含pH081启动子的转化株及其应用的制作方法

专利名称：：含pH081启动子的转化株及其应用的制作方法这项发明涉及含有从酵母菌得到的启动子的新的DNA及其在遗传工程中的应用。随着DNA重组技术的广泛应用，利用无核或真核生物生产有用的多肽现已成为可能。迄今为止，大肠杆菌被用于大规模生产多肽，然而，希望应用真核生物来生产药理学上特别重要的多肽。酵母菌是一类真核微生物，与哺乳动物细胞有许多相似之处，因此用于编码哺乳动物蛋白质基因的表达是有利的。而且酵母菌在它们细胞中确不含内毒素，易于培养。酵母菌的培养过去一直在大的工业规模上进行，它的安全性是肯定无疑的。此外，已经进行了许多研究，去阐明它们遗传的生物学机制。围绕酵母菌的上述情况，都已导致它们作为宿主生物用于遗传工程中。目前已知有几种酵母菌基因克隆的载体。然而，对能有效地表达外源基因的酵母菌启动子还了解甚少。已知在一株啤酒酵母的溶胞产物中，存在有两种酸性磷酸酶和两种碱性磷酸酶。发现酸性磷酸酶在细胞的表面。其中一种酸性磷酸酶的产生受无机磷酸盐的抑制，而另一种酸性磷酸酶是通过结构改变产生的。一种碱性磷酸酶是一种阻遏酶，无机磷酸盐能抑制它的产生，而且有广泛的底物特异性。另一种碱性磷酸酶是一种特殊的对硝基苯磷酸酶，它的底物仅是对硝基苯磷酸盐，而且这个酶的产生是通过结构改变的。分离到了缺乏可阻抑的酸性磷酸酶活性的突变体Pho5、Pho4、Pho2和Pho81。PHO5基因是可阻抑的酸性磷酸酶的一种结构基因，而PHO4、PHO2和PHO81基因是产生蛋白质的基因，这种蛋白质能调节可阻抑的酸性磷酸酶结构基因PHO5的表达。进而PHO4和PHO81基因用来调节类似于PHO5可阻抑的碱性磷酸酶结构基因的表达。已经知道了酵母菌进行基因克隆的各种载体，现在都已可以应用。为了有效地表达天然或内源的基因，以及外来的或外源的基因，必须选择一种适合于所用宿主菌的有效的酵母菌启动子。图1是含有PHO81基因的DNA片段插入质粒PAC4的限制性内切酶图谱;图2是DNA片段及其根据本发明克隆的PHO81基因和PHO81启动子衍生物的限制性内切酶图谱及PHO81突变的互補能力的图示说明;图3是PHO81转录产物鉴定的说明;图4说明含有PHO81的克隆的DNA片段进行碱基序列分析的策略;图5表示PHO81基因启动子区域的核苷酸序列;图6是构建PAC430质粒的图解;图7是为了adr型肝炎B病毒表面抗原基因表达，构建重组DNA的图解;图8是构建lacz表达质粒的图解;图9表明含有PHO81基因的DNA序列。本发明注意到了PHO81基因的启动子(下文中称为PHO81启动子)，PHO81基因是表达酵母菌可阻抑的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶结构基因表达的一种调节基因。本发明者已经克隆了PHO81基因，测定了克隆DNA的限制性内切酶酶切图谱，并测定了它的启动子区域的核苷酸顺序。结果，发现该启动子是一种新的DNA，并适于有效地表达外源的和天然的基因。在以前研究的基础上作出了本发明。本发明提供了一种能调节磷酸酶产生的PHO81基因的启动子活性，并能从啤酒酵母得到的一种DNA;上述类型的一种重组合DNA;一种在PHO81启动子下游位置上带有编码产生可阻抑的磷酸酶的正调节因子结构基因或其它结构基因的DNA;含有调节磷酸酶产生的PHO81基因启动子活性的DNA，并能从啤酒酵母得到的一种转化子;含有上述PHO81启动子和PHO81启动子下游的结构基因DNA的转化子;基因产物生产的过程，包括在培养基中培养含有调节磷酸酶产生的PHO81基因启动子活性的DNA的转化子步骤，这一DNA可从啤酒酵母得到，并且带有位于该PHO81启动子下游的结构基因，因而，转化子生长伴随有基因产物的积累而从培养液中可以回收基因产物。具有PHO81基因启动子活性的上述DNA，最好是用磷酸来调节它的转录。有PHO81基因启动子活性的上述DNA最好是具有图9中位置Ⅰ和限制性内切酶酶切位点之间的碱基顺序的DNA。依据本发明，含有PHO81启动子以及编码产生可阻抑的磷酸酶的正调节因子结构基因(PHO81结构基因)的DNA，可以从酵母菌细胞中分离并收集到。任何菌株的啤酒酵母可以用于这一目的。尤为适用的菌株是一株属于酵母属的菌株，如啤酒酵母。商业上可以得到的面包酵母菌和啤酒酵母菌是适用酵母特有的实例。根据MethodsinCellBiology，12，13-14(1975)所述方法，从酵母菌中可有效地提取DNA。所提取的DNA用适当的限制性内切酶处理得到DNA片段。经如上相同的限制性内切酶处理或用能形成相同粘性末端的限制性内切酶酶切过的质粒或噬菌体，与这种DNA片段相连接，从而得到基因库。这种质粒可以是PBR322或大肠杆菌-酵母菌穿梭载体YEP13〔Gene，8，121，(1979)〕。