变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白的制作方法

专利名称：变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种变异金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)纤连蛋白结合蛋白，其对凝血因子XIIIa具有降低的反应性。包含所述变异纤连蛋白结合蛋白的免疫原性组合物具有改良的抗原特性且使用更安全。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(S.aureus)纤连蛋白结合蛋白(Fnb)是一种表面相关的多功能受体，其负责与诸如纤连蛋白、纤维蛋白和纤维蛋白原的人类蛋白特异性可逆结合。所述结合使微生物能够有效附着，且随后于手术、血管损伤等期间侵入并寄居于人类宿主中。已将Fnb评估为包括于免疫原性组合物中用于防止金黄色葡萄球菌感染的潜在候选物。用重组Fnb免疫和产生抗所述蛋白的功能活性抗体可潜在地防止金黄色葡萄球菌与人体组织初始附着，且因此可防止感染。然而，近来的研究表明小鼠、兔和人类中所产生的抗体并不抑制野生型Fnb与人类纤连蛋白和纤维蛋白原的结合。相反，其诱导Fnb与这些人类蛋白结合，且因此增强细菌与宿主组织的粘附。其表明与人类蛋白的可逆结合仅充当葡萄球菌粘着至宿主组织的过程中的初始阶段。
在近来的研究中已证实，葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(FnbA)充当称为细胞质型转谷氨酰胺酶的人类酶的底物(Matsuka等人。2003)。这是一种先前关于FnbA未知的新功能。细胞质型转谷氨酰胺酶(也称为因子XIIIa)是一种催化极其有限数量的人类蛋白(表1)共价(不可逆)交联导致形成高分子质量均聚物和杂聚物的酶。因子XIII是催化多肽链内或其间异构肽键形成的酶的转谷氨酰胺酶家族的成员。因子XIII在血液中循环且因此认为其是一种细胞外酶，而组织型转谷氨酰胺酶(TG)(例如，肝TG、角质细胞TG、表皮TG、前列腺TG和红细胞TG)位于细胞内且因此充当细胞内酶(Aeschlimann等人。1994)。不同的转谷氨酰胺酶识别与底物相同的蛋白，但通常具有不同的亲和性和/或特异性。总的来说，因子XIII的底物特异性比组织型转谷氨酰胺酶的底物特异性更严格(Gorman等人1981；Gorman等人1984；Fesus等人1986)。
由因子XIIIa催化的交联反应是包括血液凝固、创伤愈合和纤维蛋白溶解的多种正常生理反应中的重要步骤。因子XIIIa催化的蛋白交联是通过在特定谷氨酰胺(Gln)与赖氨酸(Lys)氨基酸残基之间形成共价键而发生。已证实FnbA可通过因子XIIIa而轻易地与人类纤连蛋白和纤维蛋白交联(Matsuka等人2003)。因此，用FnbA免疫后，FnbA经历与纤连蛋白和纤维蛋白的立即共价(不可逆)交联。此抗原与人类蛋白的不可逆复合物的形成极可能损害免疫反应，并导致缺乏抑制活性/中和活性的抗体的产生。
因此，需要鉴别野生型葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白内的直接涉及因子XIIIa催化的与人类蛋白的共价交联的特定反应性氨基酸残基(Gln和Lys)，并取代那些残基以产生对凝血因子XIIIa具有降低的反应性且将有效抑制与纤连蛋白和纤维蛋白的交联和不可逆结合的变异形式的Fnb。

发明内容
因此，本发明是关于一种经分离、变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白(Fnb)，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下述残基相对应的残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)103、Gln105、赖氨酸(Lys)157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组。在一实施例中，这些氨基酸突变成丙氨酸。在另一实施例中，所述经分离、变异的Fnb是衍生自FnbA或FnbB。
本发明也是关于一种如上文所述的变异Fnb，其中所述变异是氨基酸Lys702的突变。
本发明也是关于一种如上文所述的变异Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由如下蛋白和金黄色葡萄球菌菌株的残基组成的群组

本发明也是关于一种经分离的编码变异金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下述残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异纤连蛋白结合蛋白保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组。
本发明也是关于一种如上文所述的经分离的核酸分子，其中所述变异是氨基酸Lys702的突变。
本发明也是关于一种核酸构筑体，其包含本文所述的操作性连接至调节序列的经分离的核酸分子。
本发明也是关于一种包含本文所述的核酸构筑体的重组宿主细胞，也关于一种制造本文所述的变异金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白的方法，所述方法包含在适于表达所述变异纤连蛋白结合蛋白的条件下维持本发明的重组宿主细胞。
本发明也是关于所述变异纤连蛋白结合蛋白或表达所述蛋白的重组宿主细胞用于制备引起抗金黄色葡萄球菌的免疫反应的免疫原性组合物的用途。
本发明另外是关于一种免疫原性组合物，其包含生理学上可接受的媒剂和变异金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白，所述变异纤连蛋白结合蛋白保持免疫原性，且当并入所述免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物(诸如纤连蛋白和纤维蛋白)的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱。变异Fnb在脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的以下残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783及Gln830。免疫原性组合物也可包含佐剂。
本发明也是关于一种免疫原性组合物，其包含生理学上可接受的媒剂和编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的以下残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783及Gln830，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入所述免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且在脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
本发明也是关于一种如上文所述的免疫原性组合物，其中所述变异是氨基酸Lys702的突变。
本发明也是关于一种免疫脊椎动物以对抗金黄色葡萄球菌的方法，其包含向所述脊椎动物投与组合物，所述组合物包含生理学上可接受的媒剂和免疫有效量的变异金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的以下残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783及Gln830，其中所述变异纤连蛋白结合蛋白保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物(诸如纤连蛋白和纤维蛋白)的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型纤连蛋白结合蛋白与所述人类蛋白的结合。
本发明另外是关于一种免疫脊椎动物以对抗金黄色葡萄球菌的方法，其包含向所述脊椎动物投与组合物，所述组合物包含生理学上可接受的媒剂和免疫有效量的编码变异金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白的核酸分子，视情况以及促转染剂，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的以下残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783及Gln830，其中所述变异纤连蛋白结合蛋白保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物(诸如纤连蛋白和纤维蛋白)的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型纤连蛋白结合蛋白与所述人类蛋白的结合。
在一实施例中，所述脊椎动物是血清反应阴性的人类。
本发明也是关于一种如上文所述的免疫方法，其中所述变异是氨基酸Lys702的突变。


图1描述因子XIIIa催化的丹酰基尸胺(画面A和C)和丹酰基-PGGQQIV(画面B和D)探针并入rFnbA。修饰反应进行4小时和18小时。移除修饰4小时(第1泳道)和18小时(第3泳道)而未反应的探针后，通过SDS-PAGE分析rFnbA样本。或者，使修饰4小时和18小时的rFnbA样本经受凝血酶的有限蛋白水解，且随后通过SDS-PAGE进行分析(第2泳道和第4泳道)。电泳后，在紫外光下对凝胶进行照相(画面C和D)，且随后用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)将其染色(画面A和B)。箭头展示经探针修饰的rFnbA及其凝血酶产生的片断的位置。每一画面中的第5泳道都含有如所指示的分子质量标准。
图2描述由胰蛋白酶消化经因子XIIIa修饰的rFnbA得到的丹酰基尸胺标记肽的HPLC分离。因子XIIIa催化丹酰基尸胺并入rFnbA进行4小时(画面A和B)和18小时(画面C和D)。使经丹酰基尸胺标记的rFnbA制备物经胰蛋白酶消化，且所述肽是在Aquapore RP-300C8逆相管柱上分离。洗脱是通过210nm处之吸光度以及550nm处的荧光进行监测。收集荧光峰1(画面B和D)、2和3(画面D)，且在第二轮逆相层析后，使其经受NH2末端序列分析和质谱分析。
图3描述由Glu-C蛋白酶消化经因子XIIIa修饰的rFnbA得到的丹酰基尸胺标记肽的HPLC分离。因子XIIIa催化丹酰基尸胺并入rFnbA进行4小时(画面A和B)和18小时(画面C和D)。使经丹酰基尸胺标记的rFnbA制备物经Glu-C蛋白酶消化，且所述肽是在Aquapore RP-300C8逆相管柱上分离。洗脱是通过210nm处之吸光度以及550nm处的荧光进行监测。收集荧光峰1(画面B和D)、2、3、4、5、6和7(画面D)，且在第二轮逆相层析后，使其经受NH2末端序列分析和质谱分析。
图4描述由Glu-C蛋白酶消化经因子XIIIa修饰的rFnbA得到的丹酰基-PGGQQIV标记肽的HPLC分离。因子XIIIa催化丹酰基-PGGQQIV并入rFnbA进行4小时(画面A和B)和18小时(画面C和D)。使经丹酰基-PGGQQIV标记的rFnbA制备物经Glu-C蛋白酶消化，且所述肽是在Aquapore RP-300C8逆相管柱上分离。洗脱是通过210nm处之吸光度以及550nm处的荧光进行监测。收集由星号表示的荧光峰(画面B)和峰1、2、3、4、5、6和7(画面D)，且在第二轮逆相层析后，使其经受NH2末端序列分析和质谱分析。
