全部样品接收了 650PSI的单次射击，并且从每管制备的颗粒/DNA中取出总共10个等份。轰击后，将胚保持在560Y培养基中2天，然后转移至含有3mg/升双丙氨磷的560R 选择培养基中，并每两周继代培养。约10周的选择后，将抗选择的胼胝体克隆转移至288J 培养基中以起始植物再生。体细胞胚成熟(2至5周)后，将充分发育的体细胞培养转移 至用于发芽的培养基并转移至光照培养室。约7-10天后，将发育的苗转移至管中的不含 272V激素的培养基，保持7至10天，直至苗充分形成。然后将植物转移至含有盆栽土的平 板(flat)中的垫块(insert)中(相当于2. 5”的盆)，并使其在温室中生长1周，随后在温 室中生长另外的1-2周，然后转移至标准的600盆(1.6加仑)，并生长至成熟。监测植物， 在各种条件下进行评分，并与对照植物相比较。观察到标志基因的表达，以证实转化。监测 到表型的改变，这反映了感兴趣的基因的表达。轰击培养基(560Y)包含5.0g/l N6 基盐(SIGMA C-1516)、1. Oml/lEriksson 维生 素混合物(Eriksson's Vitamin Mix) (1000X SIGMA-1511)、0· 5mg/l 盐酸硫胺素(thiamine HCl)、120. 0g/l 蔗糖、1. 0mg/l 2，5_D 和 2. 88g/lL_ 脯氨酸(用 KOH将 pH调至 5. 8 后，用 D-I H2O定容)；2.0g/l Gelrite 胶凝剂(用D-I H20定容后添加)；以及8. 5mg/l硝酸银(将培 养基灭菌并冷却至室温后添加)。选择培养基(560R)包含5. 0g/l N6基盐(SIGMAC-1516)、 1. 0ml/l Eriksson 维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0· 5mg/l 盐酸硫胺素、30. 0g/l 蔗糖 和 2.0mg/l 2，5-D (用 KOH 将 pH 调至 5. 8 后，用 D-I H2O 定容)；3. 0g/l Gelrite 胶凝剂 (用D-I H20定容)后添加)；以及0. 85mg/l硝酸银和3. 0mg/l双丙氨磷(均在将培养基 灭菌并冷却至室温后添加)。植物再生培养基(288J)含有5. 3g/l MS 盐(GIBC0 11117-075)、5. 0ml/lMS 维生 素储备溶液(0. IOOg烟酸、0. 02g/l盐酸硫胺素、0. 10g/l盐酸吡哆醇(pyridoxine HCL)和 0. 50g/l 甘氨酸，用精制的(polished)D-I H2O 定容)(Murashige and Skoog(1962) Physiol. Plant. 15 573)、100mg/l 肌醇、0. 5mg/l 玉米素、60g/l 蔗糖和 1. Oml/1 的 0. ImM脱 落酸(将PH调至5. 6后用精制的D-I H2O定容)；3.0g/l Gelrite 胶凝剂(用D-I H2O 定容后添加)；以及1. Omg/1吲哚乙酸和3. Omg/1双丙氨磷(将培养基灭菌并冷却至60°C 后添加)。不含激素的培养基(272V)包含5. 3g/L MS盐(GIBC011117-075)、5. Oml/1 MS维 生素储备溶液(0. 100g/l烟酸、0. 02g/l盐酸硫胺素、0. 10g/l盐酸吡哆醇和0. 50g/l甘氨 酸，用精制的D-I H2O定容)、0· lg/Ι肌醇和50. Og/Ι蔗糖(将pH调至5. 6后用精制的D-I H2O定容)；以及6g/l Bacto -琼脂固化剂(用精炼的D-I H2O定容后添加)，灭菌并冷却 至 60°C。实施例3 通过农杆菌转化和再生玉米胼胝体用可操作地连接至目标基因的ZmCBFl或ZmCBF2启动子序列(SEQ ID NO :1)进行玉米的农杆菌介导转化，采用赵(Zhao)的方法(美国专利5981840号、PCT专利公开 W098/32326，在此将其通过引用并入)。在具有选择性试剂的固体培养基中培养未成熟的 胚，从而获得转化的细胞的选择性生长。然后将胼胝体再生成植物，并且将生长在选择培养 基上的胼胝体在固体培养基上培养以再生植物。当与合适的对照植物进行比较时，监测植物的表型调节。农杆菌转化的细节如下文所列或对本领域技术人员是已知的。农杆菌悬浮液的制备从-80°C冷冻的等份试样中，将农杆菌移取至含有PHI-L培养基的平板上，并 在28 °C下避光培养3天。PHI-L培养基包含25ml/l储备溶液A、25ml/l储备溶液B、 450. 9ml/l储备溶液C和大观霉素(SigmaChemicals)，将其向灭菌的ddH20中添加至浓度 为 50mg/l (储备溶液 A :K2HP04 60. Og/1、NaH2P04 20. Og/1、用 KOH 将 pH 调至 7. 