噬菌体可用Charon噬菌体〔J.Virol，29，555，(1979)〕。如若需要，可用大肠杆菌-酵母菌穿梭载体YEp6进一步产生亚克隆(Gene，8，17(1979)〕。然后，用带有如此克隆过的DNA的载体去转化宿主菌株。宿主菌最好是酵母菌，特别是酵母属的菌株，最好是啤酒酵母种的菌株，啤酒酵母NA95-4B菌株更好。不过最好还是选择PHO81突变株作为宿主菌。菌株NA95-4B可用常规的杂交方法得到〔HandbookofGenetics，p366，PlenumPress，NewYork(1974)〕。即通过与菌株AL211-12B(MATa，PHO3-1，PHO8，arg6)〔Mol.Cell.Biol.，2，127(1982)〕，菌株AH22(MATa，leu2，his4，can1)〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕，菌株D13-1A(MATa，trpl，his3，gal2，SUC2)〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035(1979)〕，菌株YAT228(MATa，leu2，lys10，Cyh，Kar1-1)〔J.Bact-eriol.，145，1421(1981)〕和菌株W755-1C(MATa，PHO81，leu2，his3，his4)杂交而可以得到菌株NA95-4B。PHO81突变株用上述构建的基因库或亚克隆DNA进行转化，得到一株质粒，这株质粒含有PHO81启动子和编码产生可阻抑的磷酸酶调节因子的开放阅读框架的PHO81结构基因。能以任何已知方法进行这种转化，例如按照在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978);Nature，275，104(1978);ColdSpringHarborSymp.，Quant.Biol.，43，1305(1979)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035(1979)所述方法之一或其它类似方法进行。不管转化子是否含有PHO81启动子和产生可阻抑的磷酸酶调节因子的PHO81基因的密码区，都可用下面的方法测定。转化子培养在Rubin氏改进培养基中(C.M.Rubin，低磷酸的完全培养基)〔Eur.J.Biochem.，41，197(1974)〕形成菌落。然后在培养基上铺上一层含有α-磷酸萘酯和坚牢蓝盐B的琼脂层。如果克隆的DNA含有PHO81启动子和可阻抑的磷酸酶调节因子PHO81蛋白质密码区，则菌落变成红色，表示PHO81基因的存在。从含有PHO81基因的转化子中提取质粒，然后用一种限制性内切酶进行酶解。再将酶解液进行琼脂糖凝胶电泳或丙烯酰胺凝胶电泳，将有插入基因的DNA片段分开。这一系列操作在技术上已为大家所熟知，并在MolecularCloning(1982)ColdSpringHarborLaboratory中有详细的叙述。含有PHO81基因的DNA核苷酸顺序可用双脱氧核苷酸合成链末端终止法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)〕和Maxam-Gilbert法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，560(1970)〕等测定。通过检查缺失质粒和PHO81突变体(图2)的互补能力之间的关系可推测PHO81基因蛋白质密码区的位置。用带有猜想的PHO81基因的质粒(如图2中白色空框所表示的部分)作探针可检测PHO81的转录产物。从转录产物的大小和PHO81基因的碱基顺序就可估计出PHO81启动子的位置(图3，5和9)。然后测定认为含PHO81启动子区域的碱基顺序(图5)。核苷酸顺序测定指出开放阅读框架的存在。因此预期启动子位于开放阅读框架的上游。制备开放阅读框架上游和有PHO81启动子活性〔产生可阻抑的磷酸酶调节因子的能力，(见表1)〕部份的DNA(图7)。然后将PHO81启动子活性的部份和如果需要其下游的所要求的结构基因插入载体来制备表达载体(图8)。把表达载体导入一种适合的宿主微生物中，在培养后它能产生所预期的基因产物。带有PHO8-1启动子活性的DNA可部分地或全部地通过化学过程进行合成，这种合成或半合成的DNA可用于本发明的目的。插入PHO81启动子的载体可以是如前所述的穿梭载体YEp6，YEp13或质粒PSH19〔Mol.Cell.Biol.，4，104(1984)〕。或PJDB219〔Nature，275，104(1978)〕。