小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及小麦籽粒硬度相关蛋白Pina及其编码基因与其在小麦品质改良中的应用。
背景技术：
目前，籽粒硬度是最重要的小麦品质性状之一，严重影响着润麦加水量、出粉率、面粉颗粒大小、破损淀粉粒数量和烘烤等终产品加工品质，主要受位于5D染色体短臂上的一对主效基因Ha控制。根据胚乳质地差异，常常把普通小麦分成硬质麦、混合麦和软质麦。一般而言，因软质麦磨制的面粉颗粒度较小，破损淀粉含量低，吸水能力较弱，而适合于制作饼干、糕点和蛋糕等甜类食品；硬质麦则由于磨制的面粉颗粒度较大，破损淀粉含量高，吸水能力强而更适合于制作面包和优质面条等。当一组大约15kD的蛋白质从小麦的水洗淀粉中提取出来，命名为friabilin后，籽粒硬度的分子遗传基础研究开始进一步加快。Friabilin蛋白的两种主要组分puroindolinea(PINA)和puroindoline b(PINB)是形成小麦籽粒硬度的基础。籽粒硬度由位于染色体5D短臂(5DS)上的主效基因Pina和Pinb(统称为puroindoline)以及一些微效基因控制，软质(Ha)相对于硬质(ha)为显性。当Pina和Pinb同为野生型(即Pina-D1a/Pinb-D1a)时，籽粒表现为软质，Pina和Pinb中的任一基因缺失或突变，籽粒表现为硬质，硬粒小麦没有D组染色体，籽粒硬度最大。Pina-D1a具有序列表中序列5的核苷酸序列，编码具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的PINA；序列6中，自氨基端的第1位至第19位氨基酸残基为信号肽，信号肽的切割位点(cleavesite of the signal peptide)在自氨基端的第19位和第20位氨基酸残基之间；自氨基端的第20位至第28位氨基酸残基为N端终止序列(N-terminal end of PINA)；自氨基端的第29位至第148位氨基酸残基为PINA的成熟蛋白序列(Gautier M F，Aleman M E，Guirao A，Marion D，Joudrier P.1994.Triticum aestivumpuroindolines，two basic cycteine-rich seed proteinscDNA sequence analysisand developmental gene expression.Plant Mol Biol，2543-57)。Pinb-D1a具有序列表中序列7的核苷酸序列，编码具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的PINB；序列8中，自氨基端的第1位至第19位氨基酸残基为信号肽，信号肽的切割位点(cleave site of the signal peptide)在自氨基端的第19位和第20位氨基酸残基之间；自氨基端的第20位至第29位氨基酸残基为N端终止序列(N-terminal endof PINB)；自氨基端的第30位至第148位氨基酸残基为PINB的成熟蛋白序列(GautierM F，Aleman M E，Guirao A，Marion D，Joudrier P.1994.Triticum aestivumpuroindolines，two basic cycteine-rich seed proteinscDNA sequence analysisand developmental gene expression.Plant Mol Biol，2543-57)，软质麦淀粉表面puroindoline蛋白含量较高，硬质麦puroindoline含量较低，而缺少了D组染色体的硬粒小麦则没有发现这种蛋白。Giroux等对两个硬麦品种进行研究，发现Pinb基因中有一位点发生了突变，导致成熟蛋白氨基酸序列中第46位(自序列8的氨基端第75位)的Gly变为Ser，将此突变类型命名为Pinb-D1b。此后，相继有多种Pinb突变类型被发现。Lillemo和Morris发现了Pinb基因两种新的突变类型，一个是成熟蛋白氨基酸序列第60位(自序列8的氨基端第89位)的Leu变为Pro，将此突变类型命名为Pinb-D1c，另一个是成熟蛋白氨基酸序列第44位(自序列8的氨基端第73位)氨基酸由Trp变为Arg，将此突变类型命名为Pinb-D1d。Morris等发现，一种硬红春小麦的Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第39位(自序列8的氨基端第68位)氨基酸Trp的密码子突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1e；在一种硬红冬小麦的Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第44位氨基酸(自序列8的氨基端第73位)Trp的密码子突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1f；在另一种硬红冬小麦的Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第56位(自序列8的氨基端第85位)氨基酸Cys的密码子突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1g。最近，Massa等和Gedye等在山羊草中新发现了六种Pina基因和四种Pinb基因的等位变异，但均表现为软质。Chen等在我国冬麦品种京冬11中发现Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第44位(自序列8的氨基端第73位)色氨酸变成了亮氨酸的新变异类型，命名为Pinb-D1q，将其与已知的各种突变类型比较后，发现Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第44位氨基酸突变频率较高，先前报道的Pinb-D1d和Pinb-D1f也发生在这个位点。