一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及莜麦蛋白质制备领域，具体是一种从莜麦蛋白粉中提取β-1，3-葡聚糖 酶的方法。
【背景技术】
[0002] β-1，3-葡聚糖酶是一类葡聚糖水解酶家族的一员，广泛存在植物、动物、微生物 中，它可有效水解很多植物病原真菌细胞壁中的β-l，3-葡聚糖，帮助植物抵御病原真菌的 侵染。将外源β-l，3-葡聚糖酶基因转入植物中可以提高植物抗病性能。在啤酒生产和制糖 工业中，可以用于糖化，有利于改善麦汁的过滤性能、提高麦汁的收得率以及有效降低粮食 消耗。此外，β-1，3_葡聚糖酶还可作为一种新型添加剂被加入饲料当中，有效消除饲料(尤 其麦类作物及其副产品）中葡聚糖的抗营养作用，使麦类饲料的营养更易被动物消化吸 收。
[0003] β-1，3_葡聚糖酶一般纯化过程大都通过盐析、再结合多步柱层析的方法进行分 离，存在步骤较复杂、成本高、蛋白纯度低的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种从莜麦蛋白粉中分离β-l，3_葡聚糖酶的方法，该方法简 便易操作，能够实现用较低成本提取到高纯度的β-1，3_葡聚糖酶。
[0005] 本发明提供的一种从莜麦蛋白粉中提取β-1，3_葡聚糖酶的方法，其特征在于包括 如下步骤：
[0006] (1)将莜麦蛋白粉用4-6倍体积100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)溶解，4°C低温下 抽提蛋白8-12小时，高速离心去除沉淀，保留上清即得到β-1，3-葡聚糖酶粗提液；
[0007] (2)β_1，3_葡聚糖酶粗提液经20%_70%硫酸铵分级沉淀；
[0008] (3)硫酸铵分级沉淀样品经透析除盐，上样于经100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6) 平衡的Q-Sepharos e4B阴离子交换柱，收集穿透样品；
[0009] (4)Q-Sepharose4B阴离子交换柱穿透样品，上样于经100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)平衡的几丁质亲和纯化柱〇1；[1:;[11-36口1^1'086413，收集穿透样品 ；
[0010] (5)几丁质亲和纯化柱穿透样品浓缩后上样于经100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6) 平衡的Sephacryl-200凝胶柱进行纯化，获得电泳纯的莜麦β-1，3-葡聚糖酶。
[0011] 所述步骤中pH优选为6.5。
[0012]本发明从脱脂莜麦粉中分离得到了 β-1，3_葡聚糖酶，分子量约为34kDa。
[0013]与现有技术相比本发明的有益效果:β-1，3_葡聚糖酶一般纯化过程大都通过盐 析、再结合柱层析的方法进行分离，而本发明的优点在于与一般方法正好相反，不是将目标 蛋白结合在不同柱材料上，而是使其不结合其上，大大降低了纯化难度，此分离方法对设备 的要求低，节约了成本。获得了电泳纯的莜麦β-1，3_葡聚糖酶，可用于植物抗真菌、动物饲 料添加剂、啤酒及制糖等应用领域。
【附图说明】
[0014] 图1为蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1. β-l，3-葡聚糖酶粗提液;泳道2.20 % -70 %硫酸铵分级沉淀；泳道3 . Q-Sepharose4B柱穿透的蛋白样品；泳道4 .几丁质亲和柱 Chitin_Sepharose4B 穿透样品；泳道 5 · Sephacryl-200柱分离样品。
【具体实施方式】
[0015] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0016] 实施例1
