应用重组小麦内质网巯基氧化还原酶改善面粉加工品质的方法
【专利摘要】本发明公开一种应用重组小麦内质网巯基氧化还原酶改善面粉加工品质的方法，属于基因工程和谷物科学领域。该方法包括：原核表达并纯化了重组小麦内质网巯基氧化还原酶，将该重组酶与面粉、糖、盐(NaCl)、植物油、酵母粉和水搅拌均匀，形成的面团经分割称重、成形以及醒发后，焙烤得到面包成品。所述的重组小麦内质网巯基氧化还原酶添加水平为0.05％～0.2％(w/w，面粉基)。本发明的重组小麦内质网巯基氧化还原酶能够显著提高面粉的加工品质，改善面包的比容、高径比、弹性和硬度等烘焙品质，其改良效果与化学强筋剂偶氮甲酰胺相当。因此，重组小麦内质网巯基氧化还原酶可取代化学强筋剂偶氮甲酰胺用于面制品加工行业。
【专利说明】
应用重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面粉加工品质的 方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程和谷物科学领域，具体设及一种应用重组小麦内质网琉基氧 化还原酶改善面粉加工品质的方法。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界Ξ大粮食作物之一，我国小麦的总产量居世界之首，占世界总产量的 六分之一，但受品种、气候、±壤等的制约，我国生产的小麦多W中低筋小麦为主，适用于慢 头、蛋糕但不适用于面包的制作。然而，随着人们生活水平的提高，对面包的消费需求逐年 上升，低品质的中低筋小麦制约了我国面包等面制品的发展。此外，小麦生长环境、病虫害 和采后处理导致面粉的加工品质参差不齐。
[0003] 决定面粉加工品质主要是面筋蛋白网络，而分子间二硫键是形成该网络结构的基 础。近年来，面制品加工行业通过添加促进分子间二硫键形成的面粉改良剂来改善面制品 加工品质。在很长一段时间里，廉价、高效的"化学"面粉改良剂如漠酸钟、偶氮甲酯胺等在 面制品加工行业得到广泛应用。然而，"化学"改良剂带来的食品安全隐患逐渐被重视和证 实，如漠酸盐被发现具有致癌和遗传毒性。因此，寻找新型的面粉改良剂成为面制品加工领 域的发展方向，而安全、高效、绿色的生物酶制剂符合运种发展趋势。
[0004] 小麦内源酶之一的内质网琉基氧化还原酶（wheat endoplasmic reticulum oxidoreductin 1，wE;rol)在小麦体内参与新生肤链二硫键的生物合成。w化〇1属于琉基氧 化酶家族成员，而琉基氧化酶被美国食药局(FDA)认定为GRAS(Generally Recognized as Safe,-般认为安全）。目前，国内外利用wErol作为生物面粉改良剂改善面制品加工品质的 研究报道很少，只有日本学者化kano Katsumi在2011年发表的专利(肝，2011-177059)中提 及了大肠杆菌重组小麦蛋白质二硫键异构酶在wErol和FAD(黄素腺嚷岭二核巧酸）的协同 下能够提高面包品质。然而，该专利并未单独探究wErol对面包品质的影响，且复杂的添加 组分W及成本问题严重制约了 wErol的实际应用。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种小麦内质网琉 基氧化还原酶在改善面粉加工品质中的应用。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种应用重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面粉 加工品质的方法。该方法为我国面制品改良开创一条新途径。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[000引本发明提供一种小麦内质网琉基氧化还原酶在改善面粉加工品质中的应用。
[0009] 具体地，小麦内质网琉基氧化还原酶在改善面团W及面包品质中的应用。
[0010] 仅需在面粉中添加小麦内质网琉基氧化还原酶即能达到增强面粉粉质特性，改善 面包烘赔品质的目的。
[0011] -种应用重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面粉加工品质的方法，将重组小麦 内质网琉基氧化还原酶、面粉、糖、盐(化C1)、植物油、酵母粉和水揽拌均匀，形成的面团经 分割称重、成形W及醒发后，赔烤得到面包成品。其中，所述各组分添加量为:面粉95~105 重量份，酵母粉0.8~1.5重量份，盐1~2重量份，水55~65重量份，糖5~8重量份，植物油1 ~2重量份。
