小麦籽粒与面粉低蛋白含量相关的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小麦育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种小麦面粉与籽粒低蛋 白含量相关的分子标记。
【背景技术】
[0002] 小麦是我国最重要的粮食作物之一，长江中下游麦区具有不利于小麦籽粒蛋白质 形成和积累的生态条件，适宜发展弱筋小麦，已经成为我国弱筋小麦生产的优势产业带。低 蛋白质含量是弱筋小麦品质的重要指标，国家优质小麦标准GB/T17893-1999规定优质弱 筋小麦蛋白质含量应在11. 5%以下；国家标准GB8608-88规定低筋小麦粉蛋白质含量应在 10%以下。
[0003] 籽粒蛋白质含量与面粉蛋白质含量必须在收获后才能进行品质测试，且易受环境 条件影响，因此选择效率较低，分子标记辅助选择，可在DNA水平针对低蛋白质含量基因对 育种材料进行选择，因而可以在苗期进行选择，并且可以克服蛋白质含量鉴定的不稳定性， 降低表型评价的成本，提高弱筋小麦品质育种效率。
[0004] SSR标记作为以PCR为基础的第二代分子标记具有以下优点：一是数量极为丰富， 且分布于整个基因组；二是多态性高，等位位点多，信息含量丰富；三是以孟德尔方式呈共 显性遗传，易区分纯合子与杂合子；四是操作简单，可直接用PCR进行分析，所需DNA量少。
[0005] 关联分析是以连锁不平衡为基础，鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基 因关系的分析方法。近年来，该技术已在小麦产量、品质、抗病性等遗传学研宄上广泛采用。
[0006] 宁麦9号是江苏省农业科学院选育的优质弱筋专用小麦品种，具有高产、稳产和 广泛的适应性及抗小麦黄花叶病、赤霉病等特点，近年来已成为长江中下游麦区小麦育种 的重要亲本，以其为亲本已经育成了 15个小麦新品种。其弱筋品质稳定，在饼干和蛋糕加 工品质上可媲美美国、澳大利亚进口的优质软质小麦。发掘与宁麦9号低蛋白含量相关的 分子标记，对弱筋小麦育种具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种结构简单、设计合理、使 用方便的一种小麦面粉与籽粒低蛋白含量相关的分子标记。
[0008] 为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明的一种小麦籽粒与面粉低蛋白含量相关 的分子标记，它的分子标记分为籽粒低蛋白含量分子标记与面粉低蛋白含量分子标记，所 述的籽粒低蛋白含量分子标记引物序列为： 上游引物序列：CTGCTCTAAGATTCATGCAACC ; 下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG; 所述的面粉低蛋白含量分子标记引物序列为： 上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT ; 下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT。
[0009] 本发明以宁麦9号及其衍生品种（系）为材料，通过关联分析的方法，获得小麦籽 粒与宁麦9号低蛋白含量相关的分子标记通过关联分析的方法，获得小麦面粉与 宁麦9号低面粉蛋白含量相关的分子标记你。通过该分子标记辅助育种，可以克服常 规品质育种周期长、苗期无法鉴定的不足。常规品质育种只能在杂交4代后才能对蛋白质 含量进行检测，利用分子标记辅助选择，在低世代的苗期即可对低蛋白含量相关的分子标 记进行选择，有利于减少育种家对该性状选择的工作量，提高选择的准确性和育种效率，是 一种高效、快速的育种新技术。
【附图说明】
[0010] 图1为【具体实施方式】中籽粒低蛋白分子标记扩增结果示意图； 图2为【具体实施方式】中面粉低蛋白分子标记扩增结果示意图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0012] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施 方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的【具体实施方式】仅用以解释本 发明，并不用于限定本发明。
[0013] 本【具体实施方式】米用如下技术方案：它的分子标记分为籽粒低蛋白含量分子标记 与面粉低蛋白含量分子标记，所述的籽粒低蛋白含量分子标记引物序列为： 上游引物序列：CTGCTCTAAGATTCATGCAACC ; 下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG; 所述的面粉低蛋白含量分子标记引物序列为： 上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT ; 下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT。
[0014] 以宁麦9号及其117个衍生品种（系）为材料，其中，衍生一代39份，衍生二代 78份。
[0015] 依据Somers等的整合遗传连锁图筛选到185对多态性引物，每条染色体5-14对， 平均8. 8对。
[0016] PCR 反应体系为 10 μ L，包含 IOXbuffer 1 μ L、15 mmol I/1 MgCl2 0· 6 μ L、2 mmol I/1 dNTP 0.8yL、20 ng μL/1引物 I yL、0.1 yL 7? 禮、20 ng yL-1 模板 DNA3 以1、去离子水3.5以1^。？0?扩增程序为94°0预变性5 11^11;然后94°0变性45 8,60°〇 退火45 s，72°C延伸90 s，36个循环；最后72°C延伸10 min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测。在相同位点上，有带记为1，无带记为0,缺失记为9。