[0017] β-l，3-葡聚糖酶分离提取:取适量去壳后的莜麦种子，用高速粉碎机粉碎后，称取 粉末80g，加入6倍体积的丙酮充分脱脂8h后于通风橱自然风干直至丙酮完全挥发得到莜麦 蛋白粉。取莜麦蛋白粉71.2g，加入6倍体积1 OOmM磷酸缓冲液(pH6.5)于4°C过夜抽提蛋白。 抽提液于4°C高速冷冻离心机1300〇1'/1]1；[11离心301]1；[11后，收集上清进行硫酸铵分级沉淀操 作，当加硫酸铵粉末使溶液饱和度至20 %时，在4°C层析柜中静置2h，再以13000rmp/min离 心30min，收集20 %硫酸铵沉淀后的上清液。向其中继续加硫酸铵粉末至饱和度达到70 %，4 °C层析柜中静置2h，13000rmp/min离心30min，收集20 % -70 %硫酸铵沉淀样品。以5mM磷酸 缓冲液(PH6.5)为透析平衡液，将20 % -70 %硫酸铵沉淀样品在4 °C下透析直至无 S042_。将透 析后的样品上样至用lOOmM磷酸缓冲液(pH为6.5)平衡的Q-Sepharose4B层析柱(购自GE公 司），收集穿透蛋白样品。再将穿透样品上样于用l00mM磷酸缓冲液(pH为6.5)平衡的几丁质 亲和柱Chitin_Sepharose4B(购自New England Biolabs公司），收集穿透并浓缩后上样于 100mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡好的Sephacryl-S-200凝胶层析柱(购自GE公司），收集β-1， 3-葡聚糖酶目标蛋白，进行SDS-PAGE分析和计算纯化效率(见图1，表1)
[0018] 表1莜麦种子中β-1，3-葡聚糖酶提取总表
[0019]
[0021]莜麦β-1，3-葡聚糖酶活性测定:在10mL的试管中加入950yL含有终浓度为O.lmg/ mL的昆布多糖(购自Solarbio公司）的磷酸缓冲液(终浓度为20mM，pH6.5)，放置于37°C恒温 水浴条件下保存1 〇min，随后向其中加入50yL在各纯化阶段得到的β-l，3-葡聚糖酶样液，再 次放置于37°C水浴条件下反应90min，该实验中选择缓冲液为空白对照。反应完毕后加入 lmLDNS(3.5二硝基水杨酸)溶液并混合均匀，沸水浴显色反应进行10min，反应完毕迅速冷 却，向试管中加入lmL H20,将溶液稀释并定容至3mL，测量并记录β-1，3-葡聚糖酶实验组在 分光光度计上540nm处对空白组的吸光度，并计算酶活力。酶活力单位在本实验中被定义 为:37 °C条件下，lh产生的葡萄糖所需的酶量。
【主权项】
1. 一种从莜麦蛋白粉中提取β-1，3-葡聚糖酶的方法，其特征在于包括如下步骤： (1)将莜麦蛋白粉用4-6倍体积的pH为6.4-6.6的lOOmM磷酸缓冲液溶解，4°C低温下抽 提蛋白8-12小时，高速离心去除沉淀，保留上清即得到β-1，3-葡聚糖酶粗提液； (2 )β-1，3-葡聚糖酶粗提液经20 % -70 %硫酸铵分级沉淀； (3) 硫酸铵分级沉淀样品经透析除盐，上样于经pH为6.4-6.6的lOOmM磷酸缓冲液平衡 的Q-Sepharose4B阴离子交换柱，收集穿透样品； (4) Q_Sepharose4B阴离子交换柱穿透样品，上样于经pH为6 · 4-6 · 6的lOOmM磷酸缓冲液 平衡的几丁质亲和纯化柱Chitin-Sepharose4B，收集穿透样品； (5) 几丁质亲和纯化柱穿透样品浓缩后上样于经pH为6.4-6.6的lOOmM磷酸缓冲液平衡 的Sephacry 1 -200凝胶柱进行纯化，获得电泳纯的莜麦β-l，3-葡聚糖酶。2. 如权利要求1所述的一种从莜麦蛋白粉中提取β-1，3-葡聚糖酶的方法，其特征在于 所述步骤中pH为6.5。
【专利摘要】本发明提供了一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法，属于蛋白质制备领域。本发明的方法包括将脱脂的莜麦粉用4-6倍体积的100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)，在4℃低温条件下抽提8-12小时，利用硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose4B阴离子柱、Chitin-Sepharose4B几丁质亲和纯化柱、Sephacryl-200凝胶柱，除去莜麦其他蛋白，获得电泳纯的莜麦β-1,3-葡聚糖酶。本发明莜麦β-1,3-葡聚糖酶的提取方法，操作简单、对设备要求低，且所得到的β-1,3-葡聚糖酶纯度高，可用于植物抗真菌、饲料添加、啤酒及制糖等领域。
【IPC分类】C12N9/24
【公开号】CN105567661
【申请号】CN201610131519
【发明人】石亚伟, 郭涛
【申请人】山西大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月8日