专利名称：一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物的培养方法及其专用培养基，特别是涉及一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基。
背景技术：
研究表明酵母拮抗菌Cryptococcus laurentii(C.laurentii)对葡萄、桃、苹果、冬枣、甜樱桃等果实的主要采后病害均具有明显抑制效果(刘海波，田世平，秦国政，徐勇.罗伦隐球酵母对葡萄采后病害的拮抗效果.中国农业科学，2002，35831-835.；林丽，田世平，秦国政，徐勇.两种拮抗酵母菌对桃果实贮藏期间主要病害的防治效果.中国农业科学，2003，361535-1539.)；可以耐受低温、低氧和高二氧化碳等果实采后的主要贮藏条件(Qin G Z，Tian S P.Biocontrol ofpostharvest diseases of jujube fruit by Cryptococcus laurentii combined witha low dosage of fungicides under different storage conditions.Plant Dis.，2004a，88497-501.)，能够与鉬酸铵、碳酸氢钠、水杨酸以及低剂量的杀菌剂(Qinet al.，2004a)配合使用(Wan Y K，Tian S P，Qin G Z.Enhancement of biocontrolactivitv of yeasts by adding sodium bicarbonate or ammonium molybdate tocontrol postharvest disease of jujube fruits.Lett.Appl.Microbiol.，2003，371-5.)，并能在采前田间喷施(Tian S P，Qin G Z，Xu Y.Survival of antagonisticyeasts under field conditions and their biocontrol ability against postharvestdiseases of sweet cherry.Postharvest Biol.Technol.，2004a，In press.)，具有良好的应用前景。但对于如何规模化生产酵母拮抗菌，获得高效、低成本的生物制品，以进行产业化应用目前还未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于大量、快速培养酵母拮抗菌C.laurentii的专用培养基。
本发明所提供的酵母拮抗菌的专用培养基，其碳源选自下述物质中的一种或几种柠檬酸、苹果酸或/和葡萄糖；氮源选自下述物质中的一种或几种大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨；无机养分选自下述物质中的一种或几种MgSO4、CaCl2或/和MgCl2中的一种或几种，蒸馏水定容至1000mL。
在上述酵母拮抗菌的专用培养基中，各种碳源的添加量分别为柠檬酸20-60g，苹果酸0-10g，葡萄糖0-10g；各种氮源的添加量分别为大豆蛋白胨10-30g，牛肉浸膏0-1g，肉蛋白胨0-10g，胰酶解蛋白胨0-10g；各种无机养分的添加量分别为MgSO41-2g，CaCl20.5-1g，MgCl20-1g。
优选的酵母拮抗菌的专用培养基配方，每1000mL蒸馏水中含有下述物质柠檬酸20-60g，大豆蛋白胨10-30g，MgSO41-2g和CaCl20.5-1g。
更优选的酵母拮抗菌的专用培养基配方，每1000mL蒸馏水中含有下述物质柠檬酸40g，大豆蛋白胨15g，MgSO41.23g和CaCl20.56g。
本发明的另一个目的提供一种酵母拮抗菌的培养方法。
本发明所提供的酵母拮抗菌的培养方法，是按1-3％接种比例将酵母拮抗菌接种到上述酵母拮抗菌专用培养基中，在22-28℃下通气培养。所述接种比例优选为2％。
培养过程的通气量为60-100mM O2L-1h-1；培养24-72小时即可达到培养终点。优选的培养条件为温度为25℃，通气量为100mM O2L-1h-1，培养时间为24小时。