[0017] 2009、2010连续两年将宁麦9号及其117个衍生品种（系）种植于江苏省农科院 试验基地，3行小区田间种植。2010和2011年分别收获种子晾干，利用Perton DA7200近 红外品质测定仪按照GB/T 24899-2010方法测定籽粒蛋白含量；用Buhler 202磨粉机将籽 粒磨成面粉后，按照GB 5511-85方法测定面粉蛋白含量。
[0018] 利用Excel 2007对基因型及表型数据进行初步统计分析；用TASSEL 3. 0软件的 MLM(mixed linear model)程序对两年的面粉蛋白质含量进行关联分析，并估算各标记效 应，P〈0.0 l时认为该标记与目标性状相关联，统计连续两年关联到的标记位点。
[0019] 利用Excel 2007对基因型及表型数据进行初步统计分析；用TASSEL 3. 0软件的 MLM(mixed linear model)程序对两年收获籽粒及面粉的蛋白质含量进行关联分析，并估 算各标记效应，P〈〇. 01时认为该标记与目标性状相关联，统计连续两年关联到的标记位点。
[0020] 利用分子标记对小麦品种宁麦9号的衍生品系进行籽粒与面粉蛋白质含量预测。
[0021] 小麦籽粒低蛋白含量分子标记过程如下： 以宁麦9号及其8个衍生品系为材料，分别采用CTAB法从这些植株叶片中分离DNA，利 用上下游引物对其进行PCR扩增，扩增产物在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，判断衍生品 系DNA的PCR产物是否与宁麦9号扩增条带一致。
[0022] 扩增结果如图2所示，1-8为宁麦9号衍生品系，N为宁麦9号，M为20 bp marker。 图中出现2种带型，6、7、8三个品系DNA的PCR产物与宁麦9号扩增条带一致，认为其为 低籽粒蛋白含量品系；1-5带型不同，判断其为高籽粒蛋白含量品系。按照国家标准GB/ T17893-1999定义小麦籽粒蛋白质含量小于11. 5为"低"，大于或等于11. 5为"高"。
[0023] 基于此判定方法和标准对每个小麦品系的籽粒蛋白质含量进行预测，小麦收获后 按照GB/T 24899-2010方法对籽粒蛋白质含量进行实测并与预测结果比对，预测结果与实 测结果吻合，结果参见下表。
[0024] 小麦面粉低蛋白含量分子标记过程如下： 以宁麦9号及其10个衍生品系为材料，分别采用CTAB法从这些植株叶片中分离DNA， 利用上下游引物对其进行PCR扩增，扩增产物在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，判断衍生 品系DNA的PCR产物是否与宁麦9号扩增条带一致。
[0025] 扩增结果如图1所示，1-10为宁麦9号衍生品系，N为宁麦9号，M为20 bp marker。 图中出现3种带型，7、8、9、10四个品系DNA的PCR产物与宁麦9号扩增条带一致，认为 其为低面粉蛋白含量品系；1-6带型不同，判断其为高面粉蛋白含量品系。按照国家标准 GB8608-88定义小麦面粉蛋白质含量小于或等于10%为"低"，大于10%为"高"。
[0026] 基于此判定方法和标准对每个小麦品系的面粉蛋白质含量进行预测，小麦收获后 按照GB 5511-85方法对面粉蛋白质含量进行实测并与预测结果比对，预测结果与实测结 果吻合，结果参见下表。
[0027] 以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发 明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围， 均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.小麦籽粒与面粉低蛋白含量相关的分子标记，其特征在于：它的分子标记分为籽粒 低蛋白含量分子标记与面粉低蛋白含量分子标记， 所述的籽粒低蛋白含量分子标记引物序列为： 上游引物序列：CTGCTCTAAGAITCATGCAACC; 下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG; 所述的面粉低蛋白含量分子标记引物序列为： 上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT; 下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT。
【专利摘要】本发明公开了小麦籽粒与面粉低蛋白含量相关的分子标记，它涉及小麦育种和分子生物学技术领域；它的分子标记分为籽粒低蛋白含量分子标记与面粉低蛋白含量分子标记，所述的籽粒低蛋白含量分子标记引物序列为：上游引物序列：CTGCTCTAAGATTCATGCAACC；下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG；所述的面粉低蛋白含量分子标记引物序列为：上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT；下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT；本发明有利于减少育种家对该性状选择的工作量，提高选择的准确性和育种效率，是一种高效、快速的育种新技术。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104911266
【申请号】CN201510315042
【发明人】姜朋, 马鸿翔, 张平平, 张旭, 陈小霖
【申请人】姜朋
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月10日