专利名称：基于黑麦est序列的黑麦1r～7r染色体特异的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和遗传育种领域，具体涉及基于黑麦表达序列标签 (expressed sequence tag, EST)序列设计的分子标记，以及这些分子标记在跟踪检测黑麦染色体方面的应用。
背景技术：
小麦的近缘种黑麦cereale L.)具有许多优良的性状，如根系发达、分蘖强、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐盐碱和酸性土壤，尤其是抗多种病害，如小麦白粉病 graminis f. sp. tri tici ) > ^r M iPuccinia graminis f. sp. triiici )、口十绣病(/"· triticina Eriks.)、禾干绣病(/"· graminis Pers. f. sp. triiici )、月星黑種病(Tilletia Controversa Kuhn, TCK)和大麦黄矮病(Barley yellow dwarf virus, BYDV)等。因此，黑麦是对小麦进行遗传改良，拓宽小麦遗传基础，增加小麦栽培品种遗传变异的重要基因源。黑麦优异基因向小麦中转移的途径主要是创制一系列小麦/黑麦双二倍体、附加系、代换系和易位系。通过远缘杂交和染色体工程等手段将黑麦染色体导入到小麦背景中，之后，还需要对其进行准确的鉴定，才能有效地加以利用。与细胞学技术和生化标记法相比，分子标记法简单、快速和准确的特点使其广泛地用于检测、跟踪导入小麦背景中的黑麦染色体。然而，目前开发的黑麦染色体的特异标记，多集中在黑麦的IRS染色体上，如 SSRfeid Bmac0213 Φ^Χ^ Schneider A and Molnar-Lang Μ. 2008. Polymorphism analysis using IRS-specific molecular markers in rye cultivars {Secale cereale L.) of various origin. Cereal Res Commun, 36: 11_19);SSAP 标记 S10, S20, S17 (参考文献:Nagy ED and Lelley Τ. 2003. Genetic and physical mapping of sequence specific amplified polymorphic (SSAP) markers on the IRS chromosome arm in a wheat background. Theor Appl Genet, 107: 1271_1277);EST_STS 标记 STSwe3 和 STSwel26 (参考文献Wang CM, Li LH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF, andAn DG. 2009. Development and application of EST-STS markers specific to chromosome IRS ofSecale cereale. Cereal Research Communications 37: 13—21)等。Zhuang 等(2008) 艮道了 1R，4R，5R 和 7R 染色体特异的 EST-SSR 标记(参考文献Zhuang LF, Song LX, Feng YG, Qian BL, Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ. 2008. Development and chromosome mapping of new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added in wheat. Acta Agron Sin, 34: 926-933)。Lee 等(2009)还报道了 6 个 2RL 染色体特异的 EST标记(参考文献Lee TG, Hong MJ, Johnson JW, Bland DE, Kim DY, Seo Yff. 2009. Development and functional assessment of EST-derived 2RL-specific markers for 2BS. 2RL translocations. Theor Appl Genet, 119: 663-673)。然而，到目前为止，还没有人报道来源于黑麦表达序列标签(EST)序列的一套完整的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，以用来检测鉴定小麦背景中的IR 7R全部黑麦染色体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一套基于黑麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，基于黑麦染色体上的EST序列设计开发出了一套黑麦染色体的特异分子标记，借助这些分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的IR 7R全部黑麦染色体，为黑麦染色体上有益基因转移到栽培小麦背景中提供了简便有效的分子鉴定方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是
基于黑麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，这些分子标记为根据黑麦染色体上的EST序列而设计的正向引物和反向引物，这些分子标记为用于鉴定黑麦IR 7R 染色体的特异标记，其碱基序列见表1，
表1.根据黑麦染色体上的EST序列设计的14对标记引物序列
权利要求
1.基于黑麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，其特征在于这些分子标记为根据黑麦染色体上的表达序列标签EST序列设计的正向引物和反向引物，这些分子标记为用于鉴定黑麦IR 7R染色体的特异标记，其碱基序列见表1，表1.根据黑麦染色体上的表达序列标签EST序列设计的14对标记引物序列体正向引物序列 (S' -3')反向引物 -3')1-CGG143iR, etB SBQ ID NO1 1見 SBQ ID Μ) 22-CGG622S% 观 ID NO: 3BSEQ ID 43-CGG82R見卿ID ND: 5BSBQ ID NO: 64-CGG9 5-CGG3228 3R见測ID NO1 7 见卿ID NG1 9见卿ID NO^ δ 见 SEQ ID Nth 106-CGG49■见測 ID NOi 11ASEQ ID MOi 127 CGG45R见 SEKJ ID NO: 13見SEQ ID NO: 148-CGG16 9-CGG185R 58見卿 ID NDi 15 Λ 挪 ID NOi 17见SEQ ID NOi 16 Eseq id Noi is10-CGG1958見卿 ID NO1 19见SEQ ID NO 2011-CGG4358見卿 ID NO1 21見 SEQ ID NO 2212CGG23 13-CGG596K 6R% SFjQ ID 23 JL SBQ ID NO 25B SfiQ ID Wt Α 见SEQ ID NOt 2614-CGG267BE 測 ID NO: 27JiSEQ ID NO^ 28其中，1-CGG143标记用于鉴定黑麦IR和6R染色体；2_CGG62、3_CGG8和4-CGG9标记用于鉴定黑麦2R染色体；5-CGG32标记用于鉴定黑麦3R染色体；6-CGG49标记用于鉴定黑麦 4R染色体；7-CGG4、8-CGG16、9-CGG18、10-CGG19和11-CGG43标记用于鉴定黑麦5R染色体； 12-CGG23和13-CGG59标记用于鉴定黑麦6R染色体；14_CGG^标记用于鉴定黑麦7R染色体。