[0012] 所述的重组小麦内质网琉基氧化还原酶添加水平为0.05 %~0.2 % (w/w，面粉 基)。
[0013] 所述的应用重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面粉加工品质的方法，包括如下 具体步骤：
[0014] (1)材料:面粉95~105重量份，酵母粉0.8~1.5重量份，盐1~2重量份，水55~65 重量份，糖5~8重量份，植物油1~2重量份，重组小麦内质网琉基氧化还原酶0.05%~ 0.2%(w/w，面粉基）；
[0015] (2)和面:将上述材料混合，W150~18化/min的速度揽拌10~15min，使其形成均 匀的面团；
[0016] (3)成型:将和好的面团分割成40~60重量份/个，磋圆，成形装盘；
[0017] (4)发酵:将装有面团的醒发盘置于醒发箱中醒发，溫度控制在30~35°C，相对湿 度75%~85%，发酵时间60~8〇111111;
[0018] (5)烘赔:将醒发后的面团，烘赔10~15min，烤箱溫度为180~200°C，得到面包成 品。
[0019] 所述的重组小麦内质网琉基氧化还原酶的制备方法，采用大肠杆菌表达体系表 达，并采用柱层析方法纯化重组wErol蛋白；按照wErol :FAD=1:1~5的摩尔比添加 FAD到纯 化的重组wErol蛋白溶液中，获得具有生物活性的重组小麦内质网琉基氧化还原酶。包括如 下步骤：
[0020] (1)利用全基因合成技术，合成了小麦内质网琉基氧化还原酶的基因序列(SEQ ID NO: 1)，并连接至载体质粒祀T-28a(+)上，酶切位点为NdeI和趾01，构建出了小麦内质网琉 基氧化还原酶重组表达质粒祀T-28a-we;rol;
[0021] (2)将重组表达质粒祀T-28a-werol转入到大肠杆菌化21(DE3)感受态细胞中，得 到重组表达菌;将重组表达菌接种到LB培养基培养至ODsqq达到0.6~0.8，在16~37°C条件 下添加0.2~l.OmM IPTG诱导重组蛋白表达8~12小时后收集菌体；
[0022] (3)收集的菌体经冰浴超声破碎后，离屯、收集上清液，利用Ni-NTA纯化重组wErol 蛋白；
[0023] (4)按照wErol :FAD=1:1~5的摩尔比添加 FAD到纯化的重组wErol蛋白溶液中，低 溫解育过夜，经脱盐处理去除多余的FAD，获得具有生物活性的重组小麦内质网琉基氧化还 原酶。重组蛋白浓缩处理后，冻藏于-20°C备用。
[0024] 所述的小麦内质网琉基氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0025] 本发明的机理是:本发明通过原核表达获得了重组小麦内质网琉基氧化还原酶， 单独添加该酶能有效增强面粉粉质特性，改善面包的比容、高径比、弹性和硬度等烘赔品 质，达到了与化学强筋剂偶氮甲酯胺(ADA)相当的改善效果，可成为替代ADA的新型生物面 粉改良剂，用于面制品加工行业。
[0026] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0027] (1)本发明首次提供了一种应用重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面粉加工品 质的方法。该重组酶能有效增强面粉粉质特性，改善面包的比容、高径比、弹性和硬度等烘 赔品质，达到了与化学强筋剂偶氮甲酯胺(ADA)的相当的改善效果，可成为替代ADA的新型 生物面粉改良剂，用于面制品加工行业。
[0028] (2)本发明应用重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面包赔烤品质的方法，只需 在面包制作过程单独添加该重组酶，不需再添加其它的添加剂，简化了生产工序，降低了生 产成本。
[0029] (3)本发明采用原核表达的方法，获得了具有生物活性的重组小麦内质网琉基氧 化还原酶，具备表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。
【附图说明】
[0030] 图1是重组表达质粒pET-28a-werol的双酶切鉴定；其中，泳道M:DL5000DNA Marker;泳道1:双酶切片段，白色下划线为目的基因片段。