本发明提供了一种通过单因素实验法筛选出酵母拮抗菌C.laurentii的速效碳源和速效氮源，并在此基础上，通过正交实验得到酵母拮抗菌C.laurentii对主要无机盐成分的利用能力，得到的酵母拮抗菌的专用培养基。采用该培养基在120L发酵罐中对酵母拮抗菌C.laurentii大最佳培养条件下发酵培养，可得到活菌浓度数大于1×109CFU mL-1的菌悬液，具有扩大化生产的可行性。本发明将在酵母拮抗菌及其相关生物制品的工业化生产中发挥巨大作用。
图1为酵母拮抗菌C.laurentii在120L发酵罐中培养时生长动态的变化曲线具体实施方式
下述实施例中如无特别说明均为常规方法。
酵母拮抗菌的总菌数是在显微镜下采用血球计数板进行观察、统计。酵母拮抗菌活菌数采用用稀释平板法记数，即将稀释不同浓度梯度的菌液在NYDA上铺板，28℃培养48-72h后统计菌落个数。
实施例1、酵母拮抗菌C.laurentii专用培养基配方的优化一、酵母拮抗菌C.laurentii菌种的活化、保存与培养1、菌种的分离及保存从苹果果实表面分离获得酵母拮抗菌C.laurentii菌种，置于甘油中-20℃保存(刘海波，田世平，秦国政，徐勇.罗伦隐球酵母对葡萄采后病害的拮抗效果.中国农业科学，2002，35831-835.)。
2、菌种的活化从-20℃中保存的甘油管中吸取少量菌液，在NYDA培养基(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，琼脂18，单位gL-1)铺板并在28℃下培养，72h后取少量生长良好的酵母拮抗菌接种在NYDB培养基(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，单位gL-1)中进一步活化，铺板，并在NYDA培养基上分离单菌落。
3、菌种的培养挑取单菌落接入NYDB(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，单位gL-1)培养液中，振荡培养(25℃，200rpm)24h后，将培养液4000g离心10min，去掉上清液，沉淀中加入无菌水，混合均匀后再重复离心并去掉上清液，最后将沉淀用无菌水悬浮，用血球计数板配成浓度为1×107个/mL的接种液，用于下述试验。
二、酵母拮抗菌C.laurentii对不同碳源利用能力的鉴定及最佳碳源的筛选为筛选出最适于酵母拮抗菌利用的碳源，本试验首先考察酵母拮抗菌C.laurentii对葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、丙三醇、柠檬酸(钠)、麦芽提取物和可溶性淀粉等工业上常用的碳源原料的利用能力，供试碳源的浓度均为10g L-1，以不含氨基酸的酵母基础氮源(Yeast Nitrogen Base，YNB，Sigma，6.7gL-1)为氮源。将各种培养液的初始pH值调为5.5。每个处理设三个重复。
利用SPSS软件，通过ANOVA方式，采用邓肯式多重差异分析(Duncan’s multiplerange tests)对不同处理之间的差异性在P＜0.05水平上进行数据分析。结果如表1所示，表明当以蔗糖、乳糖和海藻糖为碳源时，酵母拮抗菌C.laurentii培养48h后菌体密度均超过了1×107CFU mL-1，其中对海藻糖的利用最好、乳糖次之、蔗糖最差。相比之下，酵母拮抗菌C.laurentii对单糖(果糖和葡萄糖)、非发酵型糖(丙三醇)和多糖的利用能力较差。但在所测试的所有碳源中，C.laurentii对柠檬酸的利用能力最强。因此，选择柠檬酸作为C.laurentii大量、快速培养的最优选的碳源。
表1 酵母拮抗菌C.laurentii对不同碳源的利用能力
注a时在同一列内，标有不同字母的处理表示采用Duncan多重差异性比较在P＜0.05的水平上具有显著性差异；b不生长指酵母浓度低于培养开始时的浓度；c对照指仅以YNB作为培养基。
三、酵母拮抗菌C.laurentii对不同氮源利用能力的鉴定及最佳氮源的筛选以步骤二筛选出的柠檬酸为碳源(10gL-1)，分别验证C.laurentii和R.glutinis对各种氮源的利用能力，实验选取了牛肉浸膏、酵母提取物、多价胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、肉蛋白胨、胰化蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钠等常用的工业微生物发酵氮源，所有供试氮源的浓度均为15gL-1。各种培养液的初始pH值均调为5.5左右。每个处理设三个重复。
