一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记 及其应用。
【背景技术】
[0002] 大葱（Allium fistulosum L.)是起源于中国的一种蔬菜作物，在中国、日本、韩国 等国家广泛栽培。大葱是非常重要的香辛类蔬菜，是中国人日常生活中必不可少的蔬菜和 调味品，其味辛、性温、生食或熟食皆宜，具有开胃消食、抗癌、抗肿瘤、保护心血管、降血压、 提高人体免疫力和防止衰老等保健功能。然而，我国种植的大葱品种则以章丘大葱等地方 品种以及日本进口品种为主。现有品种不能满足生产的需要，并存在着进口种子价格昂贵 的问题。因此，我们必须培育出具有我国自主知识产权的大葱杂交种。
[0003] 利用雄性不育特性培育和生产杂交种是保持品种特性、保证种子质量、降低种子 成本最为有效的技术措施，因此蔬菜作物雄性不育的研宄无论是在应用基础还是基础理论 研宄都是非常重要的热点。由于大葱是两年生蔬菜，传统方式选育大葱雄性不育系与保持 系，具有费时、费工、效率低的问题，利用常规育种与分子标记辅助育种相结合能够有效地 解决育种年限长，选择效率低的关键性环节。大葱雄性不育属于核质互作，只有细胞质和细 胞核均不育时，才能表现为不育。大葱不育基因型只有一种，即S (SmlSmlsm2Sm2)，而可育基 因型很多，我们只选择基因型为N( SmlSmlsm2Sm2)的大葱植株作为保持系。选择具有N型 细胞质的大葱植株进行下一步的测交等试验，缩小筛选群体范围，减小工作量，提高选择效 率。
[0004] 在大葱细胞质雄性不育分子标记研宄方面，已有相关报道。盖树鹏等以章丘大葱 不育系与保持系为材料，对细胞质线粒体DNA进行了 RAro标记，获得了两个能够鉴定部分 大葱品种细胞质类型的RAH)标记（盖树鹏，孟祥栋，徐丽娟.2004.大葱雄性不育分子标记 辅助选择的研宄.分子植物育种，2 :223 - 228.;盖树鹏，孟祥栋.2004.大葱胞质雄性不育 位点RAH)标记转化为SCAR标记的研宄.莱阳农学院学报，21 :189 - 192 ;WANG，C.，LI, H. Y. , ZHANG, L. Y. , PEI, Υ. X. and WANG, Y. Q. 2013. Identification of an AFLP marker and conversion to a SCAR marker to identify cytoplasmic male-sterile or normal cytoplasm in Welsh onion(Allium fistulosum L). Journal of Horticultural Scienc e&Biotechnology, 88, 409 - 414.)。然而该标记是以线粒体DNA为材料，由于线粒体DNA的 提取比较复杂，因此在实际应用上受到一定的限制。后来，本课题组开发了以大葱总DNA为 模板SCAR分子标记（高莉敏，董飞，霍雨猛，刘冰江，缪军，陈运起*，大葱细胞质雄性不育 基因的SCAR标记开发，园艺学报，第40卷，第7期，1382-1388页，2013 ;高莉敏，陈运起，董 飞，孔素萍，一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用，中国，ZL201210348974.X)， 这些标记的开发与应用有效的避免了保持系筛选的盲目性，提高了选择效率。但是，这些标 记均为大葱细胞质雄性不育S型细胞质的特异标记，在N型可育细胞质上没有扩增条带，致 使在应用时有一定的局限性。后来，本课题组开发了鉴定大葱细胞质S和N的SCAR标记 (Li Min Gao, Yun Qi Chen, Yu Meng Huo, Fei Dong, Yan Yan Yang, Su Ping Kong, Wei Chen and Xiong Wu*Development of SCAR markers to distinguish male-sterile and normal cytoplasm in bunching onion(Allium fistulosum L.), Journal of Horticultural Sci ence&Biotechnology, 2015, 90 (I) : 57-62.)，此标记能够在N型细胞质上扩增出1412bp片 段，S型细胞质上扩增出327bp片段。但是，此标记在每个样本中只扩增出一条带，在鉴定 细胞质类型时，如果没有点Marker，就无从知道扩增出来的单一条带是1412bp还是327bp， 也无法判断是S型细胞质还是N型细胞质。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记及其应用，可用于 辅助选育大葱雄性不育系和配套保持系，能够方便、快捷、准确的鉴定出细胞质的类型。
[0006] 本发明一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记，用于扩增所述标记的引物的核苷 酸序列如序列表中SEQ No. 1和SEQ No. 2所示。所扩增的标记片段在S型细胞质大葱中 为201bp，序列如SEQ No. 3所示；在N型细胞质大葱中为201bp，序列如SEQ No. 3所示；和 172bp，序列如SEQ No. 4所示。
[0007] 本发明还提供一种利用上述标记进行大葱细胞质育性检测的方法，检测步骤包 括：
[0008] a.提取被检测大葱的总DNA ;
[0009] b.以被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物，PCR扩增 反应引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No. 1和SEQ No. 2所示；
[0010] C.对PCR扩增产物用限制性内切酶MseI进行酶切；
[0011] d.判断所述的酶切产物中条带数量，是一条带还是两条带，即可分辨大葱的细胞 质类型。
[0012] 上述b步骤中PCR扩增反应的体系为20 μ 1，包括有：
[0013] 2 X Pfu MasterMix 10 μ 1
[0014] 核苷酸序列如序列表中SEQ No. 1所示的上游引物：1 μ 1
[0015] 核苷酸序列如序列表中SEQ No. 2所示的下游引物：1 μ 1
[0016] 待检测样品DNA50ng
[0017] CldH2O 补至 20 μ 1。
[0018] PCR扩增反应的程序为：94°C预变性2min，94°C变性30s，58°C退火lmin，72°C延伸 3min，35 个循环；72°C延伸 10min，4°C保存。
[0019] 上述c步骤中酶切反应的体系为30 μ 1，包括有：
[0020] IOXFastDigest Buffer 2μ1
[0021] FastDigest enzyme 1 μ I
[0022] PCR 反应产物 10 μ I
[0023] ddH20 补至 30 μ I ;
[0024] 酶切反应条件为37°C孵化Ih。
[0025] 进一步，本发明还提供一种用于鉴定大葱细胞质育性的试剂盒，包括含有核苷酸 序列如序列表中SEQ No. 1和SEQ No. 2所示的引物，及PCR扩增、酶切反应所需要的试剂。
[0026] 利用本发明的标记可以对大葱育性进行快速准确的判断，提高大葱保持系选育效 率，对于建立大葱分子标记辅助育种技术体系具有重要意义。
[0027] 本发明的有益效果为：
[0028] (1)快速准确：通过本发明，只需提取大葱总DNA进行PCR扩增，酶切后进行琼脂 糖凝胶电泳，即可有效的鉴定细胞质的类型，实现筛选保持系的第一步，快速寻找N型细胞 质的大葱植株。
[0029] (2)标记稳定：对已经育成的5份不育系与保持系以及4份杂交种进行验证，其分 子标记鉴定结果与遗传分析结果完全一致。
[0030] (3)和国际上最先进类似标记（Li Min Gao, Yun Qi Chen, Y