PHO81启动子下游被插入的适当的结构基因的例证有编码可阻抑的酸性磷酸酶表达调节因子(PHO81)的调节基因，adw-型或adr-型肝炎B病毒表面抗原基因(HBSAg)，人类α-干扰素基因，人类β-干扰素基因，人类γ-干扰素基因，人类溶菌酶基因，人类间白血球溶菌素(interleukin)-2基因。用含有PHO81启动子的DNA转化的宿主菌以酵母为好，特别是酵母属的菌种，更可取的是啤酒酵母种的菌株，而更特殊的菌株如啤酒酵母AH22R-〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕或啤酒酵母NA95-4B(参看上文)。由此得到的转化子可以培养在任何已知的培养基中，如Burkholder基本培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4505(1980)〕。可通过测定培养条件如温度和时间，从而得到所期望的最大产量的基因产物。通常使用的培养温度大约在15-40℃，在24-37℃更好，而培养时间约10-96小时，24-72小时更好。如必要，可采用通气和搅拌培养。培养液中积聚的基因产物可用任何已知的方法进行提取，例如，用溶菌酶如查莫溶菌酶(Zymolyase)(SeikagakuKogyo，Ltd、Japan)溶解或裂解细胞，或使用玻璃株机械破碎的方法。去污剂如Triton-X100和蛋白质变性剂如盐酸胍可用来有效地提取产物。然后提取物用常规方法进行分离与纯化处理，如使用沉淀剂的沉淀、透析、电泳、离子交换树脂层析、凝胶过滤或用抗体柱等方法。依据本发明，提供了从真核生物酵母菌中得到一种新的有效的启动子。这种启动子对药理学上重要的蛋白质基因的有效表达非常有用。下述各例将更进一步阐明本发明。在例1中用作起始物的啤酒酵母P-28-24C以登记号IFO-10153保存在日本大阪发酵研究所，并以登记号ATCC60202保存在美国AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，转化子啤酒酵母P-28-24C永久保存在IFO和ATCC，任何需要者可免费获得。例8所示的转化子大肠杆菌DH1/PAC430以登记号IFO-14456保存在日本大阪发酵研究所，并自1958年8月9日起以登记号FERMP-8411保存在日本通产省，工业科学与技术厅，发酵研究所(FRI)，并根据布达佩斯协定保存号改为FERMBP-1089。例12所示转化子啤酒酵母AH22R-/PACZ403从1986年5月28起以登记号IFO-10207保存在日本大阪发酵研究所，并从1986年6月25日起根据布达佩斯协定以登记号FERMBP-1090保存在FRI。实例1PHO81基因的克隆(见图1)以常规方法从啤酒酵母P-28-24C(MATaPho3-1)(IFO10153，ATCC60202)获得的染色体DNA用限制性内切酶Sau3AI进行部份酶解。依据Nasmyth和Reed的方法〔K.A.Nasmyth和S.I.Reed，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，2119(1980)〕将Sau3AI酶切片段插入到酵母-大肠杆菌穿梭载体YEP13的BamHⅠ位点〔J.R.Broach等，Gene，8，121(1979)〕，制备出一个酵母菌基因库，它大约由2000个氨苄青霉素抗药性(Ampr)和四环素敏感(Tcs)表现型大肠杆菌的克隆组成。为了转化，将酵母菌基因库的质粒DNA导入啤酒酵母NA95-4B(MATαpho81leu2his3trp1can1)。以菌落染色法〔G.Dorn的改进方法Genet.Res.，6(1965)〕，用含α-磷酸萘酯0.5毫克/ml，坚牢蓝盐B5毫克/毫升和0.05摩尔醋酸缓冲液的1%琼脂溶液，去筛选显示出可阻抑的酸性磷酸酶活性(rACp+)的转化子。从大约8×103个亮氨酸原养型(Leu+)的转化子中得到5个rACP+转化子。按照Cameron等的方法〔J.R.Cameron等，NucleicAcidsRes.4，1429(1977)〕从这五株rACP+转化菌株中的一株制备质粒DNA，并将这种质粒DNA转化到大肠杆菌JA221中。35个Ampr转化子都是TCs，并具有相同分子量的质粒。这一质粒命名为pAC4，再将其导入啤酒酵母NA95-4B中进行转化。测试了所得到的18个Leu+转化子可阻抑的酸性磷酸酶产生的活性，它们都是rACp+。这表明了pAC4插入有一个含有PHO81基因的DNA片段。如果含有PHO81，那么依靠它的同源性可期望pAC4能整合到染色体的pho81座位点上。含有pAC4的一株啤酒酵母YAT408(leu2，lys10，can1，cir0)稳定的转化子进行了遗传分析来测定PAC4的整合位点。