利用SPSS软件，通过ANOVA方式，采用邓肯式多重差异分析(Duncan’s multiplerange tests)对不同处理之间的差异性在P＜0.05水平上进行数据分析。结果如表2所示，表明在八种有机氮源中，C.laurentii对大豆蛋白胨的利用能力最强，培养48h后，拮抗菌浓度达到2×108CFU mL-1。相比之下，以酵母提取物为氮源C.laurentii培养48h后浓度低于1×107CFU mL-1，而在尿素为氮源时C.laurentii不能生长，其它有机氮中的拮抗菌浓度则在3-5×107CFU mL-1之间。同时，C.laurentii不能利用两种无机氮源(硫酸铵和硝酸钠)。培养液的终止pH可明显反应出C.laurentii对各种氮源的利用能力能为拮抗菌有效利用的培养液终止pH均在8.0以上，而不被有效利用的酵母提取物和无机氮源，其培养液终止pH与初始pH(5.5)相比无明显变化。
由于酵母拮抗菌C.laurentii以大豆蛋白胨为氮源时的生长密度最大，因此，在下述试验中，将大豆蛋白胨作为C.laurentii大量快速培养的最适氮源。
表2 酵母拮抗菌C.laurentii对不同氮源的利用能力，
注a时在同一列内，标有不同字母的处理表示采用Duncan多重差异性比较在P＜0.05的水平上具有显著性差异，b不生长指酵母浓度低于培养开始时的浓度。
四、酵母拮抗菌C.laurentii对无机养分的筛选及最适培养基成分优化在筛选出最适碳源与最适氮源的基础上，设计了七因素、两水平的正交实验L8(27)，以进一步鉴定酵母拮抗菌C.laurentii对不同无机盐的需求，以及不同浓度的营养成分(碳源、氮源和无机盐)对酵母拮抗菌生长速度的影响，各实验因素及水平的设计如表3所示。每个处理三个重复，实验进行两次。
表3 C.laurentii培养基配方优化的正交实验L8(27)的因素与水平表
对利用正交实验进行最佳营养配方和培养条件优化的实验数据处理采用一般正交实验的统计分析方法进行(Montagomery，D C.Design and analysis of experiments，4thed.New YorkWiley，1996，pp 627-631)。直观分析结果如表4所示。根据极差(R)的大小，各培养基成分对酵母拮抗菌C.laurentii生长速度的影响程度排序为柠檬酸＞硫酸镁＞大豆蛋白胨＞氯化钙＞氯化钠＞磷酸氢二钾＞磷酸二氢钾，表明柠檬酸是影响C.laurentii生长的最关键因素。
方差分析的结果(表5)表明，增加柠檬酸含量，或添加硫酸镁、氯化钙均能提高C.laurentii的生长速度(P＜0.1)，其中柠檬酸和硫酸镁的影响达到了极显著水平(P＜0.01)。相反地，提高大豆蛋白胨浓度则能抑制C.laurentii的生长(P＜0.1)，而氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等无机盐的作用效果不显著。
通过上述分析，本试验确定大量、快速培养C.laurentii的最佳培养基成分为(g L-1)柠檬酸40，大豆蛋白胨15，硫酸镁1.23，氯化钙0.56。
表4 酵母拮抗菌C.laurentii养基成分优化的正交实验结果及直观分析表
aKiA＝∑菌体密度Ai.实验数据为三个重复实验的平均值bkiA＝KiA/2.实验数据为三个重复实验的平均值cRiA＝最大(kiA)-最小(kiA).实验数据为三个重复实验的平均值表5 酵母拮抗菌C.laurentii培养基成分优化的正交实验L8(27)方差分析结果
注NS表示不显著；*表示显著水平P＜0.1；**表示显著水平P＜0.01df＝1；F0.1＝39.9；F0.01＝405.0实施例2、酵母拮抗菌C.laurentii的发酵罐扩大培养将经过平板活化的酵母拮抗菌C.laurentii菌种，在500mL三角瓶中(含100mL培养液柠檬酸40，大豆蛋白胨15，硫酸镁1.23，氯化钙0.56(gL-1))，在25℃、200rpm下预培养12-18h后，以2％接种比例接种到120L发酵罐(BioFlo 5000，New Brunswick Scientific Co.Inc)中(含有80L培养液)进行扩大培养。在不同培养阶段取样铺板，观测酵母拮抗菌的生长动态。
