一种植物花粉特异性启动子pchf32及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种植物花粉特异性启动子PCHF32 及其应用。
【背景技术】
[0002] 在基因的结构与功能研宄中，转录水平的调控是一个关键步骤，基因转录起始是 一系列反式作用因子和转录位点共同作用的结果。编码蛋白质的基因包含启动子和编码 区，启动子一般位于编码区上游，是反式作用因子的结合位点，有两个主要区域：核心启动 子区域和转录调控区域。核心启动子是转录起始的最短启动子片段，一般为40nt，包含核 心启动子元件，是一段被RNA聚合酶家族I、II和III识别和结合的DNA序列。转录调控 区域位于核心启动子的上游（或下游），可与特异的转录因子相结合从而对转录的时空、强 弱起调控作用，如增强子和沉默子等。启动子具有如下特征：1)序列特异性。启动子含有 保守的序列框，序列框中碱基的变化会影响转录水平。2)方向特异性。启动子是一种有方 向性的顺式调控因子，分单向启动子和双向启动子两类。3)位置特异性。启动子一般位于 基因编码区或功能区的上游。4)种属特异性。不同物种具有不同类型的启动子。5)功能 特异性。不同组织和不同生化途径具有不同类型的启动子。核心启动子经典保守序列有 以下四种：1)转录起始位点（initiator, Inr)。通常位于翻译起始密码子（AUG)上游-40 到-70bp处。转录起始位点并无十分严格的同源顺序，常见的保守序列是处于+1的A和+3 的T。TFIID和TFII-I等转录因子可识别转录起始位点并启动转录。2) TATA box。是核心 元件，是RNA聚合酶II的识别位点，也是与一些反式作用因子结合的位点之一。植物启动 子的TATA box -般位于转录起始点上游32±7bp处，其保守序列为5'T37C42A38C 47T96A97T9QA94 T53A95T63A71G413'。TATA box通过与转录因子TFIID的识别结合而决定RNA聚合酶起始转录的 位点，形成前转录复合物并起动转录。TATA box还决定转录的方向以及介导上下游元件对 转录的调控作用。3)CAAT box，是一种增强转录的元件。一般位于转录起始点的-75bp附 近，其保守序列为GGC/TCAATCT。CAAT box与控制转录起始频率有关。4) GC box，通常位于 转录起始点的_90bp附近，其保守序列为GGGCGG，可有多个拷贝，须与转录因子SPl互作才 能促进基因转录。
[0003] 启动子按其表达方式可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启 动子。组成型启动子在生物体各个发育时期和所有的组织中都启动基因表达，具有时空持 续性和表达量恒定性。大多数组成型启动子中存在六聚体TGACTG，位于转录起始位点上游 IOObp左右，并往往重复出现。诱导型启动子能在某些物理或化学信号的诱导下启动基因表 达，或可以大幅度地提高基因的转录水平。它们具增强子、沉默子或类似功能的序列结构， 并有明显的专一性。一部分诱导型启动子同时具组织特异性，该类启动子常以诱导信号命 名，如光诱导启动子、热诱导启动子、低温诱导启动子、干旱诱导启动子、创伤诱导启动子、 激素诱导启动子等。组织特异性表达启动子只在某种细胞、组织或者器官中启动基因表达。 其结构上通常存在组织特异性增强子和沉默子，因而调控基因在特定的组织或器官中的转 录水平。这些启动子还往往表现出化学物理信号诱导性，还受到组织细胞生理状态以及发 育阶段的影响。这种类型的启动子有根特异性启动子、维管束特异性启动子、茎杆和叶片特 异性启动子、花特异性启动子、种子和果实特异性启动子等。
[0004] 随着大量DNA序列的积累和各种基因数据库的建立，有关启动子的预测及鉴定 和分析的计算机软件和网站也相继产生，如GENESCAN(http://genes. mit. edu/GENSCAN. html)，GENEFINDER(http://rulai.cshl.edu/tools/genefinder/)，PROMOTER SCAN(ver I. 7http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/proscan), TESS(http://searchlauncher, bcm. tmc. edu/seq-search/gene-search. html), Match (http://www.generegulation. com/ cgi-bin/pub/programs/match/match. cgi)，AliBata 2. I (http://www. gene-regulation. com/pub/programs/alibaba2/index, html), ppdb(plant promoter database, http:// www.ppdb.gene.nagoya_u.ac.jp)以及 PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/ signalscan.html)等。启动子克隆的方法也很多，其中PCR是很常用的手段，如环状PCR包 括 I-PCRQnverse PCR)、P-PCR(panhandle PCR)，TAIL-PCR 和反向 PCR 等。目前，许多植物 启动子已被克隆，并已申请了专利保护。但在水稻花粉特异启动子方面，所见报道不多。
[0005] 水稻是我国的民族产业，研宄水稻开花机理意义重大。水稻的花粉形成发生在雄 蕊中的花药中，花药含有生殖细胞，这些生殖细胞形成绒毡层和花粉母细胞。绒毡层为雄配 子体的发育提供营养，包括各种酶类和非酶类蛋白质，并参与花粉外壁的合成。花粉母细胞 则进行减数分裂，产生四分体。四分体中的单细胞经绒毡层分泌胼胝酶的作用分离产生单 倍体小孢子体。单倍体小孢子体进一步发育，到晚期时形成中央大液泡。中央大液泡将细 胞核排挤到细胞边缘（称为单核靠边期），形成细胞极性。这种细胞极性的促进小孢子体进 行一次不等有丝分裂，产生一个大的营养核和一个小的生殖细胞。小的生殖细胞被完全包 含在大的营养细胞内，形成细胞中细胞的特异现象。生殖细胞将进行第二次有丝分裂，产生 两个精细胞，形成成熟的花粉粒。我们利用公共DND序列和基因表达数据，找到了水稻花器 特异表达基因，并通过DNA序列分析，得到了启动子区域，其中一些基因经过RT-PCR和转基 因验证后，确定为水稻花粉特异启动子。这些启动子为水稻的基因工程，特别是在控制育性 和转基因漂移等方面提供了新的选择。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种植物花粉特异性启动子及其应用。
[0007] 本发明提供的一种植物花粉特异性启动子PCHF32,其为具有：
[0008] 1)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，
[0009] 或2)在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸 且具有同等花粉特异性启动功能的由1)衍生的核苷酸序列。
[0010] 其中，2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，与1)所述的核苷酸序列为与1)相比具 有70%以上同源性，且具有同等花粉特异性启动子功能的核苷酸序列。2)所述的由1)衍 生的核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 1自第1500位至第2038位所示的核苷酸序列，已被验证 具有与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列同等的花粉特异性启动子功能。
[0011] 本发明提供含有本发明所述植物花粉特异性启动子PCHF32的重组表达载体。本 发明提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞。
[0012] 本发明还提供与植物花粉特异性启动子PCHF32核苷酸序列互补的DNA分子。本 领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与植物花粉特异性启动子PCHF32核苷 酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其 片段杂交的分离序列包括在本发明中。
[0013] 其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与PCHF32杂交。
[0014] 严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交（如至 少2倍于背景）的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交 和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶序列（同源探测）。可选择地， 可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性（异源探测）。通 常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。
[0015] 典型地，严格条件是在pH值7