这样，含PAC4的转化子与啤酒酵母YAT637(MATapho81leu2)菌株杂交，进行了四分体分析。结果，四分体中Leu+Acp+和Leu-Acp-表现型的分离显示为4∶0，3∶1和2∶2。表现为4∶0，3∶1和2∶2分离的四分体数目分别是0，2和21。用含PAC4的转化子与啤酒酵母YAT61(MATaPHO81LEu2)进行第二次杂交。重组二倍体的四分体分析显示出，亮氨酸表现型分离为4+∶0-，3+∶1-和2+∶2-，其在四分体中的比例为2∶33∶4。前述的遗传资料可以得出结论，PAC4插入于PHO81基因位点上或其附近，即PHO81基因已被克隆到PAC4质粒中。实例2带有PHO81基因的DNA片段的限制性内切酶酶切图谱的制备PAC4DNA(1-5微克)用BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，PstⅠ，SalⅠ和XhoⅠ限制性内切酶的一种(4-6单位)或几种结合在TA缓冲液中(P.H.O′Farrel等，Molec.Gen.Genet.，179，421(1980)〕37℃酶解1小时。酶解产物在1%琼脂糖凝胶或7.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，从凝胶估计限制性内切酶酶切片段的分子量，以确定限制作用类型。然后，如图1所示，制备限制性内切酶的酶切图谱，其中以字母表示酶切位点如下EEcoRⅠHHindⅢSaSalⅠXXhoⅠPPstⅠBBamHⅠ实例3在克隆的DNA片段上PHO81基因位置的测定(见图2)为了测定PHO81基因在克隆的DNA片段上的位置，制备了PAC4的各种缺失衍生物。将PAC4(5微克)在含6单位BamHⅠ的50微升TA缓冲液中37℃酶解1分钟，然后再在65℃下酶解10分钟得到部分酶解的产物。取25微升酶解混合液与50微升含有5毫摩尔MgCl2，10毫摩尔二硫代苏糖醇、0.05毫摩尔ATP和3单位T4连接酶的T4连接酶反应液混合，在4℃放置18小时以重新连接上述的部分酶解产物。用T4连接酶反应液(10微升)转化大肠杆菌JA221。从这样得到的Ampr转化子中用Birnboim-Doly方法〔H.C.Birnboim和J.Doly，NucleicAcidsRes.，7，1513(1979)〕分离质粒DNA，从而得到缺失质粒PAC4-LB3。用上述相同方法，以SalⅠ和XhoⅠ酶代替BamHⅠ重复上述过程，分别得到缺失质粒PAC4-LS1和PAC4-LX1。进而，用上述方法以HindⅢ酶处理PAC4-LB3得到缺失质粒PAC4-LB3H。获得的每一种缺失质粒DNA用来转化啤酒酵母NA95-4B，并选择Leu+转化子。用10株这种转化菌株试验了它们与可阻抑的酸性磷酸酶(rACP+1)有关的表现型。PHO81突变体同各缺失质粒的互补测验结果在图2中以+和-表示。啤酒酵母NA95-4B用PAC4-LX1进行转化。重组合的Leu+转化子产rACP的活性低于野生型菌株(这种活性在图2中以+表示)。前述结果指出PHO81基因位于图2中白色方框所示的位置上(大约3.0kb)。实例4含有pAC4-LB3的转化子产生酸性磷酸酯酶的活性例3中获得含有PAC4-LB3的转化子啤酒酵母NA95-4B/PAC4-LB3，在5毫升Berkholder′s氏改进的高浓度磷酸培养基和低浓度磷酸培养基中〔A.Toh-e等，J.Bacteriol，113，727(1973)〕，振荡培养20小时。收集细胞，用Torriani的改进方法〔A.Torriani，Biochim.Biophys.Acta，38，460(1960)〕测定酸性磷酸酶活性。结果如表1所示。表1含有PAC4－LB3的转化子酸性磷酸梅产生的活性</tables>a)标出只与磷酸酶有关的基因型＊)单位/毫升/OD600.b)KH2PO4浓度为1.5毫克/毫升c)KH2PO4浓度为0.03毫克/毫升从表1可以知道，PAC4-LB3产生酸性磷酸酶受无机磷酸盐的抑制。因此，认为克隆的PHO81基因包含有编码调节PHO5表达的蛋白质(PHO81基因的产物)区域和启动子区域。实例5PHO81基因转录产物的鉴定PHO81的转录产物用Northern杂交方法进行鉴定。制备总的核糖核酸用Jansen方法〔R.Jensen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，3035.(1983)〕在完全培养基(+P)和低浓度磷酸培养基(-P)培养的啤酒酵母P-28-24C中进行，接着用Schleif和Wensink方法〔R.F.Schleif和P.C.Wensink，PracticalMethodsinMolecularBiology，(1981)，Springer-Verlag〕的寡聚dT-纤维素亲和柱层析，纯化得到多聚(A+)-RNA。