Pina-D1b突变型先前被认为与PINA蛋白缺失完全等同，随着最近PINA蛋白缺失多种原因的发现，将其中最为普遍的因Pina基因缺失而导致PINA蛋白缺失类型命名为Pina-D1b(Gazza L，Nocente F，Ng PKW，Pogna NE.Genetic and biochemical analysis of common wheatcultivars lacking puroindoline a.Theor Appl Genet，2005，110470-478)，但与Pinb基因相比，有关Pina基因的新变异类型报道相对较少，Gazza等(Gazza L，Nocente F，Ng PKW，Pogna NE.Genetic and biochemical analysis of common wheatcultivars lacking puroindoline a.Theor Appl Genet，2005，110470-478)在对普通小麦PINA缺失的遗传和生化基础研究中发现，大多数PINA缺失品种不能扩增出Pina全长基因，但有两个品种Fortuna和Glenman能扩增出Pina基因，其PINA缺失的原因是由于Pina基因内部第265位点碱基C的缺失造成的，最初命名为Pina-D1c，但与Massa等(Massa AN，Morris CF，Gill BS.Sequence diversity ofpuroindoline-a，puroindoline-b，and the grain softness protein genes inAegilops tauschii coss.Crop Sci，2004，441808-1816)命名冲突，后来重新命名为Pina-D1m。现在一致认为，普通小麦中，Pina基因不表达和Pinb基因发生突变均导致小麦胚乳质地变硬，而且Pina基因对小麦籽粒硬度的调控作用大于Pinb基因。

发明内容
本发明的目的是提供小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的小麦籽粒硬度相关蛋白，来源于小麦，具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列；2)序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列；3)将序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。
将具有序列表中SEQ ID №1氨基酸残基序列的蛋白质命名为PINA-D1L，序列表中的SEQ ID №1由148个氨基酸残基组成。序列1中，自氨基端的第1位至第19位氨基酸残基为信号肽，信号肽的切割位点(cleave site of the signal peptide)在自氨基端的第19位和第20位氨基酸残基之间；自氨基端的第20位至第28位氨基酸残基为N端终止序列；自氨基端的第29位至第148位氨基酸残基为PINA-D1L的成熟蛋白序列。与野生型PINA相比，自序列1的氨基端的第63位(成熟蛋白序列的第35位)Ser由Pro突变而来。
将具有序列表中SEQ ID №3氨基酸残基序列的蛋白质命名为PINA-D1N，序列表中的SEQ ID №3由70个氨基酸残基组成。序列1中，自氨基端的第1位至第19位氨基酸残基为信号肽，信号肽的切割位点(cleave site of the signal peptide)在自氨基端的第19位和第20位氨基酸残基之间；自氨基端的第20位至第28位氨基酸残基为N端终止序列；自氨基端的第29位至第70位氨基酸残基为PINA-D1N的成熟蛋白序列。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述小麦籽粒硬度相关蛋白PINA-D1L，PINA-D1N的编码基因(Pina-D1l，Pina-D1n)也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID №4的多核苷酸序列；3)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸序列；4)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸序列；5)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2或SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID №2的多核苷酸序列为PINA-D1L的编码基因Pina-D1l，由447个碱基组成，其编码框为自5’端第1到第444位脱氧核苷酸；自5’端第187位脱氧核苷酸T由C突变而来。
序列表中SEQ ID №4的多核苷酸序列为PINA-D1N的编码基因Pina-D1n，由447个碱基组成，其编码框为自5’端第1到第210位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列的蛋白质；与未发生突变的Pina-D1a的编码基因相比，它的核苷酸序列自5’端第212位脱氧核苷酸由G变成了A，使Trp的密码子TGG突变成了终止密码子TAG。
上述小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。
本发明Pina-D1l基因表达friabilin蛋白量减少，导致小麦籽粒SKCS硬度提高。Pina-D1n基因不再表达friabilin蛋白，由此而导致小麦籽粒SKCS硬度急剧增加。含有本发明的小麦籽粒硬度相关蛋白编码基因的小麦籽粒硬度分别同野生型Pina-D1a的同品种小麦(籽粒硬度为20，野生型小麦籽粒硬度指数范围一般为0-40)相比有较大提高，籽粒硬度分别达73(Pina-D1l突变型)和75(Pina-D1n突变型)。本发明的小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因将在小麦籽粒硬度的基因工程改良和优良小麦品种的培育中起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究。


图1为引物1和引物3、引物1和引物2对不同小麦品种的PCR扩增结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由北京奥科公司合成。