0 并高 压灭菌；储备溶液 B :NH4C1 20. Og/1、MgS04. 7H20 6. Og/1、KCl 3. 0g/l、CaC12 0. 20g/l、 FeS04. 7H20 50. Omg/1,高压灭菌；储备溶液 C 葡萄糖 5. 56g/l、琼脂 16. 67g/l (#A-7049, Sigma Chemicals, St. Louis, M0)并高压灭菌)。将平板保存在4°C，通常使用约一个月。从主板(master plate)挑取单个菌落 并移取至含有PHI-M培养基[酵母提取物(Difco) 5. Og/Ι ；蛋白胨(Difco) 10. Og/Ι ；NaCl 5. Og/Ι ；琼脂(Difco) 15. Og/Ι ；pH 6. 8，含有50mg/L大观霉素]的平板，并在28°C下避光孵 育2天。将5ml PHI 基础培养基体系的 PHI-A[CHU(N6)基盐(Sigma C-1416)4. 0g/l， Eriksson 维生素混合物(1000X, Sigma-1511) 1. 0ml/l ；盐酸硫胺素 0. 5mg/l (Sigma)； 2，4-二 氯苯氧基乙酸(2,4-D, Sigma) 1. 5mg/l ； L-脯氨酸(Sigma)O. 69g/l ；蔗糖 (Mai linckrodt) 68. 5g/l ；葡萄糖(Mallinckrodt) 36. Og/Ι ；pH 5. 2]，或 PHI 组合培养基体 系的 PHI-I [MS 盐(GIBC0 BRL) 4. 3g/l ；烟酸(Sigma)O. 5mg/l ；盐酸吡哆醇(Sigma)O. 5mg/ 1 ；盐酸硫胺素1. Omg/1 ；肌醇(Sigma)O. 10g/l ；维生素测定酪蛋白氨基酸(Difco Lab) lg/ 1 ；2,4-Dl. 5mg/l ；蔗糖68. 50g/l ；葡萄糖36. Og/Ι ；用KOH将pH调至5. 2并过滤灭菌]和 5ml 100mM(3，-5，- 二甲氧基-4，-羟基苯乙酮，Aldrich chemicals)添加至遮光罩中 的14ml Falcon管中。从平板收集约3满环(环大小为5mm)的农杆菌，并悬浮于管中，然 后将该管涡流震荡以制备均勻的悬浮液。将Iml悬浮液转移至分光光度计管中，对于约0.5xl09cfu/ml至lX109cfu/ml的农杆菌的浓度，通过添加更多农杆菌或更多相同的悬浮 液培养基将550nm处的OD调至0. 72。将最终的农杆菌悬浮液等分至2ml微量离心管，每管 含有Iml悬浮液。然后尽可能快地使用悬浮液。胚分离、感染和共培养将约1. 8ml用作农杆菌悬浮液的相同培养基(在此处为PHI-A或PHI-I)添加至 2ml微量离心 管中。从灭菌的穗用灭菌的刮刀(BaxterScientific Products S1565)分离 未成熟的胚，并直接滴入管内的培养基中。将总共约100个胚置于管中。胚的最佳大小为约
1.Omm至1. 2mm。然后合上管的盖子，并将该管用涡流混合器(Baxter Scientific Products S8223-1)以最高速涡流震荡5秒。去除培养基，添加1.8ml新鲜培养基并再次涡流震荡。 倒出全部培养基，向胚添加Iml农杆菌悬浮液，并将管涡流震荡30秒。将管在遮光罩中放 置5分钟。将农杆菌的悬浮液与胚倒入皮氏培养皿(Petri plate)中，该皮氏培养皿含有 PHI 基础培养基体系的 PHI-B 培养基[CHU (N6)基盐(Sigma C_1416)4. Og/1 ；Eriksson 维 生素混合物(1000X, Sigma-1511) 1. Oml/1 ；盐酸硫胺素 0. 5mg/l ；2. 4-D 1. 5mg/l ；L-脯氨 酸 0. 69g/l ；硝酸银 0. 85mg/l ；Gelrite 胶凝剂(Sigma) 3. Og/1 ；蔗糖 30. Og/1 ；乙酰丁香 酮IOOmM ；pH5. 8]，或PHI组合培养基体系的PHI-J培养基[MS盐4. 3g/l ；烟酸0. 50mg/l ； 盐酸吡哆醇 0. 50mg/l ；盐酸硫胺素 1. Omg/1 ；肌醇 100. Omg/1 ；2,4-D 1. 5mg/l ；蔗糖 20. Og/ 1 ；葡萄糖 10. Og/Ι ；L-脯氨酸 0. 70g/l ；MES (Sigma)O. 50g/l ；8. Og/Ι 琼脂(Sigma A-7049， 纯化的)和IOOmM乙酰丁香酮，最终pH为5.8]。利用灭菌的刮刀，将留在管中的任何胚转 移至平板中。倒出农杆菌悬浮液，并将胚以轴侧向下置于培养基上。