黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记及其专用引物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及与黄瓜靶斑病抗病基因 Cca 连锁的分子标记及其在黄瓜种质资源选择中的应用。
【背景技术】
[0002] 黄瓜（Cucumis Sativus. L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、 总产量最高的国家。
[0003] 黄瓜棒孢叶斑病，又称祀斑病，是一种世界性分布的病害。目前已成为危害黄瓜露 地和保护地栽培的重要病害之一，尤以越冬温室、冬春温室、春大棚等保护地内发生严重。 主要危害叶部，病斑初呈淡褐色后变褐绿色，严重时叶片枯死。该病导致落叶率低于5 %时， 病情扩展慢，约2周，而后一周内发展快，落叶率可由5 %发展至90 %。棚室内反季节种植黄 瓜在冬春季节和初夏均易流行发病。田间发病率一般在10% -25%，严重时为60% -70%， 造成损失达30%以上。靶斑病采用化学防治效果不理想，不仅使生产投入增加且会造成环 境安全隐患，倒茬嫁接使技术困难和劳动成本增加。因此选育抗病品种是解决靶斑病危害 的最佳途径。
[0004] 黄瓜靶斑病抗病基因影响黄瓜对靶斑病的抗性，它的研究将会推动抗病育种进 程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中十分有效。分 子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点， 可在苗期进行选择，加快育种进程。因此，开发用于辅助鉴定黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的分 子标记十分重要。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记 及其专用引物和应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] -种黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记，是用以下引物自黄瓜总DNA中扩增出来的核 苷酸序列之一：序列表中SEQ IDN0:1和SEQ ID NO: 2、序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
[0008] 获得上述黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记的引物如下：1)获得黄瓜靶斑病抗病连 锁分子标记CcaSNPl的引物为序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 ;2)获得黄瓜靶斑病抗 病连锁分子标记CcaSNP2的引物为序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
[0009] 利用上述引物对，通过常规PCR法可得到上述分子标记。
[0010] 本发明涉及的与黄瓜抗靶斑病共分离的dCAPs标记CcaSNPl，是利用抗/感遗传 群体（母本:WF2757,抗靶斑病；父本：新泰密刺，感靶斑病）进行精细定位和克隆获得的。 通过利用150株的F2:3群体对靶斑病抗病基因 Cca进行初步定位，然后利用2000株的F2群 体对Cca基因进行精细定位到80kb的区间内。该区间内含3个基因，分别是NB-ARC抗病 基因、BHC-Iike转录因子相关基因和33-like肽重复序列结构蛋白相关基因，其中NB-ARC 基因经过验证分析，被证实为靶斑病抗病基因 Cca的重要候选基因。通过对比研究Cca基 因在抗/感黄瓜材料中的序列差异，发现一个SNP位点，依据http://helix, wustl. edu/ dcaps/dcaps. html，在线设计软件，开发设计了与抗/感祀斑病紧密连锁的dCAPs分子标记 CcaSNPl。同时利用CcaSNPl标记分析2000多株遗传群体材料，结合田间靶斑病接种鉴定 研究，发现CcaSNPl标记与抗感靶斑病紧密连锁，达到共分离。
[0011] 本发明涉及的另一个黄瓜抗靶斑病SNP2关键位点，其在抗病基因 Cca中导致了氨 基酸编码的变化。该SNP位点是通过对不同遗传背景的黄瓜靶斑病抗感材料进行基因组重 测序获得的，通过对多个黄瓜抗感材料进行重测序，利用BWA-Samtools(vO. I. 12a，mpileup 按照默认参数）软件分析Cca基因在不同材料中的SNP位点，结合黄瓜基因组9930-V2和基 因组注释，发现Cca基因的210位存在单碱基差异SNP2位点（由G到A)。并利用该SNP2 位点设计标记，获得CcaSNP2分子标记，通过分析上述黄瓜材料的基因型，结合田间靶斑病 接种鉴定材料抗感病表型，发现CcaSNP2标记分析的基因型与抗感表型一致，证明CcaSNP2 可作为靶斑病紧密连锁分子标记，筛选黄瓜材料。
[0012] 上述分子标记或引物在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应用。
[0013] 在上述应用中，优选地，所述分子标记CcaSNPl在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应 用的具体方法为：以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ ID NO: 1和序列 表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用MaeII内切酶对 PCR产物酶切，如果得到165bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到135bp的酶 切产物，则待测黄瓜为感病材料；更优选地，所述待测黄瓜材料为WF2757或者长春密刺，或 者以WF2757和/或长春密刺作为亲本得到的子代；