[00川图2是重组W化01的表达及可溶性分析;其中，泳道Μ:分子量Marker;泳道1:未诱导 菌液;泳道2:诱导后菌液;泳道3:细胞破碎液沉淀;泳道4:细胞破碎液上清；白色箭头所指 处为重组wErol蛋白。
[0032] 图3是亲和层析后重组wErol的SDS-PAGE分析;其中，泳道1:分子量Marker;泳道2: 细胞破碎液;泳道3:未结合蛋白；泳道4~8:洗脱液不同管收集组分。
[0033] 图4是重组wErol的酶学性质。
[0034] 图5是重组wErol和偶氮甲酯胺对面包质构参数的影响比较;其中，不同字母表示 差异显著(P<〇.〇5)。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0036] 对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明的实施例中使用的面 粉购于粮食市场；限制性内切酶Ndel和)(hoI购于Thermo Fisher Scientific公司；pET-28a (+ )质粒购于宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌化21(DE3)购于Novagen公司；全基因序 列合成由广州艾基生物技术有限公司完成。
[0037] 实施例1重组小麦内质网琉基氧化还原酶表达载体构建
[0038] 小麦内质网琉基氧化还原酶基因 （SEQ ID N0:1)合成于广州艾基生物技术有限公 司，并连接至克隆载体pGSI上。取Ing重组克隆质粒，经Ndel和趾〇1限制性内切酶反应(37 °C，30min)后，进行琼脂糖凝胶电泳并纯化带有粘性末端的小麦内质网琉基氧化还原酶基 因片段。将20yg基因片段与化g经相同限制酶酶切的质粒pET-28a( + )混合，在T4DNA连接酶 作用下于20°C连接化。连接后产物转入大肠杆菌DH5a感受态中，涂布于含卡那霉素的LB固 体培养基上培养12~16h。挑取形态饱满的单克隆菌落提取质粒，对重组质粒进行双酶切鉴 定，根据电泳结果证实了提取的质粒含有目的基因片段(图1)。
[0039] 结果:成功构建了重组表达载体祀T-28a-we;rol。
[0040] 实施例2重组wErol的诱导表达及纯化 [0041 ] 1、重组wErol的诱导表达
[0042] 将构建好的重组质粒祀T-28a-werol转化至化2UDE3)中，挑取3颗单克隆菌落到 含50yg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C，200r/m条件下培养至ODsqq到0.6~0.8左右，加入 0.2~ImM IPTG诱导表达8~12h，诱导溫度范围在16~37°C之间。经SDS-PAGE分析，重组 wErol获得可溶表达（图2)。
[0043] 2、重组wErol的亲和纯化
[0044] 收集表达后的菌体，加入缓冲液重悬，利用探头式超声仪破碎菌体细胞，超声条件 为350w，占空比0.4:0.6，超声15min。超声完全后，8000r/m离屯、20min后收集上清液。
[0045] 上清液缓慢注入M-NTA亲和层析柱中，利用线性洗脱方式纯化目的蛋白，收集各 流出峰组分，并利用SDS-PAGE检测重组蛋白（图3)。
[0046] 合并目的蛋白溶液，按wEro 1: FAD = 1:1~5的摩尔比加入FAD，4°C处理过夜，再经 脱盐、浓缩后冻藏于-20°C备用。
[0047] 结果:重组wErol获得可溶表达，经一步亲和层析获得高纯度目的蛋白。
[004引实施例3重组wErol的酶学性质
[0049] wErol含多种酶学性质，本实施例选择检测方便的FAD还原活性。其原理为wErol的 辅酶FAD在二硫苏糖醇(DTT)的作用下能够还原成FAD出，后者在450皿处无吸光值。因此，通 过检测450nm处吸光值变化，可W探究wErol的FAD还原活性。
[005日]酶活测定反应体系如下：2μΜ W化〇1和ΙΟμΜ FAD加入到50mM Tris-HCl(抑8.0)缓 冲溶液中，加入12.5mM DTT启动反应，450nm处测定吸光值。
[0化1 ] 结果:如图4所示，添力邮TT后，wErol表现出了明显的FAD还原活性。
[0化2 ] 实施例4重组wEro 1对面粉粉质特性的影响