将板用Parafilm 软 带或塔式植物组合带(Pylon VegetativeCombine Tape)(产品名“Ε. G. CUT”，并且可用的为 18mmx50m部分；Kyowa Ltd.，Japan)，并在23°C至25°C下，避光孵育，以进行约3天的共培 养。休眠、选择和再生步骤对于休眠步骤，将全部胚转移至新的平板中，该平板含有PHI-C培养基[CHU (N6) 基盐(Sigma C-1416)4. Og/1 ；Eriksson 维生素混合物(1000XSigma-1511) 1. 0ml/l ； 盐酸硫胺素 0. 5mg/l ；2. 4-D 1. 5mg/l ；L-脯氨酸 0. 69g/l ；蔗糖 30. Og/Ι ；MES 缓冲液 (Sigma)O. 5g/l ；琼脂(Sigma A-7049,纯化的)8. 0g/l ；硝酸银 0.85mg/l ；羧苄青霉素 100mg/l ；pH 5. 8]。将该平板用Paraf iIm 或塔式植物组合带密封，并在28°C下避光孵育 3至5天。较长的共培养时间段可以补偿休眠步骤的缺乏，因为休眠步骤和共培养步骤一 样，提供了胚在缺乏选择性试剂的情况下的培养时间段。本领域技术人员可以容易地测试 共培养与休眠时间的组合来优化或改善转化。对于选择，然后将全部胚从PHI-C培养基转移至新的平板中，该平板含有作为选 择培养基的PHI-D培养基[CHU (N6)基盐(SIGMA C-1416) 4. 0g/l ；Eriksson维生素混合物 (1000X, Sigma-1511) 1. 0ml/l ；盐酸硫胺素 0. 5mg/l ；2. 4-D 1. 5mg/l ；L-脯氨酸 0. 69g/l ； 蔗糖 30. Og/Ι ；MES 缓冲液 0. 5g/l ；琼脂(Sigma A-7049，纯化的)8. Og/Ι ；硝酸银 0. 85mg/l ； 羧节青霉素(ICN，Costa Mesa, CA) 100mg/l ；双丙氨磷(Meiji Seika K. K.，Tokyo, Japan) 前两周为1. 5mg/l，剩余的时间为3mg/l ；pH 5. 8]，并且每个板放置约20个胚。将板如上文所述地密封，并在28°C下避光孵育选择的前两周。以2周的时间间隔，将胚转移至新鲜的选择培养基。通过转移至新鲜的选择培养基，将组织进行继代培养约2 个月。然后通过在相同的培养基上生长另外的2周使抗除草剂的胼胝体的体积变大(bulk up)，直至胼胝体的直径为约1. 5cm至2cm。对于再生，然后将胼胝体在PHI-E培养基[MS盐4. 3g/l ；肌醇0. lg/Ι ；烟酸 0. 5mg/l，盐酸硫胺素0. lmg/1，盐酸吡哆醇0. 5mg/l，甘氨酸2. Omg/1，玉米素0. 5mg/l，蔗 糖 60. Og/Ι,琼脂(Sigma，A_7049)8. Og/1,吲哚乙酸(IAA，Sigma) 1. Omg/1,脱落酸(ABA， Sigma) 0. ImM，双丙氨磷3mg/l，羧苄青霉素100mg/l将pH调至5. 6]中，在28°C下避光培养1 至3周，以允许体细胞胚成熟。然后将胼胝体在PHI-F培养基上(MS盐4. 3g/l ；肌醇0. Ig/ 1 ；盐酸硫胺素0. lmg/1，盐酸吡哆醇0. 5mg/l，甘氨酸2. Omg/1，烟酸0. 5mg/l ；蔗糖40. Og/ 1 ；Gelrite 胶凝剂 1. 5g/l ；pH 5. 6]中，于 25°C下，以 16 小时光照(270uE m-2sec_l)和 8小时黑暗的日光方案，进行培养，直至产生芽和根。然后将每个小苗转移至含有PHI-F的 25x150mm管，并在相同的条件下再生长约1周。将植物移植至温室中装有土壤混合物的盆 中。在胼胝体阶段或再生阶段确定转化事件。ScCBF31启动子在玉米中驱动表达的能力，通过植物组织中标志基因的检测来证 实。实施例4 黑麦CBF31启动子的冷诱导性在最适温度(23°C/20°C日/夜温度，并且16小时/8小时日/夜方案)下，使 黑麦秧苗生长至3叶阶段。在播种后的第10天，当秧苗处于3至4叶阶段时，使其经受6°C 的冷应激。在暴露至冷应激的0小时、15分钟、1小时、4小时、8小时和24小时，并且还在 最适温度下从冷应激恢复48小时后，收集完整芽组织。将该组织在液氮中碾磨并提取RNA0 将RNA用于RNA印迹来确定黑麦CBF31基因的表达水平，并且用黑麦CBF31的部分序列作 为探针。结果(参见，图1)显示了黑麦CBF31基因快速和强烈的冷诱导，并且表明了黑麦 CBF31启动子的冷诱导性。尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式详细描述了上述发明， 但是，显然可以在所附的权利要求的范围内实施某些变化和修饰。将所引的全部参考文献 通过引用并入本文。