实施例1、小麦Pina-D1l和Pina-D1n的获得及Puroindoline基因型分析小麦材料小麦品种红和尚(ZM6237)、钻头白壳(ZM6216)、仙麦(ZM6304)、白芒春(ZM6183和ZM6337)、鸭嘴小麦(ZM6189)和鸭嘴子(ZM6356)、Pinb-D1b突变型品种济南17、Pinb-D1c突变型品种青春533、Pina-D1b突变型品种Falcon、野生型小麦品种中国春(上述品种购自中国农业科学院作物科学所品种资源库；ZM6237，ZM6216等为小麦品种在中国农业科学院作物科学所品种资源库的编号(ZM即为地方品种，是按品种收集时间先后顺序编的号)。
一、籽粒硬度测定将上述小麦样品在同一条件下放置3d，使籽粒的含水量控制在11-13％之间。用单粒谷物硬度仪(SKCS 4100，瑞典Perten公司)测定300粒小麦样品的硬度值，根据测定结果确定籽粒的硬度级别，同时记录千粒重和籽粒直径。
SKCS分析结果表明，红和尚的SKCS硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为73±13和01-03-09-87，级别分类均为1级，属于硬质麦。钻头白壳(ZM6216)、仙麦(ZM6304)、白芒春(ZM6183和ZM6337)、鸭嘴小麦(ZM6189)和鸭嘴子(ZM6356)小麦SKCS硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为69±19和9-8-11-72，69±16和3-6-15-76，67±17和3-9-13-75，75±16和1-3-12-84，73±17和3-4-11-82，级别分类均为1级，属于硬质麦。野生型小麦品种中国春硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为20±13和95-4-1-0；Pinb-D1b突变型品种济南17硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为62±15和3-5-14-78、Pinb-D1c突变型品种青春533硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为73±16和2-6-6-86、Pina-D1b突变型品种Falcon硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为74±13和0-4-5-91。
二、两种新突变Pina-D1l和Pina-D1n的获得对步骤一经SKCS分析的红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子Pinb-D1b突变型品种济南17、Pinb-D1c突变型品种青春533、Pina-D1b突变型品种Falcon小麦样品中的puroindoline(包括PinA和PinB)进行分析，具体方法包括以下步骤1、提取小麦籽粒基因组DNA选取上述各品种的小麦各一粒有代表性的种子(将其切割后根据其角质率判断是否与SKCS分析结果吻合)，提取小麦籽粒基因组DNA，具体方法为1)用锤子砸碎后放入1.5mL离心管中，加入1mL样品提取液(含288mM NaCl，200mM Tris-HCl，25mMEDTA，0.5％SDS，pH8.0)，摇30分钟，使其充分混匀；2)在4℃、12,000rpm下离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1)；3)12,000rpm离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入0.5倍上清体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分摇匀；4)12,000rpm离心10分钟，移上清至另一新的2mL离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(pH＝5.2)和0.6倍上清体积的异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀；5)12,000rpm离心15分钟，弃上清，加入0.5mL 70％乙醇，静置5min；6)12,000离心5min，弃上清。真空干燥后加入100μL TE溶解沉淀，沉淀即为小麦籽粒基因组DNA。最后，用紫外分光光度计检测小麦籽粒基因组DNA的浓度，-20℃下保存备用。
2、用PCR方法鉴定所调查小麦品种是否为Pinb-D1b突变型(以济南17为对照)鉴定红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子是否为Pinb-D1b变异类型，即检测PINB成熟蛋白氨基酸序列中第46位(自序列8的氨基端第75位)是否由甘氨酸(密码子为GGC)变为丝氨酸(密码子为AGC)。所用的引物序列如下鉴定Pinb-D1b突变型的特异引物系列为引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物2(下游)5’-CTCATGCTCACAGCCGCT-3’鉴定非Pinb-D1b类型，即检测PINB成熟蛋白氨基酸序列中第46位点甘氨酸未发生变化的类型，所用的引物序列为引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物3(下游)5’-CTCATGCTCACAGCCGCC-3’以步骤1获得的红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子的籽粒基因组DNA和Pinb-D1b突变型品种济南17的DNA为模板，分别在Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)和Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系的组成均为1.5mmol/L MgCl2，0.3mmol/L dNTP，上、下游引物各10pmol，模板DNA 200ng，0.5UTaq酶，加1×PCR缓冲液(含10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，50mmol/L KCl，1.0％Triton X-100)定容至25μL。PCR反应程序为先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，58℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后，72℃延伸5min。