图5描述野生型FnbA的氨基酸序列中因子XIIIa反应性Gln和Lys残基的位置。其是对此项研究中所使用的金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的rFnbA的结构组织(残基Ala1-Pro839)(上部)及其氨基酸序列(下部)(SEQ ID NO1)的示意性描述。图5展示主要区域的位置A-纤维蛋白原结合区；B1和B2-未知功能的同源重复区；Du、D1、D2、D3和D4-纤连蛋白结合重复区。箭头展示FnbA的A、Du、D2和D4区内因子XIIIa反应性Gln(103、105、783和830)和Lys(157、503、620和762)残基的位置。黑体字母表示FnbA一级序列中相同的因子XIIIa反应性Gln和Lys残基。带下划线的字母描述预计的凝血酶裂解位点Arg202-Gly203的位置。
图6描述多种金黄色葡萄球菌菌株的FnbA和FnbB物质的氨基酸序列(SEQ IDNOS1-14)的比对。已展示因子XIIIa反应性Gln和Lys残基周围的区域。上部经鉴别的反应性Gln和Lys残基的位置与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的所述位置相对应。FnbA和FnbB物质的一级序列中的黑体字母突出表示保守的因子XIIIa反应性Gln受体和Lys供体位点。多重序列比对是使用CLUSTALW(1.81)程序执行。
图7描述对此项研究中所使用的野生型和突变型FnbA物质(上部)和经分离的蛋白质的SDS-PAGE分析(下部)的示意性表示。此图展示来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA中主要区域的位置A-纤维蛋白(纤维蛋白原)结合区；B1和B2-未知功能的同源重复区；及Du、D1、D2、D3、D4-纤连蛋白结合重复区。反应性Gln残基和引入的Gln-Ala突变的位置是通过实心三角形表示，而反应性Lys残基和引入的Lys-Ala突变的位置是通过空心菱形展示。FnbA物质和经纯化蛋白质的SDS-PAGE(4-20％凝胶)分析的示意性表示是以如下次序展示1-野生型FnbA；2-1Q FnbA突变体；3-4Q4K FnbA突变体。凝胶中的外部泳道含有如所指示的分子质量标准。
图8描述因子XIIIa催化的丹酰基尸胺(A)和丹酰基-PGGQQIV探针(B)并入野生型和突变型FnbA。丹酰基尸胺的并入是在20mM Tris pH 7.4、150mM NaCl、5mMDTT、5mM CaCl2中进行；而丹酰基-PGGQQIV的并入是在20mM Tris pH 8.5、15mMNaCl、5mM DTT、5mM CaCl2中进行。对照反应也是在含有2mM EDTA的相同缓冲液中进行。在所指示的时间点移除等分试样，使其与SDS混合，加热并于4-20梯度凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。将在60min(A)和120min(B)时自对照反应中移除的等分试样标记为星号。电泳后，在紫外光下对凝胶照相(A和B，下部)，且随后用考马斯亮蓝将其染色(A和B，上部)。凝胶中的外部泳道含有如所指示的分子质量标准。
图9描述因子XIIIa催化的野生型和突变型FnbA与纤维蛋白的交联。在所指示的时间点时，终止反应并在还原条件下于3-8％梯度凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。电泳后，用考马斯亮蓝将凝胶染色(A)；或使其转移至硝基纤维素膜上，随后用抗FnbA(B)和抗纤维蛋白原α链(C)抗体将其免疫染色。箭头展示FnbA和纤维蛋白的α、β、γ链以及纤维蛋白之已交联的γγ链的位置。将FnbA与纤维蛋白α链之间交联的主要高迁移率产物指定为a，而将交联的低迁移率产物指定为b、c和d。每一画面中左手边的泳道含有由上至下具有下列Mr值的分子质量标准250、150、100、75、50和37kDa。
图10描述XIIIa催化野生型和突变型FnbA与纤维蛋白α链交联的速率。如材料和方法中所述，检定剩余单体(未交联)野生型FnbA(实心圆)、1Q FnbA(空心圆)和4Q4K FnbA(实心三角形)的量，并将其绘制成时间的函数的图。
图11描述因子XIIIa催化的野生型和突变型FnbA与纤连蛋白的交联。在所指示的时间点时，终止反应并在还原条件下于4-20％梯度凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。电泳后，用考马斯亮蓝将凝胶染色(A)；或使其转移至硝基纤维素膜上，随后用抗FnbA(B)和抗纤连蛋白(C)抗体将其免疫染色。箭头指示FnbA和纤连蛋白的位置。FnbA与纤连蛋白之间交联的产物描述为a、b、c和d。每一画面中左手边的泳道含有由上至下具有下列Mr值的分子质量标准250、150、100、75和50kDa。
图12描述XIIIa催化的野生型和突变型FnbA与纤连蛋白交联的速率。如材料和方法中所述，检定剩余单体(未交联)野生型FnbA(实心圆)、1Q FnbA(空心圆)和4Q4KFnbA(实心三角形)的量，并将其绘制成时间的函数的图。
图13展示自Glu-C蛋白酶消化经因子XIIIa修饰的野生型FnbA分离的丹酰基-PGGQIV标记肽(荧光峰3(Anderson等人2004))的MALDI-TOF质谱。
图14展示来自多种金黄色葡萄球菌菌株的FnbA和FnbB物质的氨基酸序列的比对。已展示因子XIIIa反应性Lys702周围的区域。上部经鉴别的反应性Lys残基的位置与来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的所述位置相对应。多重序列比对是使用CLUSTALW(1.81)程序(Thompson等人1994)执行。
具体实施例方式
FnbA是通过因子XIIIa的转谷氨酰胺酶作用而与纤连蛋白或纤维蛋白共价交联，导致受体-配体均聚物和杂聚物的形成。凝血因子XIIIa或细胞质型转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)属于通过形成细胞内ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异构肽键来催化特定蛋白质底物共价交联的酶的转酰胺基酶类。交联是通过转酰基反应发生，其中谷氨酰胺的γ羧酰胺基团充当酰基供体(胺受体)且赖氨酸的ε-氨基充当酰基受体(胺供体)(Henschen和McDonagh 1986；Lorand 2001)。
因子XIII在血液中作为非活性四聚体前体A2B2循环，所述前体是由两个催化A亚单元和两个调节B亚单元构成。暴露于凝血酶后，因子XIII酶原经历Ca2+依赖性活化而成为因子XIIIa(经活化之因子XIII)，所述因子XIIIa随后催化纤维蛋白凝块γ链间和α链间共价交联的形成。此反应表示凝血级联系统中的最后事件，且对于正常止血至关重要。在通过相同机制将若干不同的人类蛋白共价并入纤维蛋白凝块中也涉及因子XIIIa。参看表1。其中为与所述凝块交联在创伤愈合和纤维蛋白溶解中起重要作用的纤连蛋白和α2-抗血纤维蛋白溶酶。
由因子XIIIa催化的蛋白质-蛋白质交联反应表示两阶段过程。首先，蛋白质彼此特异性联合形成可逆(非共价)复合物；及第二，其通过因子XIIIa而变为共价交联。一般来说，由因子XIIIa催化的蛋白质交联产生在许多生理学反应中起重要作用的多种稠合均聚结构和杂聚结构(Lorand和Graham 2003)。近来关于金黄色葡萄球菌可利用转谷氨酰胺酶活性用于与人类细胞外基质(ECM)分子的粘着的发现(Matsuka等人2003)表明与细菌感染相关的病理学反应中涉及蛋白质交联。
大部分金黄色葡萄球菌菌株表达一种(FnbA)或两种(FnbA和FnbB)由两种不同但紧密相关的基因编码的纤连蛋白结合蛋白(Signas，Raucci等人1989；Jonsson，Signas等人1991)。成熟纤连蛋白结合蛋白的NH2末端区域是由约500个残基长的负责受体的纤维蛋白原/纤维蛋白结合活性的A区形成。FnbA的A区含有蛋白质FnbB型式中缺少的未知功能的30个残基长的重复的B1-B2双拷贝。纤连蛋白结合蛋白的COOH末端区域含有五个保守、约40个残基长的形成受体的纤连蛋白结合区的Du、D1、D2、D3和D4重复。纤连蛋白结合蛋白的COOH末端是通过分选酶(sortase)的转肽酶活性而共价连接于细胞壁肽聚糖(Schneewind，Fowler等人1995)。FnbA与纤连蛋白或纤维蛋白的可逆结合是有效分子间共价交联的必要条件。FnbA与纤连蛋白或纤维蛋白的联合产生经适当定位的供体赖氨酸和受体谷氨酰胺残基，所述残基随后通过因子XIIIa而变为交联。因子XIIIa也催化肽结合反应性谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团与多种一级胺的氨基(包括腐胺、亚精胺和尸胺的氨基)之间异构肽键的形成(Lorand，Rule等人1968；Lorand，Siefring等人1979)。并入可选择的胺供体抑制蛋白质交联并导致受体蛋白中含有的谷氨酰胺残基的酶定向、位点特异性标记(Lorand 2001)。类似地，通过利用于含有反应性谷氨酰胺残基的纤连蛋白或α2-抗血纤维蛋白溶酶的N末端序列后图案化的肽可达成对供体蛋白中含有的赖氨酸残基的特异性标记(Parameswaran，Velasco等人1990；Lorand，Parameswaran等人1992；Sobel和Gawinowicz 1996)。近来已确定，在因子XIIIa的存在下，可通过胺供体合成探针丹酰基尸胺和在纤连蛋白的N末端序列后图案化的丹酰化肽修饰葡萄球菌rFnbA，所述丹酰化肽充当胺受体探针(Matsuka等人2003)。
在本发明中，人凝血因子XIIIa或组织转谷氨酰胺酶靶向的反应性Gln和Lys残基已在葡萄球菌FnbA内得以鉴别。这是第一个关于细菌蛋白中因子XIIIa反应性胺受体和供体位点的定位的报导。因子XIIIa反应性谷氨酰胺的位点特异性标记是使用荧光性赖氨酸类似物丹酰基尸胺执行(Lorand，Rule等人1968；Lorand，Siefring等人1979)。因子XIIIa仅与存在于rFnbA受体中的48个Gln残基中的4个残基反应。当将FnbA与丹酰基尸胺和凝血因子XIIIa一起培养时，残基Gln103、Gln105、Gln783和Gln830充当所述FnbA中的胺受体位点。丹酰基尸胺修饰Gln103的速率和程度显著高于其对Gln105、Gln783和Gln830修饰的速率和程度(图2B、D和图3B、D)，表明Gln103充当主要的胺受体位点。反应性残基Gln103和Gln105是位于FnbA受体的NH2末端A区内(图5)，而Gln783和Gln830残基位于所述分子的COOH末端部分中，且其分别属于D1和D4重复。对于作为FnbA的主要胺受体位点的Gln103的鉴别与限制性蛋白水解实验的结果相符。由凝血酶进行的对丹酰基尸胺修饰的rFnbA的裂解导致低分子质量NH2末端片断的释放，所述低分子质量NH2末端片断经UV照射后归因于主要Gln103受体位点的存在而展现高强度荧光。与COOH末端片断相对应且含有次要Gln783和Gln830位点的高分子质量谱带(图5)产生低放射信号(图1A和C)。因此，获得的关于丹酰基尸胺修饰的rFnbA的限制性蛋白水解和SDS-PAGE数据提供另一条表明经鉴别受体位点的各种反应性程度的证据。SDS-PAGE分析后，凝血酶产生的rFnbA片断和母体rFnbA展现比预期更低的电泳迁移率。其最可能是由FnbA中高带电残基含量所引起，已知所述带电残基降低SDS结合能力且因此降低电泳迁移率。当使rFnbA样本经受质谱分析时，其在实验上确定的分子质量值与计算值基本上无差别。