[0053] 采用微量粉质仪表征重组wErol对面粉粉质特性影响。知面粉加入粉鉢中，6化/m 预混Imin后，加入57%的水，相同速度持续揽拌15min后得到了粉质曲线和粉质参数。W不 添加任何物质为阴性对照组，W添加偶氮甲酯胺(ADAK2化g/g)为阳性对照组，W添加重组 wErol蛋白（0.1%，w/w，面粉基）的为实验组。
[0054] 结果:与阴性对照相比，加入偶氮甲酯胺和wErol后，粉质参数变化显著，面团的稳 定时间和质量数都显著提高。然而，相比于添加偶氮甲酯胺组，加入重组wErol对面粉稳定 时间和质量数影响更大(表1)，表明重组wEro巧提高粉质特性方面优于"化学"改良剂偶氮 甲酯胺。
[0055] 表1重组wErol和偶氮甲酯胺对面粉粉质参数的影响比较
[0化6]
[0057]注:偶氮甲酯胺添加水平为20yg/g，重组wErol添加水平为0.1 % (w/w，面粉基）。同 一列中不同字母表示差异显著(P<〇.05)。
[005引实施例5 wErol改善面包赔烤品质的方法
[0059] 利用上述重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面包赔烤品质的方法，具体工艺流 程如下：
[0060] (1)材料:面粉95重量份，酵母粉(安琪高活性干酵母，市售)0.8重量份，盐1重量 份，水55重量份，糖5重量份，植物油(金龙鱼食用调和油，市售）1重量份，重组小麦内质网琉 基氧化还原酶0.05 % (w/w，面粉基）。
[0061 ] (2)和面:将上述材料加入到和面鉢中，W15化/min的速度揽拌lOmin，使其形成均 匀的面团。
[0062] (3)成型：将和好的面团置于天平上，分割成40重量份/个，在面包成型机上磋圆， 成形装盘。
[0063] (4)发酵：将装有面团的醒发盘置于醒发箱中醒发，溫度控制在30°C，相对湿度 75%，发酵时间60min。
[0064] (5)烘赔:将醒发后的面团放于烤箱中烘赔lOmin，烤箱溫度为180°C，得到面包成 品。
[0065] 将制得的面包室溫下冷却化后进行物理品质分析，面包物理参数测定重量、体积、 高度和宽度。W不添加任何物质为阴性对照组，W添加偶氮甲酯胺(2化g/g)为阳性对照组。
[0066] 如表2所示，相比于阴性对照组，加入重组wEro 1后，面包的高径比和比容显著提 高，分别增加了 11.3 %和8.2 %。而相比于阳性对照，添加重组wEro 1和偶氮甲酯胺的面包之 间不具有差异显著性。W上结果表明，与偶氮甲酯胺相比，重组wErol具有与之相当的提高 面包品质能力，因此该重组酶可W替代化学强筋剂偶氮甲酯胺，作为天然面粉改良剂应用 于面制品加工中。
[0067] 表2重组wErol和偶氮甲酯胺对面包物理参数的影响比较 [006引
[0069] 注:偶氮甲酯胺添加水平为20yg/g，重组wEro 1添加水平为0.05 % (w/w，面粉基）。 同一列中不同字母表示差异显著(P<〇.05)。
[0070] 实施例6 wErol改善面包赔烤品质的方法
[0071] 利用上述重组小麦内质网琉基氧化还原酶改善面包赔烤品质的方法，不同之处在 于，采用W下工艺流程：
[0072] (1)材料:面粉105重量份，酵母粉(安琪高活性干酵母，市售）1.5重量份，盐2重量 份，水65重量份，糖8重量份，植物油(金龙鱼食用调和油，市售)2重量份，重组小麦内质网琉 基氧化还原酶0.2 % (w/w，面粉基）。
[0073] (2)和面:将上述材料加入到和面鉢中，W18化/min的速度揽拌15min，使其形成均 匀的面团。
[0074] (3)成型：将和好的面团置于天平上，分割成60重量份/个，在面包成型机上磋圆， 成形装盘。
[0075] (4)发酵：将装有面团的醒发盘置于醒发箱中醒发，溫度控制在35°C，相对湿度 85%，发酵时间80min。
[0076] (5)烘赔:将醒发后的面团放于烤箱中烘赔15min，烤箱溫度为200°C，得到面包成 品。
[0077] 将制得的面包室溫下冷却化后进行面包质构品质分析。将面包竖切成2cm/块，面 包质构测定条件:p/25探头，测前和测试速度Imm/s，测后速度5mm/s，压缩比50%，下压间隔 10s。W不添加任何物质为阴性对照组，W添加偶氮甲酯胺(2化g/g)为阳性对照组。
[0078] 面包质构结果表明，添加偶氮甲酯胺或重组wErol都能够显著降低面包硬度和黏 性，提高面包弹性，表明两者都能提高面包的质量。而且，添加重组W化〇1和偶氮甲酯胺的面 包之间不具有差异显著性（图5)。因此，质构结果进一步表明，重组W化〇1能够替代偶氮甲酯 胺，发挥与之相当的改善面包品质能力。