[0014] 在上述应用中，优选地，所述分子标记CcaSNP2在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应 用的具体方法为：以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ ID N0:3和序 列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用XbaI内切 酶对PCR产物酶切，如果得到164bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到134bp 的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料；更优选地，所述待测黄瓜材料为BANNA HUANGGUA， 或者 CUCUMIS HARDWICKII，或者 DI HUANGGUA，或者以 BANNA HUANGGUA 和 / 或者 CUCUMIS HARDWICKII作为亲本得到的子代，或者以DI HUANGGUA作为亲本得到的子代，或者DI HUANGGUA和CUCUMIS HARDWICKII作为亲本得到的子代，或者以BANNA HUANGGUA和DI HUANGGUA作为亲本得到的子代。
[0015] 本发明具有如下有益效果：
[0016] 本发明的dCAPs标记CcaSNPl和CcaSNP2与黄瓜靶斑病抗病存在紧密连锁关系 (共分离），可鉴定目的基因黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的存在，实现对抗病植株的间接选择， 由于不受其他基因效应和环境因素的影响，可用于早代选择，缩短育种年限，提高育种效 率，为进行黄瓜靶斑病抗病育种提供技术支持。
【附图说明】
[0017] 图1是黄瓜靶斑病抗病基因 Cca定位连锁图谱，其中左图黄瓜靶斑病基因初定位 示意图，中间两个图为靶斑病抗病基因精细定位示意图，右图为80kb区间范围内基因分布 情况及基因注释；
[0018] 图2是Cca基因 CcaSNPl分子标记在某一群体中酶切验证结果示意图；
[0019] 图3是Cca基因 CcaSNP2分子标记在某一群体中酶切验证结果示意图；
[0020] 图4是Cca基因 CcaSNPl分子标记在未知另一群体中的酶切鉴定结果示意图；
[0021] 图5是Cca基因 CcaSNP2分子标记在另一未知群体中的酶切结果示意图。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
[0023] 实施例1 :黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的获得
[0024] -、黄瓜靶斑病抗病基因 Cca初步定位和精细定位
[0025] 具体的定位方法包括以下步骤：
[0026] A、黄瓜靶斑病抗病基因定位研究亲本及遗传群体：
[0027] 分别选择WF2757 (母本）和新泰密刺（父本）为抗感亲本，构建150株的F2:3群 体和超过2000株的F2大群体。其中，父本新泰密刺和母本WF2757购自北京市农作物种质 资源库。
[0028] B、黄瓜靶斑病抗病基因定位研究病情指数调查：
[0029] 将亲本及各群体的种子用纱布包裹，温汤浸种，28°C恒温催芽后播于50孔穴盘 中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。
[0030] 黄瓜棒抱叶斑病病原菌多主棒抱菌[Corynespora cassiicola(Berk. Curt.) Wei.]是通过高苇等在文献（河北青县黄瓜棒孢叶斑病病原菌种群分化的研究，华北农学 报，2011,26(5) :9-15)中记载的分离方法获得的。采用阚琳娜等（黄瓜褐斑病防治药剂的 活体筛选，中国蔬菜，2007 (4) : 22~24)的方法制备黄瓜靶斑病菌液，浓度为I X IO5个孢子 /mL，血球计数板测定孢子浓度。于黄瓜幼苗期进行悬浮菌液喷雾接种，用小型手持喷雾器 将制备好的悬浮菌液均匀地喷洒于黄瓜叶片上，以叶片有水滴流淌为度。接种后置于25°C 光照培养箱中保湿培养。进行3次重复，每次重复30株。
[0031] 按上述方法接种后7~IOd进行病情调查。病情分级标准为：0级：无病斑；1级： 病斑面积占整个叶面积的5%以下；2级：病斑面积占5%~25% ;3级：病斑面积占26%~ 50% ;4级：病斑面积占51 %~75% ;5级：病斑面积达75%以上。其中2以下为抗病，3以 上为感病类型。
[0032] 对亲本及各群体的病情进行精确统计。
[0033] C、黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的初步定位：
[0034] 利用 Cavagnar 等（Genome-wide characterization of simple sequence repeats in cucumber. BMC Genomics，2010, 11:569)发表的黄瓜高密度遗传图引物信息和和本实 验室开发的Indel和SNP引物信息（参见表1中序号为1-8的引物信息），结合150株的 F2群体病情指数的精确统计，对亲本和后代群体进行分子标记分析，编码采集亲本及群 体单株的基