于含有反应性谷氨酰胺残基的纤连蛋白的NH2末端序列上图案化的丹酰基-PGGQQIV肽探针用于标记因子XIIIa反应性赖氨酸残基(Parameswaran，Velasco等人1990；Lorand，Parameswaran等人1992)。标记程序揭露rFnbA内并入肽探针的56个潜在赖氨酸供体残基中的4个残基。这些残基为Lys157、Lys503、Lys620和Lys762。经鉴别的因子XIIIa反应性赖氨酸位点是分布于纤维蛋白(纤维蛋白原)结合区A与纤连蛋白结合D重复之间。Lys157是位于所述A区的NH2末端部分内，而Lys503是位于其与B1B2重复相邻的COOH末端片断中。纤连蛋白结合Du和D2重复分别含有因子XIIIa反应性Lys620和Lys762位点(图5)。有趣的是，不管反应性Lys157的NH2末端位置如何，凝血酶裂解丹酰基-PGGQQIV修饰的rFnbA都不产生荧光性低分子质量片断(图1D，第2和4泳道)。在用考马斯亮蓝将凝胶染色后无法检测低分子质量片断(图1B，第2和4泳道)。这些观察表明用丹酰基-PGGQQIV探针修饰Lys157可能诱使FnbA的NH2末端区域更高度易受凝血酶攻击，导致产生于SDS-PAGE上无法检测的小肽。
总的来说，所有经鉴别的形成纤维蛋白(纤维蛋白原)和纤连蛋白结合位点的反应性Gln受体和Lys供体残基都倾向于群集于FnbA的NH2-和COOH末端区域中。然而，由于无法确切地鉴别含有与峰2(图2D)、峰2、3、5(图3D)和峰3(图4D)相对应的肽的荧光示踪剂，故也无法排除葡萄球菌FnbA受体内其他Gln受体和Lys供体残基的存在。尽管如此，位点特异性标记允许定位参与因子XIIIa催化的FnbA与纤连蛋白、纤维蛋白和可能地与其他人类宿主蛋白的交联反应的反应性Gln和Lys残基的确切位置。测序后，若干个峰在每一次循环中产生一个以上的残基，表明HPLC馏分的不均一性。这些样本的不均一性也由质谱分析结果而显而易见。将对FnbA已知序列的每一循环中的残基与具有预期胰蛋白酶或Glu-C蛋白酶产生裂解的位点的可用图谱相比较使得大部分个别序列得以鉴别。此项研究中关于NH2末端序列分析的结果总是与展示与预期探针修饰的肽相对应的信号的存在的质谱数据相关。
迄今，已鉴别出仅一打以上的凝血因子XIIIa的蛋白质底物。在已知的因子XIIIa的含有谷氨酰胺的底物中，如果可能预计，则存在极少的序列同源性且难以反应。经鉴别的反应性谷氨酰胺通常位于经溶剂暴露的表面区域或柔性延伸区中(Cottrell，Strong等人1979；McDonagh，McDonagh等人1981；Matsuka，Medved等人1996)。在不受理论束缚的情况下，蛋白质的一级结构和构象看来可以确定谷氨酰胺残基可否反应。这些观察与本文所示的关于葡萄球菌FnbA受体的数据相符。
反应性Gln783和Gln830受体位点是位于D2和D4纤连蛋白结合重复中，根据一些报导，所述D2和D4纤连蛋白结合重复不具有紧凑结构且以相当松散的状态存在(House-Pompeo，Xu等人1996；Penkett，Redfield等人1997；Penkett，Redfield等人1998)。反应性Gln103和Gln105位点是位于FnbA的NH2末端区域中，所述区域看来对蛋白水解作用敏感且因此可再次表明其缺乏有序结构。因子XIIIa对于蛋白质中胺供体赖氨酸残基的选择性尚未完全明了。尽管通常的观点为因子XIIIa对于赖氨酸残基的选择性比对谷氨酰胺残基的选择性弱，但仅有限数量的胺供体位点可参与特定的蛋白质-蛋白质交联反应中并经历肽探针的修饰。已证明因子XIIIa关于蛋白质底物中胺供体赖氨酸前的残基展现广泛而明显不同的耐受性。对于因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的蛋白质底物的分析揭露在胺供体位点正前面的残基包括不带电和碱性残基，以及小的脂族残基(Grootjans，Groenen等人1995)。本文所揭露的关于葡萄球菌FnbA受体的数据进一步支持这些观察。在四个经鉴别的因子XIIIa反应性赖氨酸中，Val在Lys157之前，Ala在Lys503之前，且Thr在Lys620之前。唯一的例外为Glu，其在Lys762之前(图5)。
为研究经鉴别的因子XIIIa反应性位点在来自不同金黄色葡萄球菌菌株的其他纤连蛋白结合蛋白中是否保守，使用多重序列比对来分析其氨基酸序列。将金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的氨基酸序列(SEQ ID NO1)与下列菌株的FnbA和FnbB序列相比较菌株8325-4(SEQ ID NO7和SEQ ID NO14)(Signas，Rauci等人1989；Jonsson，Signas等人1991)、MW2(SEQ ID NO4和SEQ ID NO11)(Baba，Takeuchi等人2002)、EMRSA-16(SEQ ID NO8)、MSSA-476(SEQ ID NO5和SEQ ID NO12)、COL(SEQ ID NO6和SEQ ID NO13)、Mu50(SEQ ID NO2和SEQ ID NO9)和N315(SEQ ID NO3和SEQ ID NO10)(Kuroda，Ohta，等人2001)。菌株EMRSA-16和MSSA-476的FnbA和FnbB的氨基酸序列是获自Wellcome Trust Sanger Institute。金黄色葡萄球菌COL的序列是获自Institute for Genomic Research。多重序列比对是使用CLUSTALW(1.81)程序执行(Thompson，Higgins，等人1994)。
图6展示金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA中经鉴别的反应性Gln和Lys残基周围区域的氨基酸序列比对。多重比对揭露反应性Gln103、Gln105、Gln830和Lys620残基在所分析的FnbA序列中保守。在菌株MW2、MSSA-476、COL、8325-4和EMRSA-16的FnbA中，反应性Lys157经Thr残基置换。在菌株COL和8325-4中，反应性Lys503经Asn残基取代。EMRSA-16菌株的FnbA序列中缺少含有反应性Lys762的多肽链区段，而且COL和8325-4菌株中的反应性Gln783取代为His(图6)。此观察表明不同金黄色葡萄球菌菌株的FnbA对因子XIIIa的转谷氨酰胺酶作用的反应性可改变。
同时，显而易见，因子XIIIa反应性受体和供体位点较少保留于受体的FnbB家族内。所分析的FnbB序列都不具有反应性Gln103、Lys157和Lys503，同时Mu50和N315菌株中缺少Lys762。菌株MW2、MSSA-476、COL和8325-4的FnbB序列中并未保留反应性Gln105和Gln783。在所有经鉴别的因子XIIIa反应性位点中，仅Lys620和Gln830残基高度保守并存在于所有经分析的FnbA和FnbB序列中(图6)。
有趣的是，FnbA经因子XIIIa处理后，保守的反应性Lys620残基始终展现对于丹酰基-PGGQQIV探针的最高反应性(图4B峰*和D峰5，表3)。其进一步表明620位处Lys供体位点的生理学重要性。所有经评估的FnbB序列中都缺乏主要Gln103受体位点以及Lys157和Lys503供体位点的事实表明B型纤连蛋白结合蛋白在因子XIIIa催化的交联反应中并未起到突出重要的作用。这些差异也表明A和B型纤连蛋白结合蛋白对于其人类宿主蛋白交联搭配物展现不同选择性。
除葡萄球菌FnbA受体外，血液凝固、纤维蛋白溶解、细胞外基质装配和创伤愈合反应中都涉及所有当前已知的因子XIIIa蛋白质底物。本发明者关于金黄色葡萄球菌FnbA充当因子XIIIa的双功能底物并经历与纤连蛋白或纤维蛋白的交联的发现(Matsuka等人2003)表明凝血因子XIIIa也在分子发病机理中起到重要作用。病原性金黄色葡萄球菌利用因子XIIIa关于共价连接于人类宿主分子的转谷氨酰胺酶活性的能力解释了组织损伤后细菌寄居的极高效率。损伤后，血液凝块的形成不仅起到恢复血管完整性的作用，而且也起到提供起始创伤修复的临时基质(Mosesson 1992)的作用。所述凝块的主要蛋白质组份纤维蛋白和细胞质型纤连蛋白对于这些功能而言至关重要。纤维蛋白与纤连蛋白也充当金黄色葡萄球菌与表面相关的FnbA受体的配体，且因此负责细菌与创伤位点的结合。当所述凝块成熟时，凝血因子XIIIa起始催化纤维蛋白分子之间和纤维蛋白与纤连蛋白之间的分子间交联。纤维蛋白分子之间的共价交联增加所述凝块的结构稳定性(Henschen和McDonagh 1986)，同时纤连蛋白与纤维蛋白的交联对于创伤愈合过程所需的细胞黏附和迁移事件而言极为重要(Grinnel，Feld等人1980；Knox，Crooks等人1986；Corbett，Lee等人1997)。在此阶段与纤维蛋白或纤连蛋白可逆联合的葡萄球菌FnbA受体可通过因子XIIIa而与其配体共价交联。FnbA共价并入纤维蛋白或纤连蛋白增加葡萄球菌寄居和感染确立的可能性。其也与纤维蛋白-纤维蛋白和纤维蛋白-纤连蛋白交联反应竞争(Matsuka，Medved等人1994；Matsuka，Migliorini等人1997)(Matsuka等人2003)，且因此，可影响凝块的结构完整性，并抑制创伤愈合反应。所述涉及因子XIIIa催化的葡萄球菌FnbA与人类细胞外基质蛋白的交联最可能充当FnbA受体分子进化的驱动力，最终导致其获得一种新颖且有用的特性。FnbA对于因子XIIIa演化的反应性在宿主寄居中提供显著优势，且随后对金黄色葡萄球菌的存活具有积极影响。
除鉴别野生型葡萄球菌FnbA内直接涉及于本文所述的因子XIIIa催化的共价交联反应中的反应性氨基酸残基(Gln和Lys)外，本发明也是关于衍生自Fnb的蛋白质的合成，当随后感染金黄色葡萄球菌后，所述衍生自Fnb的蛋白质与纤连蛋白和纤维蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱。特定而言，本文所述的工作是针对组合物和制备蛋白质和/或多肽的方法，所述蛋白质和/或多肽包含变异纤连蛋白结合蛋白或可在免疫原性组合物调配物(包括多价免疫原性组合物)中用作免疫原且可用于主动免疫的多肽。所述策略涉及改变Fnb序列中的一个或一个以上的氨基酸，产生衍生自Fnb具有免疫原性而在随后感染金黄色葡萄球菌后不诱使野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合增强的蛋白质或多肽。本文所鉴别的两个、三个或三个以上氨基酸残基的突变都处于本发明的范畴内。
此项技术中已知野生型(天然)Fnb的核苷酸和氨基酸序列(美国专利第5,320,951号、第5,571,514号、第5,175,096号、第5,652,217号)。如本文所使用的“变异”及其衍生出的词语意欲意谓与野生型序列不同的氨基酸序列，以及编码与野生型氨基酸序列不同的氨基酸序列的核苷酸序列。变异包括一个或一个以上核苷酸或氨基酸的插入、缺失和/或取代。