酵母拮抗菌C.laurentii在120L发酵罐中培养时生长动态的变化曲线如图1所示，接种到发酵罐中后，C.laurentii不经过延滞期而直接进入对数生长期，培养24h后，细胞浓度达到1.44×109CFU mL-1，此后C.laurentii便生长停止并逐渐进入稳定期，培养液中溶氧量也随之迅速升高并保持稳定，90h后C.laurentii进入衰亡期。在120L发酵罐中拮抗菌C.laurentii采用上述最佳培养条件得到活菌浓度数大于1×109CFUmL-1的菌悬液，具有扩大化生产的可行性。
实施例3、酵母拮抗菌C.laurentii的发酵罐扩大培养将经过平板活化的酵母拮抗菌C.laurentii菌种，在500mL三角瓶中(含100mL培养液柠檬酸60，大豆蛋白胨30，硫酸镁1，氯化钙0.5(gL-1))，在25℃、200rpm下预培养12-18h后，以2％接种比例接种到120L发酵罐(BioFlo 5000，New BrunswickScientific Co.Inc)中(含有80L培养液)进行扩大培养。结果在120L发酵罐中拮抗菌C.laurentii采用适宜培养条件得到活菌浓度数大于1×109CFU mL-1的菌悬液，具有扩大化生产的可行性。
实施例4、酵母拮抗菌C.laurentii的发酵罐扩大培养将经过平板活化的酵母拮抗菌C.laurentii菌种，在500mL三角瓶中(含100mL培养液柠檬酸20，苹果酸10，葡萄糖10，大豆蛋白胨30，牛肉浸膏1，肉蛋白胨10，胰酶解蛋白胨10，CaCl21，MgCl21(gL-1))，在25℃、200rpm下预培养12-18h后，以2％接种比例接种到120L发酵罐(BioFlo 5000，New Brunswick ScientificCo.Inc)中(含有80L培养液)进行扩大培养。结果在120L发酵罐中拮抗菌C.laurentii采用适宜培养条件得到活菌浓度数大于1×109CFU mL-1的菌悬液，具有扩大化生产的可行性。
权利要求
1.一种酵母拮抗菌的专用培养基，其碳源选自下述物质中的一种或几种柠檬酸、苹果酸或/和葡萄糖；氮源选自下述物质中的一种或几种大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨；无机养分选自下述物质中的一种或几种MgSO4、CaCl2或/和MgCl2中的一种或几种，蒸馏水定容至1000mL。
2.根据权利要求1所述的酵母拮抗菌的专用培养基，其特征在于所述各种碳源的添加量分别为柠檬酸20-60g，苹果酸0-10g，葡萄糖0-10g；各种氮源的添加量分别为大豆蛋白胨10-30g，牛肉浸膏0-1g，肉蛋白胨0-10g，胰酶解蛋白胨0-10g；各种无机养分的添加量分别为MgSO41-2g，CaCl20.5-1g，MgCl20-1g。
3.根据权利要求1或2所述的酵母拮抗菌的专用培养基，其特征在于所述每1000mL蒸馏水中含有下述物质柠檬酸20-60g，大豆蛋白胨10-30g，MgSO41-2g和CaCl20.5-1g。
4.根据权利要求3所述的酵母拮抗菌的专用培养基，其特征在于所述每1000mL蒸馏水中含有下述物质柠檬酸40g，大豆蛋白胨15g，MgSO41.23g和CaCl20.56g。
5.一种酵母拮抗菌的培养方法，是按1-3％的比例将酵母拮抗菌接种到权利要求4所述的酵母拮抗菌专用培养基中，在22-28℃下通气培养。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于所述培养过程的通气量为60-100mM O2L-1h-1，培养时间为24-72小时。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于所述培养条件为温度为25℃，通气量为100mM O2L-1h-1，培养时间为24小时。
全文摘要
本发明公开了一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基。该培养基的碳源选自下述物质中的一种或几种柠檬酸、苹果酸或/和葡萄糖；氮源选自下述物质中的一种或几种大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨；无机养分选自下述物质中的一种或几种MgSO
文档编号C12N1/14GK1733897SQ20051009006
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月11日 优先权日2005年8月11日
发明者田世平, 王友升, 徐勇 申请人:中国科学院植物研究所