PCR扩增结束后，取上述两种PCR扩增产物各10μL分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(采用1×TAE缓冲液；溴化乙锭(EB)染色，160V，1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGenius Gel Documentation and AnalysisSystem)扫描成像并用计算机进行分析，扩增结果如图1所示。分析结果表明红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子用Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)扩增出了250bp的DNA片段，而用Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)未扩增出250bp的DNA片段；而Pinb-D1b突变型品种济南17用Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)未扩增出250bp的DNA片段，而用Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)扩增出了250bp的DNA片段；证明红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子不是Pinb-D1b突变型。部分品种的扩增结果如图1所示，图1中，从左向右依次为分子量标准DL2000(法捷特公司，1和12泳道)、济南17(2和3泳道)、红和尚(4和5泳道)、钻头白壳(6和7泳道)、仙麦(8和9泳道)和白芒春(10和11泳道)。其中，第2、4、6、8和11泳道均为用Pinb-D1b非特异引物扩增结果，第3、5、7、9和10泳道均为用Pinb-D1b特异引物扩增结果。
3、用PCR及酶切的方法鉴定所调查小麦是否为Pinb-D1c突变型(以青春533为对照)。
鉴定红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子是否为Pinb-D1c变异类型，即检测PINB成熟蛋白氨基酸序列中第60位点是否由亮氨酸(密码子为CTG)变为脯氨酸(密码子为CCG)。首先扩增Pinb全长序列，所用的引物序列如下引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物4(下游)5-TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3’以步骤1获得的红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子的籽粒基因组DNA和Pinb-D1c变异类型品种青春533为模板，在Pinb全长序列引物(引物1和引物4)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增程序与步骤2相同。然后，对PCR产物用PvuII限制性内切酶进行酶切，酶切体系为，3μL 10×NE缓冲液2(NEB公司)，0.2U PvuII内切酶(NEB公司)，20μL PCR产物，加ddH2O定容至30μL；酶切条件为37℃酶切2h。酶切后，取酶切产物10μL进行2.0％琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭(EB)染色，80-100V，1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGeniusGel Documentation and Analysis System)扫描成像并用计算机进行分析，分析结果表明，红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子扩增产物能被PvuII切割成264bp和183bp两个片段，而Pinb-D1c变异类型品种青春533的扩增产物不能被PvuII酶切；证明所调查小麦均不是Pinb-D1c突变型。
4、用SDS-PAGE鉴定所调查小麦是否为Pina-D1b突变型(以Falcon为对照)。
包括以下步骤(1)提取籽粒蛋白分别选取一粒红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦、鸭嘴子和Pina-D1b突变型品种Falcon，按下述步骤提取籽粒蛋白1)研磨后放入一个2mL离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液(Tris-buffered saline，Tris缓冲盐溶液，pH8.0)和0.15mL12％Triton-X114(Sigma公司)，混合后4℃放置12-24h；2)12000rpm离心3分钟，移上清至1.5mL离心管中，37℃温育半小时；3)12000rpm离心5min，弃上清，移下层至一新的离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液，37℃温育30min；4)12000rpm离心3min，弃上清，加入900μL预冷的丙酮，涡旋后在-20℃冰箱中放置30min；5)12000rpm离心2min，弃上清，用丙酮再洗一遍后置于空气中进行干燥，得到小麦籽粒蛋白。