举例而言，变异可为其导致移码突变的单核苷酸或一个以上核苷酸的插入或缺失；导致一个或一个以上所编码的氨基酸的改变的至少一个核苷酸的改变；导致提前终止密码子产生的至少一个核苷酸的改变；若干个核苷酸的缺失，其导致由所述核苷酸编码的一个或一个以上氨基酸的缺失；导致基因编码序列中断的一个或若干个核苷酸的插入；全部或部分基因的重复；全部或部分基因的转位；或全部或部分基因的重排。单个基因中可存在一个以上的所述突变。所述序列改变引起由所述基因编码的Fnb的变异。举例而言，如果所述变异是移码突变，则移码可导致所编码的氨基酸改变，和/或可导致提前终止密码子产生，使得产生截短的蛋白质。
举例而言，所述变异可优选地保留天然Fnb的三维构象。而且，对于Fnb的功能、尤其对于免疫原性至关重要的氨基酸可通过此项技术中已知的方法进行鉴别。尤其适用的方法包括鉴别保守氨基酸、定点突变和丙氨酸扫描突变(例如，Cunningham和Wells1989)、结晶作用和核磁共振。可测试由这些方法所制造的变异多肽的特殊生物活性，包括免疫原性和抗原性。
特定而言，适当氨基酸变异可基于一些标准进行，所述标准包括疏水性、碱性或酸性特征、电荷、极性、尺寸、官能基(例如-SH或糖基化位点)的存在或不存在和芳族性质。基于上述特性赋予各种氨基酸类似基团对于所属领域的技术人员将易于显而易见；其他适当的氨基酸改变也可见于Bowie等人(Science 2471306-1310(1990))中。
举例而言，所述变异可采取谷氨酰胺和赖氨酸残基的保守型(例如甘氨酸取代丙氨酸、缬氨酸取代异亮氨酸、组氨酸取代赖氨酸、天冬氨酸取代谷氨酰胺)定点突变的形式(图6)，所述突变保持涉及保护性免疫反应的FnbA区的属性，但缺失或修饰在刺激金黄色葡萄球菌感染中所涉及的抗原决定基(意即，生物学等效物)。所述变异也可采取非保守型突变(例如赖氨酸取代苏氨酸、丙氨酸取代赖氨酸、丙氨酸取代谷氨酰胺)的形式，其中已降低或消除金黄色葡萄球菌感染的有害刺激。所述变异也可采取完全缺失本文所鉴别的任何谷氨酰胺或赖氨酸残基的形式，并持续使用衍生自剩余Fnb的部分。为了优化转译和/或免疫原性，可通过保持剩余Fnb或多肽的空间性的连接子区域替代缺失。变异可使用任何标准致突变物或致突变方法进行，诸如涉及噬菌体的定点突变或涉及合成寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)技术。
因此，本发明是关于一种经分离的编码变异金黄色葡萄球菌Fnb或其部分的核苷酸序列，其中所述变异Fnb或其部分保持免疫原性。如本文所使用的术语“变异Fnb”意欲意谓保持免疫原性且当将其并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时于随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强与纤连蛋白或纤维蛋白的结合的金黄色葡萄球菌的Fnb(或其部分)。在一特定实施例中，所述变异Fnb包含至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830。在一实施例中，这些氨基酸突变成丙氨酸。
尽管本发明已联系与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830相对应的氨基酸加以特定描述，但希望本文所述用于鉴别这些残基的方法可应用于野生型Fnb的其他残基以鉴别其他残基的变异。
适当时，本发明的核酸分子可为例如mRNA之RNA或诸如cDNA和基因组DNA的DNA。DNA分子可为双链或单链；单链RNA或DNA可为编码链或有义链，或非编码链或反义链。在一实施例中，核酸分子包含至少约14个核苷酸；在另一实施例中，至少约50个核苷酸；且在甚至又一实施例中，至少约200个核苷酸。核苷酸序列可仅为编码至少一个变异Fnb的氨基酸序列的片断的序列；或者，核苷酸序列可包括至少一个变异Fnb氨基酸编码序列的片断，以及诸如内含子和非编码3′与5′序列的额外非编码序列(例如，包括调节序列)。此外，核苷酸序列可融合于标记序列，例如编码用于协助多肽分离或多肽纯化的序列。
术语“核苷酸序列”可包括通过化学或通过重组方式合成的核苷酸序列。因此，本发明中包括载体中所含有的重组DNA。同时，核苷酸序列包括异种宿主细胞中的重组DNA分子，以及在溶液中经部分或大体上纯化的DNA分子。本发明的核苷酸序列也涵盖本发明的DNA分子的活体内和活体外RNA转录物。这些核苷酸序列可用于(例如)制造所编码的变异Fnb。
本发明也涵盖本发明的核苷酸序列的变异，诸如那些编码变异Fnb的部分、类似物或衍生物的变异，只要所述部分、类似物或衍生物包含变异Fnb。这些变异可为核苷酸序列未经改变的部分中天然存在的变异，诸如等位基因变异的情形；或非天然存在的变异，诸如那些由各种致突变物和致突变方法诱导的变异。预期的变异包括(但不限于)一个或一个以上可产生保守型或非保守型氨基酸改变(包括添加和缺失)的核苷酸的添加、缺失和取代。
本文所述的本发明也是关于上文所述的核酸分子的片断。术语“片断”意欲涵盖本文所述的核苷酸序列的部分，其长度为至少约14个连续核苷酸至至少约50个连续核苷酸或更长，但其限制条件为这些片断编码变异Fnb多肽；这些片断适用作引物。某些引物和探针选择性地与编码本文所述的变异Fnb的核酸分子杂交。举例而言，编码本文所述的变异Fnb的抗原部分的片断为适用的。
本发明也是关于在中度和高度严谨杂交条件(例如，选择性杂交的条件)下与本文所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。适当的严谨条件已为所属领域技术人员所已知或可见于诸如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6的标准文本。
因此，本发明是关于与本文所述的变异核苷酸序列具有实质的一致性，诸如与这些序列具有至少90％的一致性或至少95％的一致性的核苷酸序列。特定的核苷酸序列编码具有与本文所述的变异Fnb大体上类似的免疫原活性的多肽。
本发明也是关于一种变异金黄色葡萄球菌Fnb或其多肽。所述变异Fnb或多肽是保持免疫原性且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其于随后感染金黄色葡萄球菌后与纤连蛋白和纤维蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱的金黄色葡萄球菌的Fnb(或其部分)。在一特殊实施例中，变异Fnb包含至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830。本发明的变异Fnb大体上经纯化(例如，纯化至均质)，且大体上不含其他蛋白质。
本发明也提供表达载体，例如核酸构筑体，诸如质粒和考斯质粒(cosmid)，其含有编码变异Fnb或多肽并操作性连接至至少一个调节序列的核酸序列。许多此类载体为市售的，且熟练技工可易于制备其他适当的载体。“操作性连接”意谓核苷酸序列是以允许核酸序列表达的方式连接至调节序列；此术语意欲包括直接的物理连接与借助连接子或插入序列连接。调节序列为业内认可的，且选择用以制造为变异Fnb或多肽的多肽。因此，术语“调节序列”包括启动子、增强子和描述于Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中的其他表达控制元件。举例而言，可使用天然的调节序列或对于所转化的宿主细胞而言为天然的调节序列。应了解表达载体的设计可视诸如待转化的宿主细胞的选择和/或所需表达的蛋白质类型的因素而定。
举例而言，可通过使核酸分子或其部分连接于适于在原核细胞、真核细胞或二者中表达的载体中来制造本发明的变异Fnb和多肽(参看例如Broach，等人1983，Sambrook等人1989)。
本发明也提供经所述载体转染的原核和真核宿主细胞。例如，可用本发明的表达载体转化、转染或感染的细胞包括(但不限于)细菌细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)(例如E.coli K12菌株)、链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；昆虫细胞(杆状病毒)，包括果蝇(Drosophila)、Sf9和Sf21细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞；植物细胞和哺乳动物细胞，诸如胸腺细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEp-2细胞、Vero细胞和COS细胞。
因此，编码本文所述的变异Fnb的核苷酸序列可通过微生物或真核细胞方法而用于制造重组形式的蛋白质。将多核苷酸序列连接至诸如表达载体的基因构筑体中和转化或转染进真核(酵母、鸟类、昆虫、植物或哺乳动物)或原核(细菌细胞)的宿主中是用于制造其他熟知蛋白质的标准程序。也可使用病毒载体，包括(但不限于)腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、反转录病毒、慢病毒(lentiviruses)、痘病毒(包括牛痘病毒)、甲病毒(诸如辛德毕斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)和委内瑞拉脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus))；和不分段型、负链RNA病毒(non-segmented，negative-stranded RNA viruses)，诸如麻疹病毒、腮腺炎病毒和水疱性口炎病毒。因此，本发明是关于通过重组技术制造变异Fnb。
除活体外制造本发明的变异Fnb的前述宿主细胞系统外，多种系统都适用于在活体内表达和递送所述变异Fnb。这些系统利用减毒病原体(诸如细菌或病毒)作为递送剂。这些活的减毒病原体已作为核酸序列编码本发明的所需变异Fnb的异种核酸区段插入所述系统中。使用这些系统，所需变异Fnb是通过脊椎动物体内活的减毒细菌或病毒表达。
本发明的蛋白质可通过多种方法自重组细胞培养物中分离或纯化(例如，至均质)。这些方法包括(但不限于)阴离子或阳离子交换层析、乙醇沉淀、亲和层析和高效液相层析(HPLC)。所使用的特定方法将视多肽的特性和宿主细胞的选择而定；适当的方法对于所属领域技术人员将易于显而易见。
本发明也是关于包含本文所述变异Fnb的免疫原性组合物。举例而言，本发明的变异Fnb可与生理学上可接受的媒剂一起调配以制备免疫原性组合物。特定的生理学媒剂可包括(但不限于)水、缓冲生理食盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态乙二醇)和右旋糖溶液。所选择的媒剂中活性成份的最佳浓度可根据熟知程序以经验确定，且将视所需的最终医药调配物而定。
变异Fnb可用作抗原以在诸如哺乳动物宿主的脊椎动物中引起针对抗原的免疫反应。
本发明的方法包含向脊椎动物投与免疫有效剂量的包含变异Fnb与任何适当佐剂的混合物的免疫原性组合物。如本文所使用的“佐剂”意欲意谓足以增强或改变针对抗原的免疫反应的任何药剂。如本文所使用的免疫原性组合物的“免疫有效”剂量是适于引起免疫反应的剂量。特定剂量将视待治疗的脊椎动物的年龄、体重和医学条件以及投药方法而定。熟习技工将易于确定适当的剂量。可视情况投与医药学上或生理学上可接受的媒剂中的免疫原性组合物，所述媒剂诸如生理食盐水或乙醇，诸如甘油或丙二醇的多元醇。