2.应用权力要求1所述的基于黑麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记对小麦背景中黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征步骤包括A、分子标记的选定和制备根据所需鉴定的黑麦染色体选定分子标记，比如，预备检测鉴定的小麦与黑麦远缘杂交后代材料当中是否含有黑麦4R染色体，则选定6-CGG49分子标记，然后根据权利要求1给出的序列合成此标记引物；B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成IOOmmolL—1的母液放入-20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成IOmmol L—1的工作液待用； 其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol Γ1 Tris-HCl 与 lmmol Γ1 EDTA, pH=8. O ；C、黑麦染色体的特异标记C-1、模板DNA的提取取待测物——小麦与黑麦远缘杂交后代材料，对照物0——不包含待测黑麦染色体的样品，对照物1——包含待测黑麦染色体的样品，然后利用常规DNA提取方法分别提取三者的DNA ；C-2、PCR扩增以C-I所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对待测物、对照物0及对照物1进行扩增；C-3、扩增产物的检测非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤C-2所得的扩增产物，用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；C-4、结果比对将待测远缘杂交后代材料的电泳图谱分别与对照物0、对照物1的电泳图谱进行比对，如果待测远缘杂交后代材料和对照物1的电泳图谱均有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中含有待测黑麦染色体；如果待测远缘杂交后代材料的电泳图谱与对照物0的电泳图谱一致，均不含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中不含有待测黑麦染色体。
3.根据权力要求2所述的对黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于步骤A中选定的标记引物由上海联合基因有限公司合成。
4.根据权力要求2所述的对黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于步骤C-2中对所述待测物、对照物0及对照物1的DNA模板进行扩增的具体操作为，在体积为0. 2ml的 Eppendof 管中依次加入 30ng 的模板 DNA，IXPCR buffer, 1. 5mmol Γ1 MgCl2, 200mmol Γ1 dNTP，正、反向引物各0. 2mmol L—SO. 5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10ml，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应。
5.根据权力要求4所述的对黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于所述扩增反应的具体程序为，先94°C预变性5min ；然后94°C变性lmin，根据标记引物的退火温度退火lmin，72°C延伸lmin，循环38次；最后72°C延伸lOmin，10°C保存；其中各标记引物的退火温度为，1_CGG143，50°C ；2-CGG62，60 °C ；3_CGG8，62°C ；4_CGG9，56°C ；5-CGG32，55 °C ； 6-CGG49，55 "C ；7_CGG4，60 "C ；8_CGG16，57 "C ；9_CGG18，56 "C ；10_CGG19，58 "C ；11-CGG43， 520C ；12-CGG23，62°C ； 13-CGG59，51°C ；14-CGG26，60°C。
6.根据权力要求2所述的对黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于步骤C-3中所述扩增产物的检测方法具体为，在步骤C-2所得的扩增产物中加入上样缓冲液2μ1，混勻之后取3μ1，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳1 池。
全文摘要
本发明公开了14个基于黑麦EST序列的黑麦1R～7R染色体特异的分子标记，这些分子标记为根据黑麦染色体上的表达序列标签(expressedsequencetag,EST)序列而设计的正向引物和反向引物，这些分子标记为用于鉴定黑麦1R～7R染色体的特异标记；应用这些分子标记对黑麦1R～7R染色体进行鉴定的基本步骤包括A、标记引物的选定和制备；B、标记引物的稀释；C、黑麦染色体的特异标记C-1、模板DNA的提取；C-2、PCR扩增；C-3、扩增产物的检测；C-4、结果比对。本发明基于黑麦染色体上的EST序列设计开发出了一套黑麦染色体的特异分子标记，借助这些分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的1R～7R全部黑麦染色体，为黑麦染色体上有益基因转移到栽培小麦背景中提供了简便有效的分子鉴定方法。
文档编号C12Q1/68GK102181548SQ201110092989
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者安调过, 尹冬冬, 李立会, 许红星 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所