构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及构建基因突变 测序文库的引物和方法以及试剂盒。 技术背景
[0002] 基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。常见的基因突变 有体细胞突变和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP) 〇
[0003] 体细胞突变是发生在正常机体细胞中的突变，比如发生在皮肤或器官中的突变。 近年来，癌症基因组的研宄发现，癌变过程中与之相关的体细胞突变位点有成千上万处。但 是，目前癌症的诊疗却往往会忽视这一点。临床上的治疗策略主要针对数目占优的突变体 细胞。以治疗乳腺癌的单抗药物赫赛汀（Herceptin)为例，它的作用靶点是癌细胞过度表 达的HER2基因。倘若患者体内的癌细胞中，存在不含HER2基因亚克隆，即便赫赛汀使用之 初有效，随着此种癌细胞进化、增殖，同样会导致癌症恶化或复发。这也就解释了，为什么相 同的治疗方案，面对不同的患者会有不同的疗效。治愈的癌症患者又存在病情复发的可能。 目前与肿瘤的发生、发展或药物疗效相关的体细胞突变主要有：AKT1、AKT3、APC、ATM、BARF、 CDHl、CDKN2A、CTNNBI、EGFR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FLT3、HER2、HRAS、IDHl、IDH2、KIT、KRAS、 MEKl、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R5、PTEN、PTPNl 1、RBl、STKll、TP53、TSCl、 VHL 等。
[0004] SNP在人群中的发生频率大于1%，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或 缺失等表现形式。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上， 是人种之间、个体之间差异的遗传物质基础之一。SNP作为一种遗传标记得到广泛应用，主 要源于以下几个特性：（1)密度高：SNP在人类基因组平均密度估计为500~lOOObp，在整 个基因组的分布达300万个以上，遗传距离为2~3cm，其密度比微卫星标记高出几个数量 级，可以在任何待研宄基因的内部或附近提供一系列标记。（2)代表性：某些SNP可能在转 录、翻译、拼接以及RNA稳定性等方面发挥重要作用，而某些位于基因内部的SNP有可能直 接影响蛋白质结构或者表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机制中的某些作用因素。（3) 遗传稳定性：SNP来源于数千年前发生的突变，随着人类世代繁衍稳定地遗传至今，和微卫 星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性。具备以上优点，SNP被认为是继 第一代限制性片断长度多态性和第二代微卫星多态性之后的第三代分子遗传标记。目前与 肿瘤的发生、发展相关的 SNP 主要有：CYP2D6、DPYD、TYMS、UGT1A1、VEGFA、VEGFR2、VEGFR3、 CYP3A5、TPMT、MTHFR、GSTP1、ERCC1、ERCC2 以及 XRCCl 等。
[0005] 目前已有多种方法可用于基因突变检测，如测序法、DHPLC法、ARMS法、生物芯片 等。其中第一代测序技术、ARMS、DHPLC等方法无法实现多个靶标基因并行检测而只能分 开多次进行，从而导致使用样本量成倍递增、增加系统误差、检测过程耗时且费用昂贵等问 题，使其难以实现规模化。液相芯片检测方法虽然能实现多个基因的并行检测，但是对未知 的突变位点具有一定的局限性。
[0006] 多基因并行检测，不仅增加效率，降低费用，其更为重要的作用是提高检测敏感度 和临床敏感度，对基因突变的检测对肿瘤的早筛以及临床个体化治疗有着重要的指导意 义。目前，基于多重PCR的多基因并行检测，未能很好解决以下问题：引物内部形成发卡结 构或二聚体等二级结构；所设计的引物之间存在非特异性结合，与DNA标签组合形成的标 签引物之间形成二聚体、存在错配、与PCR产物之间均存在非特异性结合等。
[0007] 第二代测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，用不同 颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放 出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的 序列信息。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在临床和科学 研宄方面都有着广泛的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一是提供一种PCR引物，该PCR引物可与DNA标签连接构成标签 扩增引物，通过PCR扩增使PCR产物带上相应的DNA标签，并通过将多个不同样品来源的带 有不同DNA标签的PCR产物混合成一个文库，从而实现高通量测序。
[0009] 实现上述目的的技术方案如下。