用于增强组合物的效用的适当佐剂包括(但不限于)(1)铝盐(矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳液调配物(有或无其他特定的免疫刺激剂，诸如胞壁酰肽(参看下文)或细菌细胞壁组份)，诸如(a)MF59(PCT公开案第WO 90/14837号)，含有5％Squalene、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(视情况含有各种量的MTP-PE(参看下文，尽管并非必需))，使用诸如110Y型微射流机(Microfluidics，Newton，MA)的微射流机调配为亚微米颗粒；(b)SAF，含有10％Squalene、0.4％Tween 80、5％普流尼克(pluronic)嵌段共聚物L121和thr-MDP(参看下文)，微流化成亚微米乳液或经涡旋以产生较大粒径乳液；和(c)RibiTM辅助系统(RAS)，(Corixa，Hamilton，MT)，含有2％Squalene、0.2％Tween 80和一或多种选自由下列各物组成的群组的细菌细胞壁组份美国专利第4,912,094号(Corixa)中所述的3-O-脱酰单磷酰脂A(MPLTM)、二霉酸海藻糖(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，或MPL+CWS(DetoxTM)；(3)可使用皂角苷佐剂，诸如Quil A或STIMULONTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA)(美国专利第5,057,540号)；或由其产生的微粒，诸如ISCOM(免疫刺激复合物)；(4)细菌脂多糖、合成脂质A类似物(诸如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP))或其衍生物或类似物，其是购自Corixa，且其描述于美国专利第6,113,918号中；一种此类的AGP为2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酸基-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]-b-D-葡萄哌喃糖苷，其也称为529(先前称为RC529)，其经调配为水溶液形式或稳定乳液；合成多核苷酸，诸如含有CpG主结构的寡核苷酸(美国专利第6,207,646号)；(5)细胞因子，诸如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如，γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖化毒素的解毒突变体，诸如野生型或突变体形式的霍乱毒素(CT)，例如，根据已公开的国际专利申请案第WO 00/18434号(也参看WO 02/098368和WO 02/098369)，其中氨基酸第29位的谷氨酸经另一氨基酸(优选为组氨酸)置换；百日咳毒素(PT)；或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，尤其LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(参看例如WO 93/13302和WO 92/19265)；和(7)充当增强组合物效用的免疫刺激剂的其他物质。
如上文所提及，胞壁酰肽包括(但不限于)N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-normuramyl-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
本发明的组合物可通过多种路径投与人类或非人类脊椎动物，所述路径包括非经肠、动脉内、皮内、经皮(诸如通过使用缓释聚合物)、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经口和鼻内投药路径。在这些组合物中所使用的Fnb的量将视投药路径和受检脊椎动物的身体特征而异。调节和处理用于传统载剂抗原的已确立的剂量范围以使其适应本发明的组合物完全处于所属领域技术人员的能力内。本发明的组合物意欲用于治疗未成年与成年脊椎动物且尤其为人类。
变异Fnb可与其他免疫原联合投与；所述变异Fnb可与其他免疫原单独、依序或同时投与。
本发明的变异Fnb可与载剂分子偶合以便调节或增强免疫反应。适当的载剂蛋白包括对于投与脊椎动物安全且作为载剂免疫上有效的细菌毒素。实例包括百日咳、白喉和破伤风类毒素和无毒突变蛋白(交叉反应物质(CRM))，诸如白喉类毒素的无毒变异体CRM197。含有至少一个T细胞抗原决定基的天然毒素或类毒素的片断也可用作抗原的载剂。用于制备抗原与载剂分子的接合物的方法在此项技术中已熟知(Wong 1991；Bernatowicz和Matsueda 1986；Frisch等人1996；Boeckler等人1996)。
此外，如果一特定的肽区域已缺失，则可将一个或一个以上来自另一有机体的抗原的抗原决定基插入所述缺失区域，以产生二价疫苗。
本发明也是关于一种免疫原性组合物，其包含生理学上可接受的媒剂和编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb的结合。此类免疫原性组合物在本文中称为核酸免疫原性组合物或DNA免疫原性组合物，且其适用于脊椎动物的遗传免疫。
如本文所使用的术语“遗传免疫”是指用定向对抗尤其为金黄色葡萄球菌的病原性药剂的核酸免疫原性组合物接种尤其哺乳动物的脊椎动物，使得所述脊椎动物产生对抗金黄色葡萄球菌的免疫反应。如本文所使用的“核酸免疫原性组合物”或“DNA免疫原性组合物”是包含编码多肽抗原的核酸分子(尤其为本文所述的变异金黄色葡萄球菌Fnb)的核酸构筑体。所述核酸构筑体也可包括转录启动子元件、增强子元件、剪接信号、终止和聚腺苷酸化信号和其他核酸序列。所述核酸免疫原性组合物于脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后不增强野生型Fnb与纤连蛋白或纤维蛋白的结合。
核酸免疫原性组合物是通过标准方法制造。举例而言，使用已知的方法，将编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸(例如DNA)插入表达载体以构造核酸免疫原性组合物(Maniatis等人1989)。
个体脊椎动物是使用标准方法用核酸免疫原性组合物免疫。通过吸入喷雾或经由植入式储集器以含有常规无毒、生理学上可接受的载剂或媒剂的剂量调配物经皮下、静脉内、腹膜内、皮内、肌内、局部、经口、直肠、经鼻、口腔、阴道免疫所述脊椎动物(意即，投与组合物)。或者，通过使用微粒加速工具(“基因枪”)用核酸免疫原性组合物接种脊椎动物。投与其的形式(例如，胶囊、锭剂、溶液、乳液)将部分视投与其的路径而定。举例而言，对于粘膜投药而言，可使用鼻滴剂、吸入剂或栓剂。
核酸免疫原性组合物可与如上文所述的任何适当佐剂联合投与。所述佐剂是以足量投药，所述足量是足以产生对组合物的增强的免疫反应的量。所述佐剂可在用核酸免疫原性组合物接种之前、一并、同时(同时)或之后投与。所述佐剂也可投与多于一次。可在脊椎动物大致相同的位置投与所述佐剂和核酸免疫原性组合物；例如，其都在脊椎动物肢体上的标记位点处投与。
在一特定实施例中，核酸构筑体是与促转染剂共同投与。在一实施例中，所述促转染剂是二辛基甘氨酰精胺(DOGS)(已公开的PCT申请公开案第WO 96/21356号)。在另一实施例中，促转染剂是诸如布比卡因(bupivacaine)的局部麻醉剂(美国专利第5,593,972号)。
本发明也提供一种免疫脊椎动物(例如金黄色葡萄球菌血清反应阴性人类)以对抗金黄色葡萄球菌的方法，其包含向所述脊椎动物投与组合物，所述组合物包含免疫有效量的如上文所述的变异金黄色葡萄球菌Fnb。或者，所述组合物包含编码免疫有效量的变异Fnb的核酸分子，所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与纤连蛋白和纤维蛋白交联的能力较弱，且在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
在人类中投药之前，在动物模型中评估本发明的免疫原性组合物。现将描述例示性、非限制性动物模型。
在小鼠肾盂肾炎模型中，通过在第0、3和6周皮下注射于适当佐剂中的变异Fnb来接种四周龄的雌性CD-1小鼠。在第一次接种之前和8周时将小鼠抽血。最后一次抽血后两天，通过腹膜内注射3×108cfu在哥伦比亚(Columbia)盐琼脂(1×哥伦比亚琼脂、0.1％葡萄糖、1％酵母提取物、0.5％NaCl)上生长过夜的金黄色葡萄球菌Reynolds激发小鼠。激发后48小时后，杀死小鼠并对肾中的细菌进行计数。
在大鼠心内膜炎模型中，通过在第0、2和4周肌内注射于适当佐剂中的变异Fnb来接种三周龄的雄性斯普拉-道来氏(Sprague-Dawley)大鼠。在第一次接种之前将大鼠抽血。6周时，将大鼠抽血并使其经历手术以经由颈动脉和主动脉弓将聚乙烯导管放置进心脏的左心室中。以丝线使所述导管保持适当的位置，且使得形成无菌增殖体。细菌激发后，所述增殖体充当细菌附着和感染的基质。手术后两天，通过静脉内注射1×105cfu在胰蛋白酶大豆肉汤(tryptic soy broth)中生长至对数生长期中期的金黄色葡萄球菌Reynolds激发大鼠。激发后48小时后，杀死大鼠并对心脏中的细菌进行计数。
实例上述揭露内容大体描述本发明。可参考下列特定实例获得更完全的了解。这些实例仅出于说明的目的描述且并不意欲限制本发明的范畴。
缩写HPLC 高效液相层析；MALDI-TOF MS 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱；SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；DTT二硫代苏糖醇；TCA三氯乙酸；丹酰基 5-二甲基胺基萘-1-磺酰基；PTH苯乙内酰硫脲。
ECM细胞外基质蛋白TBSTRIS-缓冲生理食盐水PBS磷酸钠缓冲生理食盐水FXIII 因子XIII或细胞质型转谷氨酰胺酶EDTA 乙二胺四乙酸的钠盐1QrFnbA重组Gln103Ala FnbA突变体4Q4K rFnbA 重组Gln103Ala、Gln105Ala、Gln783Ala、Gln830Ala、Lys157Ala、Lys503Ala、Lys620Ala和Lys762Ala突变wt FnbA野生型FnbA材料和方法葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白。在大肠杆菌中制造包含来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的残基Ala1至Pro839的重组纤连蛋白结合蛋白A(rFnbA)，并如上文所述将其自细胞溶菌液的可溶部分中分离出来(Matsuka等人2003)。简言之，编码FnbA氨基酸残基1-839的fnba基因是使用来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的染色体DNA作为模板通过PCR扩增制造。使用SDS-PAGE、免疫印迹法(Western blot)和NH2末端序列分析证实所分离的rFnbA的特征。所有实验中的蛋白质浓度是根据说明(PierceChemical Company，Rockford，IL)使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)(BCA)检定测定。