(2)SDS-PAGE电泳鉴定1)向步骤1提取的籽粒蛋白中加入150μL样品缓冲液(含7.57mg/mL Tris，10％甘油，0.02mg/mL SDS，0.0125mg/mL溴酚兰，pH8.0)；2)将加入样品缓冲液的籽粒蛋白在70℃下温育15min，取25μL进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为用浓缩胶(浓度T为4％，胶联度C为2.67％)在40mA下电泳，待指示剂到达分离胶(浓度T为13.5％，胶联度C为2.6％)后将电压功率转换成12W，待指示剂到达分离胶底部后再电泳30min。为减少蛋白的扩散，用10％甘油代替水配制分离胶。凝胶配制时用PDA(Piperiazine diacrylamide)代替甲叉以使背景更为清晰，胶更加结实和富有弹性。按Morris等(Morris C F，Massa A N.Puroindoline genotype of the U.S.nationalinstitute of standards & technology reference material 8441，wheat hardness.Cereal Chemistry，2003，80674-678)的方法进行染色(用三氯乙酸和甲醇固定、银染显色，用柠檬酸停止显色)。SDS-PAGE电泳结果表明红和尚中表达有约15kDa的PINA，而Pina-D1b突变型品种Falcon无约15kDa的PINA，经引物5(5’-ATGAAGGCCCTCTTCCTCA-3’)和引物6(5’-TCACCAGTAATAGCCAATAGTG-3’)扩增后Pina-D1b突变型品种Falcon没有Pina基因条带，而红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦、鸭嘴子均有Pina；证明红和尚不是PINA蛋白缺失型；而钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子无约15kDa的PINA，属于PINA蛋白缺失型，但经引物5和引物6扩增后仍然有447bp Pina片段出现，即不属于Pina-D1b类型。
5、测序鉴定红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子硬度基因型扩增Pinb的全长引物序列为引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物4(下游)5’-TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3’扩增Pina的全长引物序列为引物5(上游)5’-ATGAAGGCCCTCTTCCTCA-3’引物6(下游)5’-TCACCAGTAATAGCCAATAGTG-3’经上述步骤2-4鉴定，证明红和尚不是Pinb-D1b、Pinb-D1c和Pina-D1b(PINA缺失)突变型。而钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子虽然为PINA缺失类型，但不属于Pina-D1b类型。为确证其硬度基因的变异类型，从红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子每一小麦样品中分别选取10粒种子，以其基因组DNA为模板，分别在Pinb全长引物(引物1和引物4)和Pina全长引物(引物5和引物6)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件与步骤2相同，然后将PCR产物送至博亚和奥科公司测序。测序结果表明所调查小麦品种的Pinb基因均为野生型Pinb-D1a，而红和尚的Pina基因具有序列表中的SEQ ID №2的核苷酸序列，钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子Pina基因则具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID №2和4均由447个碱基组成，SEQ ID №2的编码框为自5’端第1到第444位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；SEQ ID №4的编码框为自5’端第1到第210位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列的蛋白质。将测序结果分别与已知的野生型Pina序列进行比较发现红和尚中的Pina基因的核苷酸序列中自5’端第187位碱基，由碱基C突变为T，从而导致Pina编码的氨基酸残基序列(SEQID №1)中第63位氨基酸由Pro突变为Ser；钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子中的Pina基因的核苷酸序列中自5’端第212位碱基，由碱基G变成了A，从而导致Pina基因编码的氨基酸残基序列中第71位氨基酸由Trp突变为终止密码子；上述两种突变类型与先前所有报道的已知突变类型均不相同。根据McIntosh等在Genebank上公布的硬度基因排名，分别将其命名为Pina-D1l和Pina-D1n。而且分别从红和尚、钻头白壳、仙麦、白芒春、鸭嘴小麦和鸭嘴子选出的10粒硬粒种子测序结果一致，均为Pina-D1l或Pina-D1n突变类型，从而进一步证实了上述结果的可靠性。
序列表<160>8<210>1<211>148<212>PRT<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)<400>1Met Lys Ala Leu Phe Leu Ile Gly Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr1 5 10 15Ala Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Val Gly Ser Tyr Asp Val Ala Gly20 25 30Gly Gly Gly Ala Gln Gln Cys Pro Val Glu Thr Lys Leu Asn Ser Cys35 40 45Arg Asn Tyr Leu Leu Asp Arg Cys Ser Thr Met Lys Asp Phe Ser Val50 55 60Thr Trp Arg Trp Trp Lys Trp Trp Lys Gly Gly Cys Gln Glu Leu Leu65 70 75 80Gly Glu Cys Cys Ser Arg Leu Gly Gln Met Pro Pro Gln Cys Arg Cys85 90 95Asn Ile Ile Gln Gly Ser Ile Gln Gly Asp Leu Gly Gly Ile Phe Gly100 105 110Phe Gln Arg Asp Arg Ala Ser Lys Val Ile Gln Glu Ala Lys Asn Leu115 120 125Pro Pro Arg Cys Asn Gln Gly Pro Pro Cys Asn Ile Pro Gly Thr Ile130 135 140Gly Tyr Tyr Trp145<210>2<211>447