权利要求
分离的核酸分子，其包含多核苷酸，所述多核苷酸在植物细胞中起始转录并包含选自以下的序列a)SEQ ID NO1；b)SEQ ID NO1的至少500个连续核苷酸。
2.表达盒，其包含可操作地连接至感兴趣的多核苷酸的权利要求1所述的多核苷酸。
3.载体，其包含权利要求2所述的表达盒。
4.植物细胞，其具有稳定地并入其基因组的权利要求2所述的表达盒。
5.如权利要求4所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
6.如权利要求5所述的植物细胞，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、小麦、燕麦、黑 麦、高粱或水稻。
7.植物，具有稳定地并入其基因组的权利要求2所述的表达盒。
8.如权利要求7所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。
9.如权利要求8所述的植物，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦、高 粱或水稻。
10.权利要求7所述的植物的转基因种子。
11.如权利要求7所述的植物，其中所述感兴趣的多核苷酸编码赋予干旱、寒冷和/或 盐条件耐性的基因产物。
12.如权利要求7所述的植物，其中所述感兴趣的多核苷酸编码与营养吸收、氮利用效 率、根强度、根倒伏抗性、土壤害虫控制、玉米根虫抗性、碳水化合物代谢、蛋白质代谢、脂肪 酸代谢或植物激素合成相关的多肽。
13.在植物中表达第一多核苷酸的方法，所述方法包括将包含启动子和与所述启动子 可操作地连接的第一多核苷酸的表达盒导入植物，其中所述启动子包含起始植物中可操作 地连接的多核苷酸的转录的第二多核苷酸，并且其中所述第二多核苷酸包含选自以下的序 列a)SEQ ID NO 1或其互补物；和b)SEQID NO 1的至少500个连续核苷酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述植物是玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦、高粱或 水稻。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码赋予耐旱性、耐寒性和/或 耐盐性的基因产物。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码与营养吸收、氮利用效率、 根强度、根倒伏抗性、土壤害虫控制、玉米根虫抗性、碳水化合物代谢、蛋白质代谢、脂肪酸 代谢或植物激素生物合成相关的基因产物。
17.在植物细胞中表达第一多核苷酸的方法，所述方法包括将包含启动子和与所述启 动子可操作地连接的第一多核苷酸的表达盒导入植物细胞，其中所述启动子包含起始植物细胞中可操作地连接的多核苷酸的转录的第二多核苷酸，并且其中所述第二多核苷酸选 自a)包含SEQID NO 1中所列序列或其互补物的多核苷酸；和b)包含SEQID NO 1中所列序列的至少500个连续核苷酸的多核苷酸。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述植物细胞来自玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦、 高粱或水稻。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码赋予干耐旱性、耐寒性和/ 或耐盐性的基因产物。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码与营养吸收、氮利用效率、 根强度、根倒伏抗性、土壤害虫控制、玉米根虫抗性、碳水化合物代谢、蛋白质代谢、脂肪酸 代谢或植物激素生物合成相关的基因产物。
全文摘要
本发明提供了调节植物中异源核苷酸序列表达的组合物和方法。组合物是与黑麦CBF31编码区内源地相关的应激诱导的启动子的新核苷酸序列。本发明提供了利用本文所公开的调节序列在植物或植物细胞中表达异源核苷酸序列的方法。所述方法包括转化植物细胞，使其含有可操作地连接至本发明的调节序列的异源核苷酸序列，并且任选地由转化的植物细胞再生稳定转化的植物。
文档编号C07K14/415GK101849011SQ200880112814
公开日2010年9月29日 申请日期2008年10月23日 优先权日2007年10月23日
发明者索巴·希瓦萨恩卡尔 申请人:先锋国际良种公司