因子XIIIa催化的丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV探针并入rFnbA。为将丹酰基尸胺(Sigma，St.Louis，MO)或丹酰基-PGGQQIV(由New England Peptide，Inc.，Fitchburg，MA定制合成)并入rFnbA，使用经预先活化的因子XIII。出于此目的，通过用0.25U/ml于含有10mM二硫代苏糖醇和20mM CaCl2的TBS pH 7.4缓冲液中的凝血酶(Sigma)处理活化500μg/ml的因子XIII(Haematologic Technologies，Inc.，Essex Junction，VT)。37℃下培养20min后，通过添加水蛭素(Sigma)使凝血酶失活，且将此混合物用作因子XIIIa(Takagi，Aoyama等人1995)。通过在37℃下将1-2 mg rFnbA在20 mM Tris pH7.4、150mM NaCl、5mM DTT、5mM CaCl2缓冲液中与2.5mM丹酰基尸胺和因子XIIIa(30μg/ml)一起培养4或18小时进行因子XIIIa催化的对rFnbA内反应性谷氨酰胺残基的标记。通过在37℃下将1-2mg rFnbA在20mM Tris pH8.5、15mM NaCl、5mM DTT、5mM CaCl2缓冲液中与2mM丹酰基-PGGQQIV和因子XIIIa(30μg/ml)一起培养4或18小时进行因子XIIIa反应性赖氨酸残基的标记。两种情况中反应混合物的总体积为0.3ml。在培养期结束时，用7％TCA沉淀蛋白质，通过离心(14,000xg离心5min)收集，并用1ml乙醇∶乙醚(1∶1 vol/vol)反复萃取(8次)离心块以移除未经反应的丹酰基尸胺，或用1ml含有1％N-甲基吗啉和5％H2O的N，N-二甲基甲酰胺反复萃取(8次)所述小球以移除未经反应的丹酰基-PGGQQIV探针(Clement，Velasco等人1998)。
通过凝血酶裂解经丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV标记的rFnbA。蛋白水解裂解经丹酰基尸胺或丹酰基-PGGQQIV修饰的rFnbA是使用凝血酶(Sigma)进行。移除未经反应的丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV探针后，将经修饰的rFnbA离心块溶解于0.5ml含有5mM CaCl2的TBS pH7.4缓冲液中。通过在25℃下以1∶200(w/w)的酶/底物比例将经修饰的rFnbA与凝血酶一起培养1小时来进行有限蛋白水解。通过在2％SDS的存在下，于95℃加热终止反应，并通过SDS-PAGE进行分析。
SDS-PAGE分析。使用预制的4-20％(BioRad Laboratories，Hercules，CA)梯度凝胶通过SDS-PAGE分析经丹酰基尸胺或丹酰基-PGGQQIV修饰的rFnbA的制备物及其由凝血酶产生的片断。此项研究中的所有SDS-聚丙烯酰胺凝胶都是在紫外光下检测且随后用考马斯亮蓝R(BioRad Laboratories)染色。
消化经丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV标记的rFnbA。通过用Glu-C(V-8)蛋白酶(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)和经L-(甲苯磺酰胺基2-苯基)乙基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corp.)处理实现经丹酰基尸胺修饰的rFnbA的酶促水解。仅使用Glu-C蛋白酶进行经丹酰基-PGGQQIV修饰的rFnbA的水解。随后TCA沉淀和萃取，将经修饰的rFnbA团粒溶解于0.3ml TBS，pH7.4中以用于胰蛋白酶裂解，或使其溶解于PBS，pH7.8中以用于Glu-C蛋白酶裂解。酶促裂解是通过在37℃下以1∶20(w/w)的酶/底物比例将经修饰的rFnbA与胰蛋白酶或Glu-C蛋白酶一起培养16h而进行。将额外量的胰蛋白酶或Glu-C蛋白酶添加至反应混合物中，产生1∶10(w/w)的最终酶/底物比例，并在37℃下再继续消化8小时。用0.2％三氟乙酸1∶1(vol/vol)稀释消化混合物，以14,000xg离心5分钟，且使上清液经受逆相HPLC。
逆相HPLC分离丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV标记肽。在Aquapore RP-300 C8管柱(Brownlee Labs，Santa Clara，CA)上通过用0.1％三氟乙酸中的乙腈梯度洗脱来分离经丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV标记的肽。分离是使用装备有ProStar荧光检测器的Dynamax HPLC工作站(Varian，Walnut Creek，CA)进行。用0-50％线性梯度的乙腈以0.5ml/min的流速经90min间隔洗脱肽。通过用350nm激发后监测210nm处的吸光度和550nm处的荧光检测肽的洗脱。收集荧光示踪剂峰并于浓缩至较小体积(50-200μl)后再注入相同管柱中。使用10-20％或20-35％线性梯度的乙腈以0.5ml/min的流速经60min间隔进行第二轮洗脱。使所分离的经丹酰基尸胺或丹酰基-PGGQQIV标记的肽经受质谱和NH2末端序列分析。
序列分析。用Applied Biosystems 490型序列分析仪进行NH2末端序列分析。也将所选择的样本提交至M-Scan Inc.以供服务分析。使用Applied Biosystems 477A型序列分析仪分析这些样本。通过测序多达18个循环来确定所分离的肽的NH2末端。
肽分子质量的理论估算。对于胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶产生的肽的分子质量的计算是使用Peptide Companion V1.25软件从已知葡萄球菌rFnbA的一级序列进行。丹酰基尸胺(335.50Da)或丹酰基-PGGQQIV(932.00Da)修饰对于肽质量的影响是通过添加探针的分子质量来计算。由于每一ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异构肽键的形成伴有一个氨(17.04Da)的释放，故使得最终的分子质量值由此得以调节。
质谱分析。对于所分离的肽的分子质量的测定是使用MALDI-TOF质量分光计Voyager DE-STR(Perseptive Biosystems，Foster City，CA)进行。以反射器模式于20kV的加速电压下记录由337nm处之激光(N2激光)解吸所形成的离子。一般来说，积累200个单一光谱以提高信/杂比，并通过使用随分光仪供应的Data Explorer软件进行分析。将α-氰基-4-羟基肉桂酸(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)用作紫外吸收基质(ultraviolet-absorbing matrix)。将1μl10mg/ml基质化合物于70％乙腈/0.1％三氟乙酸中的溶液与1μl肽溶液(5-10pmol/μl)混合。对于MALDI-TOF MS而言，将1μl此混合物点于不锈钢样本靶上，并在室温下干燥。使用外标校准质谱牛血清白蛋白、人Glul-纤维蛋白肽B、人血管紧缩素I和合成des-Argl-缓激肽。质量准确度处于0.1％的范围内。
实例1因子XIIIa引导的丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV并入rFnbA中和通过凝血酶裂解经探针修饰的蛋白质据报导，来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的含有反应性Gln与Lys残基的纤连蛋白结合蛋白A充当凝血因子XIIIa的双功能底物(Matsuka等人2003)。为估计FnbA内反应性Gln和Lys残基的位置，通过因子XIIIa的催化作用将胺供体(丹酰基尸胺)或胺受体(丹酰基-PGGQQIV)荧光探针并入rFnbA中。反应进行4或18小时，随后移除未经反应的探针并通过凝血酶裂解经荧光示踪剂标记的rFnbA。FnbA内对于凝血酶攻击敏感的单一Arg202-Gly203肽键的存在允许产生表示理论估计分子质量分别为22和70.7kDa的rFnbA的N-和C末端部分的两个片段。凝血酶介导的rFnbA裂解的产物是通过SDS-PAGE评估，且随后在经考马斯亮蓝染色之前于UV光下检测凝胶(图1)。将经丹酰基尸胺或丹酰基-PGGQQIV修饰的rFnbA与凝血酶一起培养导致出现两个不连续片段，其与单一肽键的水解相一致。由凝血酶产生的低和高分子质量片断在SDS-PAGE上的移动性在一定程度上低于所预期的22kDa和70.7kDa片段的移动性。然而，此观察与母体rFnbA(未经修饰与经荧光探针修饰)所相对应的谱带在SDS-PAGE上的总体低移动性一致，所述母体rFnbA在120kDa与203kDa标准之间迁移(Matsuka等人2003)。使用质谱分析所获得的rFnbA的分子质量与自一级序列所估计的值(92.656kDa)极其接近，因此，表明rFnbA及其片段在SDS-PAGE上迁移异常小。
通过因子XIIIa催化丹酰基尸胺修饰rFnbA4h使得与单体rFnbA相对应的谱带产生荧光(图1A和C，泳道1)。凝血酶产生的对于丹酰基尸胺修饰的rFnbA的裂解和随后由SDS-PAGE对于反应混合物的分析揭露荧光几乎全部位于低分子质量片段内。与显著高分子质量的片段相对应的谱带仅容纳整个丹酰基尸胺荧光的一小部分(图1A和C，泳道2)。对于经丹酰基尸胺经延长的18小时的时间修饰的rFnbA观察到类似结果(图1A和C，泳道3和4)。将rFnbA与丹酰基尸胺和因子XIIIa一起延长培养也导致出现与rFnbA二聚体相对应的少量高分子质量谱带(图1A和C，泳道3)。在因子XIIIa和丹酰基-PGGQQIV肽的存在下培养rFnbA 4小时或18小时使得探针并入单体rFnbA中，并且出现与二聚体和高分子质量聚合物相对应的谱带(图1B和D)。尽管如此，显然，在所使用的实验条件下，蛋白质交联几乎完全受抑制且丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV探针的并入主要是发生于单体形式的rFnbA中。当使经丹酰基-PGGQQIV修饰的rFnbA经受凝血酶催化的裂解时，UV照射后，仅高分子质量片断展现荧光(图1B和D，泳道2和4)。因此，有限水解的数据揭露大部分谷氨酰胺受体和赖氨酸供体位点在rFnbA分子的多肽链内在空间上分离且分别位于N和C末端区域中。
实例2鉴别涉及于因子XIIIa交联反应中的rFnbA谷氨酰胺受体位点为鉴别rFnbA内的特定反应性Gln残基，在因子XIIIa和摩尔过量的荧光探针丹酰基尸胺的存在下培养所述rFnbA 4和18小时。在丹酰基尸胺标记反应后，将经修饰的rFnbA制备物洗去未经反应的探针，且随后用胰蛋白酶进行消化。HPLC分离由因子XIIIa催化的丹酰基尸胺并入rFnbA 4小时后所产生的胰蛋白酶肽在210nm处显示出复杂的概况(图2A)。相比之下，在550nm下监测荧光后，在相同样本中检测到仅一个具有约44min的滞留时间的主峰(图2B，峰1)。在因子XIIIa和丹酰基尸胺的存在下将rFnbA的培养时间由4小时延长至18小时且随后用胰蛋白酶消化对于210nm处的洗脱概况(图2C)或主荧光峰的强度或滞留时间(图2D，峰1)并无影响。同时，延长丹酰基尸胺并入rFnbA的时间导致如2和3所描述的两个副荧光峰的强度增加(图2D)。收集标记为峰1(图2B)和峰1、2、3(图2D)的荧光示踪剂修饰肽，并在通过C8管柱两次后通过NH2末端序列和质谱分析加以表征(表2)。对于来自主荧光峰1的肽的序列分析揭露其与衍生自rFnbA的NH2末端部分的13聚体片段相对应。埃德曼(Edman)降解期间，未检测第12循环中的残基，而适当的测序在接下来的第13循环中继续。在埃德曼程序中未产生常规识别的氨基酸的第12个残基与Gln103相对应，因此表明其是经修饰的。位于此肽中的两个其他Gln残基(Gln95和Gln97)分别在第4和第6循环中释放为PTH(苯乙内酰硫脲)-衍生物。获得的关于胰蛋白酶13聚体肽的测序数据(峰1)进一步通过质谱分析的结果得到支持。此肽的观察质量展示m/z 1783.83，与含有单一丹酰基尸胺修饰的肽的计算质量1783.07相对应(表2)。对于来自图2D中的副荧光峰3的胰蛋白酶肽的序列和质谱分析说明此肽也是衍生自FnbA分子的NH2末端区域。测序时，在第一循环中未检测到单个Gln残基(Gln105)，但在下一循环中重新记录表2中所示残基的PHT衍生物，表明Gln105可鉴别为另一受体位点。此肽的观察质量与具有单一丹酰基尸胺修饰的理论值相对应(表2)。来自峰2的材料对于NH2末端测序而言不够均匀，甚至在额外通过C8逆相管柱后亦然，且因此，无法通过埃德曼降解进行准确鉴别。