获得的多聚(A+)-RNA样品如文献所描述的那样〔MolecularCloning，(1982)，ColdSpringHarborLaboratory〕进行甲醛凝胶电泳。接着用Thomas方法〔P.S.Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5201(1980)〕进行吸印和杂交。使用柯达(Kodak)X-O-matRP胶片和柯达增感屏在-80℃完成放射自显影。转录产物鉴定所用的DNA探针是由质粒pAC450的缺口翻译〔P.W.J.Rigby等，J.Mol.Biol.，Vol.113，237(1977)〕制备的，质粒PAC450是9.2kb左右克隆的酵母染色体DNA中BamHⅠ酶切点与YEp13的SalⅠ酶切点之间3.2kb左右的BamHⅠ-SalⅠ酶切片段，亚克隆到BamHⅠ-SalⅠ双酶酶解的PBR322中得到的。图3列出了这些结果。PHO81转录产物为2.8kb。PHO81转录产物的量远较编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶的URA3基因转录产物的量大〔酵母菌的分子生物学，lifecycleandinheritance，ColdSpringHarborLab，731(1981)〕，这一事实推测了PHO81启动子有强的活性。由于PHO81的转录在高磷酸盐环境中(+P)受到抑制，因此认为PHO81启动子受磷酸抑制。实例6带有PHO81基因的3.0kbDNA片段的限制性内切酶图谱的制作BamHⅠ位点和Sau3AⅠ/BamHⅠ位点(图2中以白色空框所示区域)之间含有PHO81基因的酶切片断的限制内切酶图谱用14种酶(AluⅠ，BanⅡ，BstNⅠ，DdeⅠ，EcoRⅠ，HaeⅢ，HindⅢ，HpaⅠ，HpaⅡ，RsaI，SalⅠ，Sau3AⅠ，Sau96Ⅰ和XhoⅠ)进行制作，如图4所示。用一种或两种酶结合酶解这个片段。混合物在7.5%或12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。从酶切模式测算酶切位点。PBR322的HaeⅢ或AluⅠ酶解产物作为分子量标准。图4仅标出已被肯定了的酶切位点。实例7带有PHO81基因的DNA碱基顺序的测定位于BamHⅠ和BamHⅠ/Sau3A位点之间认为带有PHO81基因的3.0kbDNA片段的碱基顺序，依据Maxam-Gilbert法(参看上文)进行测定，并示于图5。在核苷酸顺序中存在一个大约2.5kb的转译区。从这一结构中预期转录的方向是从BamHⅠ位点到BamHⅠ/Sau3A位点。转译起始密码子“ATG”存在于BamHⅠ位点下游约520碱基处。从“ATG”上游67bp(碱基对)处，存在着认为有TATA盒功能的TATTA序列。类似于帽子形成(Capping)位点的TCATCA序列存在于“ATG”上游的57bp处。进而在“ATG”上游的109bp处有-CCAAT序列。这一序列是与CCAAT盒序列〔NucleicAcidsRes.，10，2625-2637(1982);同上刊，12，857-872(1984);同上刊，12，1137-1148(1984)〕相同的。图5显示了BamHⅠ切点下游的700碱基区域的碱基顺序。PHO81基因5′-上游侧的非转译区域和PHO81基因5′-末端区域被认为包括在已阐明的区域中。实例8质粒pAC430的构建及其转化子的制备质粒PAC4-LB3(5微克)以例2所述方法用5单位的BamHⅠ和5单位SalⅠ酶解。酶解混合物在1%低溶点琼脂糖凝胶上进行电泳，发现了3.2kb的DNA片段。这个片段与经5单位BamHⅠ和5单位SalⅠ酶解过的PBR322(5微克)混合，混合物再以例2所述的相同方法用T4连接酶连接，获得质粒pAC430(见图6)。质粒pAC430引入大肠杆菌DH1进行转化，获得转化子大肠杆菌DH1/pAC430(IFO14456，FERMBP-1089)。实例9用PHO81启动子构建adw-型肝炎B病毒表面抗原P25基因表达质粒以及这种质粒转化酵母菌质粒pAC430(0.5微克)用1单位酶AccⅡ(日本基因公司制造)在20微升反应液〔6毫摩尔Tris-HCl(PH7.5)60毫摩尔NaCl，6毫摩尔MgCl2，6毫摩尔2-巯基乙醇〕中37℃酶解2小时，再用酚除去蛋白质，DNA用冷乙醇沉淀。沉淀的DNA与50毫微克5′端磷酸化的SalⅠ人工接头〔5′-P-d(GGTCGACC)〕(NewEnglandBiolabsInc制造)混合，混合物在含66毫摩尔Tris-HCl(PH7.6)，6.6毫摩尔MgCl2，10毫摩尔二硫代苏糖醇，1毫摩尔ATP和2单位T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabsInc.公司制造)的20微升反应液中14℃过夜，连接DNA。用上述连接反应液转化大肠杆菌DH1〔T.Maniatis等，MolecularCloning.ColdSpringHarborLaboratory，254-255页(1982)〕，选择氨苄青霉素抗药性转化子。从选出的转化子中得到SalⅠ位点取代质粒pAC430中ACCⅡ位点的质粒pAC430-1(见图7)。质粒pAC430-1(10微克)用10单位BamHⅠ和10单位SalⅠ(日本基因公司制造)在50微升反应液〔10毫摩尔Trs-HCl.(PH7.5)，7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，7毫摩尔2-巯基乙醇〕中，37℃酶解2小时。然后酶解物用1.2%平板琼脂糖凝胶在缓冲液〔100毫摩尔Tris-HCl100毫摩尔硼酸，2毫摩尔EDTA(PH8.3)〕中，140V电泳2小时。电泳后，将含0.5kbDNA片段区域的凝胶放于透析袋，浸入上述电泳缓冲液中。用电洗提法从凝胶中提出DNA〔M.W.McDonell等，J.Mol.Bio.，110，119(1977)〕。透析袋中的液体用酚提取，再用乙醚提取。提取后的水相用氯化钠调到0.2M。含PHO81启动子的DNA片段用2倍体积的冷乙醇沉淀。adw-型肝炎B病毒表面抗原(HBsAgP25)基因表达质粒pPHO17-58已公开于1984年9月13日申请的日本专利申请№59-193765说明书的实例中(这相当于欧洲专利公开№175283)，取pPHO17-58质粒50微克，用50单位XhoⅠ(日本基因公司制造)在100微升反应液〔10毫摩尔Tris-HCl，(PH7.5)，7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，7毫摩尔2-巯基乙醇〕中37℃部分酶解20分钟。用上述相同条件及板状琼脂糖凝胶，从酶解混合物中分离出9.1kbDNA片段，这一片段仅在质粒的两个XhoⅠ位点的一个位点上被酶解。而后，所得的9.1kbDNA片段(4微克)用4单位BamHⅠ在20微升的反应液〔6毫摩尔Tris-HCl(PH7.9)，150毫摩尔NaCl，6毫摩尔MgCl2〕中，37℃酶解2小时，接着在上述相同条件下进行电泳，从而分离出8.55kbDNA。8.55kbDNA(200毫微克)与含PHO81启动子的0.5kbDNA(20毫微克)用T4DNA连接酶进行连接反应。用这一重组合的混合物转化大肠杆菌DH1。从氨苄青霉素抗性的转化子中选出含质粒pPHO81-P25的转化子DH1/pPHO81-P25，在这pPHO81-P25质粒中，启动子PHO81以有意义方向作为HBsAgP25基因插入在其中。然后，从转化子分离出质粒PPHO81-P25(见图7)，并导入到啤酒酵母AH22R-菌株中，从而得到转化子AH22R-/pPHO81-P25。实例10应用PHO81启动子构建adr-型肝炎B病毒表面抗原P31的表达质粒及此质粒在酵母菌的转化adr-型肝炎B病毒表面抗原(HBsAgP31)基因表达质粒pPHO31-R公开于国际专利申请№PCT/JP84/423的实例3中(国际申请日期1984年9月4日)(它与欧洲专利公开№171908相同)。取该质粒(50微克)用50单位酶SalⅠ在100微升反应液中〔6毫摩尔Tris-HCl(PH7.9)，150毫摩尔NaCl，6毫摩尔MgCl2，6毫摩尔2-巯基乙醇〕，37℃酶解20分钟。从酶解物中用上述方法中的平板琼脂糖凝胶分出9.7kbDNA片段，它仅在质粒的两个SalⅠ酶切位点的一个位点上被酶解。这样回收的9.7kbDNA片段(4微克)用4单位BamHⅠ酶解，然后，在上述条件下电泳，从而分离出9.2kb的DNA。这9.2kbDNA(200毫微克)与含PHO81启动子的0.5kbDNA(20毫微克)用T4DNA连接酶连接。得到的混合物转化大肠杆菌DH1。从氨苄青霉素抗药性转化子中选出含质粒pPHO81-P31的转化子DH1/pPHO81-P31，在这一质粒中PHO81启动子作为HBsAgP31基因以正确的方向插入。然后从转化子中分离出质粒pPHO81-P31(见图7)，并引入宿主菌株啤酒酵母AH22R-中，获得转化子AH22R-/pPHO81-P31。实例11HBsAg基因在酵母菌中的表达含有HBsAg基因表达质粒并能在例9和10中得到的转化子，即啤酒酵母AH22R-/pPHO81-P25和AH22R-/pPHO81-P31，在Burkholder培养基及其低磷酸培养基中30℃培养2天。