[0010] 一种PCR引物，选自于以下至少一对针对目标基因突变位点设计的引物序列：针 对AKTl基因的SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2,针对AKT3基因的SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4， 针对APC基因的 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8,针对 ATM基因 的 SEQ ID N0:9和 SEQ ID N0:10,针对BRAF基因的 SEQ ID N0:11 和 SEQ ID N0:12，SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14,针对 CDHl 基因的 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16,针对 CDKN2A 基 因的 SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18,针对 CTNNBl 基因的 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20， 针对 CYP2D6 基因的 SEQ ID NO: 21 和 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24,针对 CYP3A5 基因的 SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26,针对 DPYD 基因的 SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28,针对 EGFR 基因的 SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 30,针对 ERCCl 基因的 SEQ ID NO: 31 和 SEQ ID NO: 32,针对 ERCC2 基因的 SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 34,针对 FGFRl 基因的 SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 36,针对 FGFR2 基因的 SEQ ID NO: 37 和 SEQ ID NO: 38,针对 FGFR3 基因的 SEQ ID NO: 39 和 SEQ ID NO:40,针对 FLT3 基因的 SEQ ID NO:41 和 SEQ ID N0:42,针对GSTPl基因的SEQ ID N0:43和SEQ ID N0:44,针对HER2基因的SEQ ID N0:45和 SEQ ID NO: 46,针对 HRAS 基因的 SEQ ID NO: 47 和 SEQ ID NO: 48,针对 IDHl 基因的 SEQ ID NO: 49 和 SEQ ID NO: 50,针对 IDH2 基因的 SEQ ID NO: 51 和 SEQ ID NO: 52,针对 KIT 基因的 SEQ ID NO: 53 和 SEQ ID NO: 54,针对 KRAS 基因的 SEQ ID NO: 55 和 SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58,针对 MEKl 基因的 SEQ ID NO: 59 和 SEQ ID NO: 60,针对 MET 基因的 SEQ ID NO: 61 和 SEQ ID NO: 62,针对MTHFR基因的 SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:66,针对 NRAS 基因的 SEQ ID NO:67 和 SEQ ID NO:68,针对 PDGFRA 基 因的 SEQ ID NO:69 和 SEQ ID NO: 70,针对 PIK3CA 基因的 SEQ ID NO: 71 和 SEQ ID NO: 72， 针对 PIK3R1 基因的 SEQ ID NO: 73 和 SEQ ID NO: 74,针对 PIK3R5 基因的 SEQ ID NO: 75 和 SEQ ID NO: 76,针对 PTEN 基因的 SEQ ID NO: 77 和 SEQ ID NO: 78,针对 PTPNll 基因的 SEQ ID N0:79 和 SEQ ID N0:80,针对 RBl 基因的 SEQ ID N0:81 和 SEQ ID N0:82,针对 STKll 基 因的 SEQ ID NO: 83 和 SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 和 SEQ ID NO: 86,针对 TP53 基因的 SEQ ID NO: 87 和 SEQ ID NO: 88,针对 TPMT 基因的 SEQ ID NO: 89 和 SEQ ID NO: 90,针对 TSCl 基 因的 SEQ ID NO: 91 和 SEQ ID NO: 92,针对 TYMS 基因的 SEQ ID NO: 93 和 SEQ ID NO: 94,针 对 UGTlAl 基因的 SEQ ID NO: 95 和 SEQ ID NO: 96,针对 VEGFA 基因的 SEQ ID NO: 97 和 SEQ ID NO:98,针对 VEGFR2基因的 SEQ ID NO:99 和 SEQ ID NO: 100,针对 VEGFR3基因的 SEQ ID NO: 101 和 SEQ ID NO: 102,针对 VHL 基因的 SEQ ID NO: 103 和 SEQ ID NO: 104,针对 XRCCl 基因的 SEQ ID NO: 105 和 SEQ ID NO: 106。
[0011] 本发明的另一目的是提供一种标签PCR引物。
[0012] 具体技术方案如下。
[0013] 一种标签PCR引物，由上述PCR引物以及连接于每对引物中至少一条引物5'端的 DNA标签序列组成，所述DNA标签序列选自SE