因为一些预计的胰蛋白酶肽相当大(尤其那些源自蛋白质COOH末端部分者)，所以也使用Glu-C蛋白酶进行对经丹酰基尸胺修饰的rFnbA的消化，其产生更小且更易处理的肽。如“材料和方法”中所述，在丹酰基尸胺的存在下培养rFnbA和因子XIIIa，并用Glu-C蛋白酶进行消化。在用丹酰基尸胺修饰rFnbA 4小时的时期后，在Glu-C蛋白酶消化混合物中反复观察到滞留时间为46分钟的单一荧光峰(图3B，峰1)。延长的18小时的丹酰基尸胺并入rFnbA，随后Glu-C消化产生相同的主峰1和指定为2、3、4、5、6和7的多个副峰(图3D)。如表2所示，自Glu-C蛋白酶消化混合物中回收四个肽并确切地加以鉴别。来自峰1和7的肽含有与那些胰蛋白酶消化物中所鉴别者相同的反应性Gln103和Gln105残基。两种肽都与序列93-107相对应且差异仅在于丹酰基尸胺修饰的数量。来自主荧光峰1的肽含有一个经修饰的Gln103残基，而在峰7的肽中Gln103与Gln105都经修饰。Gln-C蛋白酶消化也产生两种衍生自rFnbA COOH末端部分的荧光肽。来自峰4和6的肽分别含有经修饰的Gln830和Gln783残基(表2)。
经4小时和18小时进行的对于若干单独丹酰基尸胺标记实验的分析，随后胰蛋白酶或Glu-C蛋白酶消化表明Gln103在rFnbA中充当因子XIIIa的主要胺受体位点。Gln103位点的高反应性是引起与胰蛋白酶肽ETTQSQDNSGDQ103R(图2B)或Glu-C蛋白酶产生的TTQSQDNSGDQ103RQVD肽(图3B)相对应的单一主荧光峰起源的原因。由于与因子XIIIa进一步一起培养不影响峰1的强度，故Gln103的修饰在反应4小时后(或更早)完全完成(图2D和3D)。相比之下，自胰蛋白酶(峰2、3)或Glu-C蛋白酶(峰4、6和7)消化混合物回收额外的荧光肽仅在用因子XIIIa延长处理后达成。与主峰1的强度相比，这些荧光峰的强度仍显著更低，表明位置105、783和830处仅一部分反应性Gln残基经历修饰。因此，利用丹酰基尸胺的修饰实验揭露rFnbA含有一个主要(Gln103)和三个次要(Gln105、Gln783和Gln830)因子XIIIa反应性胺受体位点。
实例3鉴别涉及于因子XIIIa交联反应中的rFnbA赖氨酸供体位点使用在纤连蛋白的N末端序列上图案化的丹酰基-PGGQQIV肽进行因子XIIIa介导的对rFnbA Lys侧链的滴定。在因子XIIIa和丹酰基-PGGQQIV探针的存在下，培养rFnbA 4小时，且随后用Glu-C蛋白酶加以消化。再次HPLC分离Glu-C蛋白酶产生的肽揭露在210nm处所检测到的多个峰及仅少量的荧光峰，在约60分钟的范围内进行洗脱(图4A和B)。然而，除由星号标记的峰外(图4B)，标记程度和因此探针修饰肽的纯度等级不足以用于所需的序列分析。为提高丹酰基-PGGQQIV修饰肽的回收率，如“材料和方法”中所述，将rFnbA与因子XIIIa和丹酰基-PGGQQIV探针一起培养18小时，并用Glu-C蛋白酶进行消化。HPLC分离此消化混合物产生总共7个荧光峰(图4D)。荧光峰1-7(图4D)的洗脱曲线与rFnbA修饰4小时后所产生的消化混合物的洗脱曲线相似(图4B)，表明产生具有更高标记程度的相同肽。于逆相C8管柱上额外纯化这些荧光峰的每一者(图4B中经星号标记的峰和图4D中的峰1-7)，且随后通过质谱和测列分析使其经受评估。进行分析的结果概括于表3中。使用质谱分析与测序分析确切鉴别总共6个经修饰的肽。获得峰4、5和7部分高置信序列，明确鉴别Lys157、Lys620和Lys503为经探针修饰的残基(表3)。在埃德曼降解期间，经丹酰基-PGGQQIV修饰的Lys残基并未识别为常规PTH衍生物，且因此无法检测。测序峰4时，在第2循环中观察到此结果，而在第1循环中Val残基作为PTH衍生物释放。在随后的第3循环中继续测序并持续而无中断。第9循环中得到的Lys残基进一步加强经修饰赖氨酸(Lys157)存在于第2循环中的结论。对来自峰5和7的肽的分析表明测序分别在第3和第2循环中中断。又，这些数据表明Lys620(肽5的第3循环)和Lys503(肽7的第2循环)都经因子XIIIa修饰。如可自表3中看出，所获得的关于峰4、5和7的NH2末端序列分析的结果与所观察到的m/z值相符。这些经探针修饰的部分的每一者都展现与含有单一丹酰基-PGGQQIV修饰的各别肽的计算质量精确匹配的m/z值(表3)。荧光峰1和2的每一者都表示以基本上相等的量存在的两个经标记和未经标记肽的混合物。通过利用已知的FnbA一级序列和预计的裂解位点图谱达成双重序列的可靠读取。类似地，通过了解FnbA的氨基酸序列和预计由Glu-C蛋白酶催化裂解位点的位置也实现对于所获得的关于荧光峰6的序列的读取。对于所分离的部分的分析揭露一些丹酰基-PGGQQIV标记肽是衍生自多肽链的相同区域。由Glu-C蛋白酶进行的对于Asp160-Val161肽键的部分水解导致回收较短型式的探针修饰肽1(片断156-100)和较长肽4(片断156-168)。类似地，Asp629-His630肽键的不完全水解导致产生肽5(片断618-629)和肽6(片断618-634)(表3)。因此，再次分别将Lys157和Lys620鉴别为荧光峰1和6中的经探针修饰残基。因子XIIIa催化的对Lys762的修饰是通过将与荧光峰2相对应的部分测序来证实。部分1、2和6的质谱分析提供另一条支持NH2末端测序结果的证据。部分1、2和6中分别在m/z 1432.37、1820.22和2614.83处呈现质量峰。所获得的荧光峰1、2和6的观察质量各自与具有单一丹酰基-PGGQQIV修饰的理论值相对应(表3)。由星号描述的荧光峰(表4B)表示两种肽的混合物。通过了解FnbA的一级序列再次达成对于此部分的读取。未经标记的肽经鉴别为片断266-280(表5)，而含有示踪剂的肽与图4D上的峰5相对应并含有单个经探针修饰的Lys620(表3)。与峰3相对应的部分(图4D)看来是若干个肽的混合物，所述肽的序列不可通过埃德曼降解分解。因此，在丹酰基-PGGQQIV探针的存在下用因子XIIIa处理rFnbA导致对于Lys157、Lys503、Lys620和Lys762的特异性修饰，表明这些残基充当胺供体位点。
实例4使用定点突变取代所鉴别的因子XIIIa反应性Gln和Lys残基通过单独地引入每一突变进行对于所鉴别的反应性Gln和Lys残基的置换。出于此目的，利用涵盖所需的编码区域的合成寡核苷酸(包括Gln至Ala或Lys至Ala的改变)用于rFnbA基因的PCR扩增。利用2520bp基因的特殊亚克隆(例如，涵盖Gln103、Gln105和Lys157的亚克隆和涵盖Gln503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830的亚克隆)使含有所有8个突变的变异基因的“模块逐级(modular stepwise)”重组简化。在每一实例中，在将重组基因亚克隆至大肠杆菌表达载体中后，对突变rFnbA基因进行测序以确定所需突变的存在。举例而言，使用合成寡核苷酸GACAATAGCGGAGATGCAAGACAAGTAGATTTAATAC(及其互补序列)与质粒pL1143退火来将FnbA的Gln103残基改变成Ala，所述质粒pL1143含有与野生型fnbA基因5′段粗略对应的核苷酸。使用Pfu Turbo聚合酶延长此引物以产生fnbA基因变异区域的多个未甲基化的拷贝(Gln103Ala)。用Dpnl消化甲基化模板DNA后，用上述反应的产物转化大肠杆菌降低对于原始甲基化(野生型)拷贝的回收率。随后，将由转化混合物回收的质粒的整个克隆的fnbA区域部分测序以确定所需在质粒fnbA103A中具有以丙氨酸取代Gln的原始密码子(CCA)的密码子GCA(带下划线)的序列的存在GACAATAGCGGAGATGCAAGACAAGTAGATTTAATAC。为获得全长fnbA编码序列，使用Ncol和Kpnl切除质粒fnbA103A中所含有的突变Gln103AlafnbA基因的5′段。随后，将所得DNA片断克隆至pLP1125(含有全长野生型fnbA)的Ncol和Kpnl位点中。如通过整个2.517kb fnbA基因的DNA序列分析所确定，此连接产物(pLP1149)在全长fnbA基因中含有Gln103Ala突变。
以类似的方式，使用合成寡核苷酸GAAGATACAGAGGCAGACAAACCTAAG将野生型FnbA的Lys762置换为Ala，其中Ala的密码子(GCA，带下划线)置换Lys的密码子(AAA)。使用此引物与质粒pLP1144退火，所述质粒pLP1144含有与野生型fnbA3′段粗略对应的核苷酸。引物延伸并转化大肠杆菌宿主后，如上文所述，通过展示在质粒fnbA762A中Ala密码子(GCA，带下划线)置换Lys密码子(AAA)的DNA序列分析来确定突变区域的存在。通过用Spel和Notl消化质粒fnbA762A并将所得片断连接至经相同酶切割的pLP1125中来将质粒fnbA762A中所含有的Lys762Ala突变引入全长fnbA基因。如通过整个fnbA基因的DNA测序所确定，所得重组质粒pLP1150含有Lys762Ala突变。
使用合成寡核苷酸序列GGAGATGCyAAGAGCAGTAGATTTAATAC构造双重突变fnbAQ103A，Q105A(103和105处的Gln都经Ala置换)，所述寡核苷酸除含有Gln103Ala突变(斜体字)外也含有Ala105密码子(GCA，带下划线)。使引物与pLP1149(fnbAQ103A)退火，且将延伸产物(质粒5′103A+5′105A)的整个含有突变的基因的部分测序。随后，使用含有双重突变的Ncol、Kpnl片断置换pLP1125中的野生型序列以产生pLP1155。将pLP1155中所含有的整个fnbA基因测序以确定双重突变的存在。使用寡核苷酸CGAAGAGTCTACAGCAGGTATTGTAACTG构造双重突变Lys620Ala、Lys762Ala，用以使用模板质粒pLP1150起始DNA的合成。此寡核苷酸含有代替野生型Lys620密码子的Ala620的GCA密码子(带下划线)。如通过DNA测序所确定，所得质粒中含有pLP1150的原始Lys762Ala突变以及Lys620Ala突变。将双重突变的区域亚克隆至具有置换野生型序列的来自双重突变体的Spel、Notl DNA片断的pLP1125中。将所得质粒pLP1156的整个fnbA基因测序，确定Lys620Ala、Lys762Ala突变的存在。重复此程序直至所有突变已在fnbA基因的两段中构造为止。每一组突变都是通过上文略述的亚克隆程序组合，使得fnbA基因含有所有8个突变。