收集细胞，用生理盐水洗涤。然后依据宫野原的方法〔A.Miyanohara，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕用溶菌酶(Zymolyase)(日本SeikagakuKogyoCo.Ltd.)处理细胞，形成球形体。为了加快HBsAg的提取，加入0.1%TritonX-100后，溶菌产物在室温下以15000转/分离心15分钟。用奥斯酶Ⅱ(OrthzymeⅡ)(DynabotK.K.制造)试验上清液测试HBsAg的活性。实例12用PHO81启动子表达LacZ基因限制性内切酶ScaⅠ和SmaⅠ各10单位(日本TakaraShuzoCo.Ltd.制造)和10微克含PHO81基因(从图2中白色空框部分到YEp13的SalⅠ切点这一区域)的pAC430，在100微升反应液〔33毫摩尔Tris-醋酸(PH7.9)，66毫摩尔KAc，10毫摩尔Mg(Ac)2，5毫摩尔二硫代苏糖醇〕中，37℃酶解2小时。酶解液用4%聚丙烯酰胺凝胶在缓冲液中(89毫摩尔Tris89毫摩尔硼酸，2.5毫摩尔EDTA)150伏电泳3小时。电泳后，含2100碱基对DNA片段(ScaⅠ-SmaⅠ酶切片段)的凝胶部份放在一只Corex离心管中破坏凝胶，然后加入5毫升含0.5摩尔NH4Ac，10毫摩尔Mg(Ac)2，1毫摩尔EDTA，0.1%(W/V)十二烷基磺酸钠的DNA提取液。生成的混合物可在37℃下放置过夜并过滤。加乙醇到滤液中沉淀DNA片段，进行回收，以便用于下述的连接反应。质粒pMC1587(1微克)用1单位SmaⅠ(TakaraShuzoCo.Ltd.制造)在50微升反应混合液(1毫摩尔Tris，10毫摩尔NaCl.0.6毫摩尔MgCl2)中37℃酶解2小时。DNA的酶切片段用乙醇沉淀，回收。pMC1587用SmaⅠ酶切得到的上述DNA片段(0.1微克)与2100碱基对的ScaⅠ-SmaⅠ片段(5微克)用T4DNA连接酶连接，产生质粒pACZ403(图8)。如此获得的质粒中，位于2100碱基对的ScaⅠ-SmaⅠDNA片段中PHO81转译顺序部分位于pMC1587中的lacz转译顺序，在SmaⅠ连接位点上连接起来，而两个基因的阅读框架得到了调整。由此获得的质粒PACZ403被引入啤酒酵母AH22R-中，得到转化子啤酒酵母AH22R-/pACZ403(IFO-10207，FERMBP-1090)。这一转化子用实例11所述的同样方法培养20小时，并用实例11中所述的相同方法处理细胞，得下列结果β-半乳糖苷酶的表达单位/升含高浓度磷酸的培养基600(KH2PO4，1.5克/升)含低浓度磷酸的培养基2600(KH2PO4，0.3克/升)实例13PHO81基因的序列测定含有PHO81基因的BamHⅠ-BanⅡ片段(大约2.6kb)的DNA序列，按照例7所述的Maxam-Gilbert法进行测定，示于图9。这一碱基序列中约在2330碱基对的区域存在一个“终止密码子”。权利要求1.制备含有DNA的转化株的方法，该方法包括用含有PH081基因启动子活性的DNA的质粒转化酵母，该基因系表达酵母的可阻遏的酸性和碱性磷酸酶结构基因的调节基因，所述DNA可从啤酒酵母(Saccharomycescerevisia)p-28-24C(ATCCNo.60202或IFO10153)得到并含有下列碱基顺序或其选自BamHⅠ，HaeⅢ，RsaⅠ，XhoⅠ，BstNⅠ，AccⅡ和Sau3AⅠ中两个限制酶酶切位点之间的部分顺序-500TCCCAACGAAATTGATGGGTTTAATAAATGGACGCCCATTTTTTACGCTGAGGGTTGCTTTAACTACCCAAATTATTTACCTGCGGGTAAAAAATGCGAC-450TTCGTTCAGGTCATTCTGAAGTTATTACTGAATTATTGAAACATAATGCAAAGCAAGTCCAGTAAGACTTCAATAATGACTTAATAACTTTGTATTACGT-400BaeIIICGTCTGGATATTGAAGATGACAACGGCCATTCGCCACTTTTTTACGCCTTGCAGACCTATAACTTCTACTGTTGCCGGTAAGCGGTGAAAAAATGCGGAA-350ATGGGAGGACCACGTTGATGTTTTGAATGCACTTTTACAAGAACCATTAATACCCTCCTGGTGCAACTACAAAACTTACGTGAAAATGTTCTTGGTAATT-300RscⅠATTTGCCACCGCACCCCGAATGAAATGAATTCGCAGTCTAGTACGCAACGTAAACGGTGGCGTGGGGCTTACTTTACTTAAGCGTCAGATCATGCGTTGC-250CCTTAATACAATAGATTTAACCCCAAATGATGACAAATTTGATTTAGACAGGAATTATGTTATCTAAATTGGGGTTTACTACTGTTTAAACTAAATCTGT-200TTCAAGATAGCATTCCGGATTTTGCTTTACCACCACCGCCAATCATTCCACTAAAGTTCTATCGTAAGGCCTAAAACGAAATGGTGGCGGTTAGTAAGGTGAT-150AGGAAATATGGTCATAATTTTTTGGAGAAAAAATTTTCATCAAATTAAATCCTTTATACCAGTATTAAAAAACCTCTTTTTTTAAAAGTAGTTTAATTT-100XncIGTTAAGGCCAGGTCTCGAGTCTATCAAGTTGATTTAGGATAACGGCATTACAATTCCGGTCCAGAGCTCAGATAGTTCAACTAAATCCTATTGCCGTAATCappingTTATGTCATCACCAGGCAGAATTACTTTATCCTCTAACTTACCTGAAAATACAGTAGTAGTGGTCCGTCTTAATGAAATAGGAGATTGAATGGACTTAccII-l+lATAATACCGCGAAATGTTATTTTACCTGTTAGATTTGGCGAAATTAATAATATTATGGCGCTTTACAATAAAATGGACAATCTAAACCGCTTTAATTATT+50CTTTTGTAGATATCAGTGAAACGAATGATGAAGAAGATGATGATGAAATTGAAAACATCTATAGTCACTTTGCTTACTACTTCTTCTACTACTACTTTAA+100AGTGAAGATCATGATGATGGAGAGATAATTTTCCAAGTAGATTCAATCGATCACTTCTAGTACTACTACCTCTCTATTAAAAGGTTCATCTAAGTTAGCT+150CGATTTTTCAATGGATTTCGAGATATTTCCTTCATTTGGCACAAGGAGCTAAAAAGTTACCTAAAGCTCTATAAAGGAAGTAAACCGTGTTCCT2.按权利要求1的方法，包括用质粒pPH081-p25转化啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH22-，得到啤酒酵母转化株AH22R-/pPH081-p25。3.按权利要求1的方法，包括用质粒pOH081-p31转化啤酒酵母AH22R，得到啤酒酵母转化株AH22R-/pPH081-p31。4.按权利要求1的方法，包括用质粒pACZ-403转化啤酒酵母AH22R，得到啤酒酵母转化株AH22R-/pACZ403(CCTCCNo.86099;FERMBP-1090)。5.制备adw-型乙型肝炎病毒表面抗原p25基因的方法，该方法包括下列步骤-在Burkholder氏培养基中培养含有权利要求1的DNA和位于所述PH081启动子下游的adw型乙型肝炎表面抗原p25结构基因的啤酒酵母转化株AH22R-/pPH081-p25，使该转化株进行生长，同时积累基因产物;-从该培养物中提取基因产物。6.制备adw型乙型肝炎病毒表面抗原p31基因的方法，该方法包括下列步骤-在Burkholder培养基中培养含有权利要求1的DNA和位于所述PH081启动子下游的adw型乙型肝炎病毒表面抗原p31的结构基因的啤酒酵母转化株AH22R-/pPH081-p31，使该转化株生长，同时积累基因产物;-从该培养物中提取基因产物。7.制备lacZ基因的方法，该方法包括下列步骤-在Burkholder培养基中培养含有权利要求1的DNA和位于所述PH081启动子下游区的lacZ结构基因的啤酒酵母转化株AH22R-/pACZ403(CCTCCNo.86099;FERMBP-1090)，使转化株生长，同时积累基因产物;-从该培养物中提取基因产物。全文摘要本发明涉及有调节磷酸酶产生的pH081基因启动子活性的DNA，这种DNA是从啤酒酵母得到的；具有上述pH081启动子下游的结构基因的DNA；含有上述pH081启动子DNA的转化子；含有上述pH081启动子DNA和pH081启动子下游的结构基因的转化子；获得基因产物的过程，它包括在适合的培养基中培养含有上述pH081启动子和位于其下游的结构基因的DNA的转化子，直到形成基因产物和从培养物中回收基因产物。应用从真核微生物酵母得到的上述新的和有效的启动子，可以有效地生产药理学上重要的蛋白质类物质。文档编号C07K14/02GK1051933SQ9010813公开日1991年6月5日申请日期1986年8月20日优先权日1985年8月20日发明者大泰治,荒木弘之,金子嘉信申请人:武田药品工业株式会社