<212>DNA<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)<400>2atgaaggccc tcttcctcat aggactgctt gctctggtag cgagcaccgc ctttgcgcaa60tatagcgaag ttgttggcag ttacgatgtt gctggcgggg gtggtgctca acaatgccct120gtagagacaa agctaaattc atgcaggaat tacctgctag atcgatgctc aacgatgaag180gatttctcgg tcacctggcg ttggtggaaa tggtggaagg gaggttgtca agagctcctt240ggggagtgtt gcagtcggct cggccaaatg ccaccgcaat gccgctgcaa catcatccag300gggtcaatcc aaggcgatct cggtggcatc ttcggatttc agcgtgatcg ggcaagcaaa360gtgatacaag aagccaagaa cctgccgccc aggtgcaacc agggccctcc ctgcaacatc420cccggcacta ttggctatta ctggtga447<210>3<211>70<212>PRT<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)<400>3Met Lys Ala Leu Phe Leu Ile Gly Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr1 5 10 15Ala Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Val Gly Ser Tyr Asp Val Ala Gly20 25 30Gly Gly Gly Ala Gln Gln Cys Pro Val Glu Thr Lys Leu Asn Ser Cys35 40 45Arg Asn Tyr Leu Leu Asp Arg Cys Ser Thr Met Lys Asp Phe Pro Val50 55 60Thr Trp Arg Trp Trp Lys65 70<210>4<211>447<212>DNA<213>小麦属(Triticum aestivum L.)
<400>4atgaaggccc tcttcctcat aggactgctt gctctggtag cgagcaccgc ctttgcgcaa60tatagcgaag ttgttggcag ttacgatgtt gctggcgggg gtggtgctca acaatgccct120gtagagacaa agctaaattc atgcaggaat tacctgctag atcgatgctc aacgatgaag180gatttcccgg tcacctggcg ttggtggaaa tagtggaagg gaggttgtca agagctcctt240ggggagtgtt gcagtcggct cggccaaatg ccaccgcaat gccgctgcaa catcatccag300gggtcaatcc aaggcgatct cggtggcatc ttcggatttc agcgtgatcg ggcaagcaaa360gtgatacaag aagccaagaa cctgccgccc aggtgcaacc agggccctcc ctgcaacatc420cccggcacta ttggctatta ctggtga447<210>5<211>447<212>DNA<213>小麦属(Triticum aestivum L.)<400>5atgaaggccc tcttcctcat aggactgctt gctctggtag cgagcaccgc ctttgcgcaa60tatagcgaag ttgttggcag ttacgatgtt gctggcgggg gtggtgctca acaatgccct120gtagagacaa agctaaattc atgcaggaat tacctgctag atcgatgctc aacgatgaag180gatttcccgg tcacctggcg ttggtggaaa tggtggaagg gaggttgtca agagctcctt240ggggagtgtt gcagtcggct cggccaaatg ccaccgcaat gccgctgcaa catcatccag300gggtcaatcc aaggcgatct cggtggcatc ttcggatttc agcgtgatcg ggcaagcaaa360gtgatacaag aagccaagaa cctgccgccc aggtgcaacc agggccctcc ctgcaacatc420cccggcacta ttggctatta ctggtga447<210>6<211>148<212>PRT<213>小麦属(Triticum aestivum L.)<400>6Met Lys Ala Leu Phe Leu Ile Gly Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr1 5 10 15
Ala Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Val Gly Ser Tyr Asp Val Ala Gly20 25 30Gly Gly Gly Ala Gln Gln Cys Pro Val Glu Thr Lys Leu Asn Ser Cys35 40 45Arg Asn Tyr Leu Leu Asp Arg Cys Ser Thr Met Lys Asp Phe Pro Val50 55 60Thr Trp Arg Trp Trp Lys Trp Trp Lys Gly Gly Cys Gln Glu Leu Leu65 70 75 80Gly Glu Cys Cys Ser Arg Leu Gly Gln Met Pro Pro Gln Cys Arg Cys85 90 95Asn Ile Ile Gln Gly Ser Ile Gln Gly Asp Leu Gly Gly Ile Phe Gly100 105 110Phe Gln Arg Asp Arg Ala Ser Lys Val Ile Gln Glu Ala Lys Asn Leu115 120 125Pro Pro Arg Cys Asn Gln Gly Pro Pro Cys Asn Ile Pro Gly Thr Ile130 135 140Gly Tyr Tyr Trp145<210>7<211>447<212>DNA<213>小麦属(Triticum aestivum L.)