[0079] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 小麦内质网巯基氧化还原酶在改善面粉加工品质中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:仅需在面粉中添加小麦内质网巯基氧化还 原酶即能达到增强面粉粉质特性，改善面包烘焙品质的目的。3. -种应用重组小麦内质网巯基氧化还原酶改善面粉加工品质的方法，其特征在于： 将重组小麦内质网巯基氧化还原酶、面粉、糖、盐、植物油、酵母粉和水搅拌均匀，形成的面 团经分割称重、成形以及醒发后，焙烤得到面包成品； 其中，所述的重组小麦内质网巯基氧化还原酶添加水平为面粉基的0.05%~0.2%w/ Wo4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述各组分添加量为：面粉95~105重量 份，酵母粉0.8~1.5重量份，盐1~2重量份，水55~65重量份，糖5~8重量份，植物油1~2重 量份。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于： 所述的应用重组小麦内质网巯基氧化还原酶改善面粉加工品质的方法，包括如下具体 步骤： (1) 材料:面粉95~105重量份，酵母粉0.8~1.5重量份，盐1~2重量份，水55~65重量 份，糖5~8重量份，植物油1~2重量份，重组小麦内质网巯基氧化还原酶0.05%~0.2% ; (2) 和面:将上述材料混合，以150~180r/min的速度搅拌10~15min，使其形成均匀的 面团； (3) 成型:将和好的面团分割成40~60重量份/个，搓圆，成形装盘； (4) 发酵：将装有面团的醒发盘置于醒发箱中醒发，温度控制在30~35°C，相对湿度 75%~85%，发酵时间60~8〇11^11 ; (5) 烘焙:将醒发后的面团，烘焙10~15min，烤箱温度为180~200°C，得到面包成品。6. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述的小麦内质网巯基氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。7. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述的小麦内质网巯基氧化还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。8. 根据权利要求3~5任一项所述的方法，其特征在于： 所述的重组小麦内质网巯基氧化还原酶采用大肠杆菌表达体系表达，并采用柱层析方 法纯化重组wErol蛋白；按照wErol :FAD=1:1~5的摩尔比添加 FAD到纯化的重组wErol蛋白 溶液中，获得具有生物活性的重组小麦内质网巯基氧化还原酶。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于： 所述的重组小麦内质网巯基氧化还原酶的制备方法，包括如下步骤： (1) 利用全基因合成技术，合成了小麦内质网巯基氧化还原酶的基因序列，并连接至载 体质粒pET-28a( + )上，酶切位点为NdeI和XhoI，构建出了小麦内质网巯基氧化还原酶重组 表达质粒pET-28a_werol; (2) 将重组表达质粒pET-28a-werol转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重 组表达菌;将重组表达菌接种到LB培养基培养至OD 6qq达到0.6~0.8，在16~37°C条件下添 加0.2~I.OmM IPTG诱导重组蛋白表达8~12小时后收集菌体； (3) 收集的菌体经冰浴超声破碎后，离心收集上清液，利用Ni-NTA纯化重组wEro 1蛋白； (4)按照wErol :FAD= 1:1~5的摩尔比添加 FAD到纯化的重组wErol蛋白溶液中，低温孵 育过夜，经脱盐处理去除多余的FAD，获得具有生物活性的重组小麦内质网巯基氧化还原 酶。
【文档编号】A21D13/06GK105875699SQ201610422861
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】胡松青, 刘光, 侯轶, 黄滟波, 李琳, 张喜梅
【申请人】华南理工大学