<400>7atgaagacct tattcctcct agctctcctt gctcttgtag cgagcacaac cttcgcgcaa60tactcagaag ttggcggctg gtacaatgaa gttggcggag gaggtggttc tcaacaatgt120ccgcaggagc ggccgaagct aagctcttgc aaggattacg tgatggagcg atgtttcaca180atgaaggatt ttccagtcac ctggcccaca aaatggtgga agggcggctg tgagcatgag240gttcgggaga agtgctgcaa gcagctgagc cagatagcac cacaatgtcg ctgtgattct300atccggcgag tgatccaagg caggctcggt ggcttcttgg gcatttggcg aggtgaggta360ttcaaacaac ttcagagggc ccagagcctc ccctcaaagt gcaacatggg cgccgactgc420aagttcccta gtggctatta ctggtga447<210>8
<211>148<212>PRT<213>小麦属(Triticum aestivum L.)<400>8Met Lys Thr Leu Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr1 5 10 15Thr Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Gly Gly Trp Tyr Asn Glu Val Gly20 25 30Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Cys Pro Gln Glu Arg Pro Lys Leu Ser35 40 45Ser Cys Lys Asp Tyr Val Met Glu Arg Cys Phe Thr Met Lys Asp Phe50 55 60Pro Val Thr Trp Pro Thr Lys Trp Trp Lys Gly Gly Cys Glu His Glu65 70 75 80Val Arg Glu Lys Cys Cys Lys Gln Leu Ser Gln Ile Ala Pro Gln Cys85 90 95Arg Cys Asp Ser Ile Arg Arg Val Ile Gln Gly Arg Leu Gly Gly Phe100 105 110Leu Gly Ile Trp Arg Gly Glu Val Phe Lys Gln Leu Gln Arg Ala Gln115 120 125Ser Leu Pro Ser Lys Cys Asn Met Gly Ala Asp Cys Lys Phe Pro Ser130 135 140Gly Tyr Tyr Trp14权利要求
1.小麦籽粒硬度相关蛋白，具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列；2)序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列；3)将序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。
2.权利要求1所述小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因。
3.小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID №4的多核苷酸序列；3)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的DNA；4)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的DNA；5)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2或SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的小麦籽粒硬度相关蛋白编码基因的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的小麦籽粒硬度相关蛋白编码基因的细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的小麦籽粒硬度相关蛋白编码基因的宿主菌。
7.权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因在小麦品质改良中的应用。
全文摘要
本发明公开了小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的小麦籽粒硬度相关蛋白，具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1氨基酸残基序列；2)序列表中的SEQ ID №3氨基酸残基序列；3)将序列表中SEQ ID№1或SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。本发明对小麦籽粒硬度的基因工程改良将起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究，对优良小麦品种的培育也具有重大意义。
文档编号C12N15/29GK1821270SQ200510090600
公开日2006年8月23日 申请日期2005年8月19日 优先权日2005年8月19日
发明者何中虎, 陈锋, 夏先春 申请人:中国农业科学院作物科学研究所