实例5评估rFnbA突变体的交联特性使用不同方法证实突变型rFnbA对因子XIIIa的反应性的降低。利用荧光小分子探针丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV评估突变型rFnbA的转谷氨酰胺酶反应性。通过因子XIIIa将上述探针并入突变rFnbA中的缺乏表明不存在反应性Gln和Lys残基。也通过评估突变型rFnbA对于经历因子XIIIa催化的与人类纤连蛋白和纤维蛋白交联的能力进行对于所述突变型rFnbA对因子XIIIa反应性降低或消除的证实。也以野生型rFnbA作为阳性对照进行因子XIIIa催化的荧光探针的并入以及与纤连蛋白或纤维蛋白的交联反应。
在以下实例中，使用定点突变以Ala残基置换经鉴别的反应性Gln和Lys位点，并在FnbA-纤连蛋白和FnbA-纤维蛋白交联反应中评估这些突变的效应。用Ala在单个残基Fnba突变体中置换主要反应性Gln103位点，将其命名为1QFnbA。用Ala残基在FnbA突变体中取代所有经鉴别的Gln103、105、783、830和Lys157、503、620、762位点，将其命名为4Q4K FnbA。将1Q FnbA与4Q4K FnbA突变体的因子XIIIa反应性与野生型FnbA受体的因子XIIIa反应性相比较，并关于宿主转谷氨酰胺酶在葡萄球菌粘附和寄居中的作用讨论结果。
实例6产生1Q FnbA突变体(Q103A突变)使用来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的染色体DNA作为模板通过PCR扩增制造编码NH2末端A区域(残基1-511)的fnbA基因的1533区。扩增是使用下列正向5′-GGCCATGGCATCAGAACAAAAGACAACTACAG-3′和反向5′-CGAGGATCCTTXATGTTTCAATTTGCTTGGC-3′PCR引物进行。正向引物在成熟序列编码区域前并入Nco I限制性位点(带下划线)和紧邻的ATG起始密码子。反向引物包括编码区段后紧邻的TAA终止密码子，随后为Bam HI位点(带下划线)。分离已扩增的DNA片断，用Nco I和Bam HI限制性酶加以处理且随后使其连接于pET-28a载体(Novagen，Inc.，Madison，Wl)中。使用QuikChange II XL定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行诱发fnbA基因的突变。为合成突变体DNA链，我们使用含有1533bpfnbA基因的片断的pET-28a载体作为模板。将合成寡核苷酸5′-GACAATAGCGGAGATGCAAGACAAGTAGATTTAATAC-3′及其互补序列用作突变引物。突变引物含有置换CAA以在103位产生所需Gln→Ala突变的GCA密码子。根据制造商的说明进行热循环、使用Ultra DNA聚合酶的引物延伸和核酸内切酶Dpn I(Stratagene，La Jolla，CA)对(半)甲基化模板的消化。将突变型DNA转化至感受态XL 10-Gold大肠杆菌细胞(Stratagene)中用于切口修复。用Nco I和Kpn I限制性内切酶消化所得质粒DNA，并将含有CAA→GCA突变的fnbA基因的680bp DNA片断亚克隆至含有野生型fnbA基因(FnbA残基1-839)的pET-28a载体中(Matsuka等人2003)。使用Nco I和Kpn I限制性位点将已突变的680bp DNA片断连接至pET-28a/fnbA基因载体中使得编码突变型FnbA(Q103A FnbA)的2517bp fnbA基因修复。将所得pET-28a质粒(Q103AFnbA突变体)转化至BL21(DE3)大肠杆菌细胞中用于蛋白质表达。通过将fnbA基因已突变的区域测序确定所需Q103A突变的存在。
实例7产生4Q4K FnbA突变体(Gln103Ala、Gln105Ala、Gln783Ala、Gln830Ala、Lys157Ala、Lys503Ala、Lys620Ala和Lys762Ala突变)引入K762A突变。使用来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的染色体DNA作为模板通过PCR扩增制造编码葡萄球菌FnbA COOH末端区域(残基512-839)的fnbA基因的区域。使用下列正向5′-GAGCCATGGATATTAAGAGTGAATTAGG-3′和5′-CGAGGATCCGGCGTTGTATCTTCTTCAATC-3′反向PCR引物进行扩增。正向和反向引物分别并入Nco I和Bam HI位点(带下划线)。分离所扩增的DNA片断，用Nco I和Bam HI限制性酶加以处理并使其连接至pET-28a载体(Novagen，Inc.，Madison，Wl)中。突变型DNA链的合成是使用含有fnbA基因的984bp片断的pET-28a载体作为模板和合成寡核苷酸5′-GAAGATACAGAGGCAGACAAACCTAAG-3′及其互补序列作为突变引物进行。突变引物含有置换AAA以于762位产生所需Lys→Ala突变的GCA密码子。将突变型DNA转化至感受态XL 10-Gold大肠杆菌细胞(Stratagene，La Jolla，CA)中。用Spe I和Not I限制性酶消化所得质粒，并将612bp突变型DNA片断亚克隆至含有全长野生型fnbA基因(FnbA残基1-839)的pET-28a载体中。
引入Q105A和K157A突变。分别使用fnbA基因中含有单一(Q103A)和双重(Q103A、Q105A)突变的pET-28a模板连续产生Q105A和K157A突变。将合成寡核苷酸5′-GGAGATGCAAGAGCAGTAGATTTAATAC-3′及其互补序列用作用于Q105A突变的突变引物，而5′-GTTTCAGAAGTCGCAGGTACAGATGTG-3′及其互补序列是用于引入K157A突变。将含有三个(Q103A、Q105A和K157A)突变的突变型DNA转化至感受态DH 10B大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用Nco I和Kpn I限制性酶消化所得质粒，分离680bp突变型DNA片断以随后亚克隆至pET-28a载体中。
引入K620A突变。使用fnbA基因中含有单一(K762A)突变的pET-28a模板产生K620A突变。其是使用突变寡核苷酸5′-CGAAGAGTCTACAGCAGGTATTGTAACTG-3′及其互补序列达成。将含有两个(K620A和K762A)突变的突变型DNA转化至感受态DH 10B大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用Bsr GI和Spe I限制性酶消化所得质粒，且分离1119 bp突变型DNA片断并将其亚克隆至含有fnbA基因及单一K762A突变的pET-28a载体中。
引入K503A突变。使用在fnbA基因中含有双重(K620A、K762A)突变的pET-28a模板产生K503A突变。将合成寡核苷酸5′-GCAGTACGATGCCGCGCAAATTATTGAAAC-3′及其互补序列用作突变引物。将突变型DNA转化至感受态DH 10B大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用Kpn I和Spe I限制性酶消化所得质粒，并分离1256bp含有K503A和K620A突变的突变型DNA片断以随后亚克隆至pET-28a载体中。
引入Q783A突变。使用fnbA基因中含有双重(K620A、K762A)突变的pET-28a模板产生Q783A突变。将合成寡核苷酸5′-GACAGTGTGCCAGCAATTCATGGATTC-3′及其互补序列用作突变引物。将突变型DNA转化至感受态DH 10B大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用Spe I和Not I限制性酶消化所得质粒，并分离612bp含有两个(K762A和Q783A)突变的突变型DNA片断以随后亚克隆至pET-28a载体中。
使三个含有七种突变(680bp-Q103A、Q105A、157A；1265bp-K503A、K620A；和612bp-K762A、Q783A)的DNA片断连接至经Nco I和Not I限制性酶消化的pET-28a载体中，使得2516bp编码Q103A、Q105A、K157A、K503A、K620A、K762A、Q783AFnbA突变体的fnbA基因修复。
引入Q830A突变。使用fnbA基因中含有三个(K620A、K762A和Q783A)突变的pET-28a模板产生Q830A突变。将合成寡核苷酸5′-CAAAATGAAGGTGCACAAACGATTGAAG-3′及其互补序列用作突变引物。将突变型DNA转化至感受态DH 10B大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用Spe I和Not I限制性酶消化所得质粒，并分离612bp含有K762A、Q783A和Q830A突变的突变型DNA片断用于亚克隆至pET-28a载体中。其使得编码含有总共八个Q103A、Q105A、K157A、K503A、K620A、K762A、Q783A和Q830A突变的FnbA的fnbA基因修复。
将所得质粒DNA转化至BL21(DE3)大肠杆菌细胞中用于蛋白质表达。在亚克隆至pET-28a载体中之前，将每一所产生的含有特定突变的DNA片断测序。再次将已修复的突变型fnbA基因测序以确定所需突变的存在和整个编码区域的完整性。
蛋白质。根据本文其他地方所述的程序表达并纯化野生型FnbA和1Q以及4Q4KFnbA突变体(Matsuka等人2003)。以20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl透析所有经分离的FnbA制备物，等分并冷冻储存于-20℃下。
抗体。如上文所述在兔中产生抗-rFnbA多克隆抗体(Matsuka等人2003)。小鼠单克隆抗纤维蛋白原Aα链(Aα529-539，克隆1C2-2)抗体是购自Accurate Chemical andScientific Corp.(Westbury，NY)。小鼠单克隆抗纤连蛋白抗体(克隆2B6-F9)是获自Cedarlane Laboratories(Hornby，Ontario，Canada)。山羊抗兔和抗小鼠IgG碱性磷酸酶接合物是购自BioRad Laboratories(Hercules，CA)。
肽分子质量的理论估计。使用Peptide Companion V1.25软件(CSPS Pharmaceuticals，Inc.，San Diego，CA)根据葡萄球菌rFnbA的已知一级序列对由Glu-C蛋白酶产生的肽的分子质量进行计算。通过考虑由探针引起的质量增加来计算丹酰基-PGGQQIV(930.44Da)修饰对肽质量的影响。由于每一ε-(γ-谷胺酰基)赖氨酸异构肽键的形成都伴以释放一个氨(17.03Da)，故最终分子质量值相应地得到调整。
逆相HPLC分离经丹酰基-PGGQQIV标记的肽。在Aquapore RP-300 C8管柱(Brownlee Labs，San Francisco，CA)上通过用0.1％三氟乙酸中的乙腈梯度洗脱来分离丹酰基-PGGQQIV标记的肽。使用装备有ProStar荧光检测器的Dynamax HPLC工作站(Varian，Palo Alto，CA)进行分离。用0-50％线性梯度的乙腈以0.5ml/min的流速经90分钟间隔洗脱肽。通过用350nm处的激发监测210nm处的吸光度和550nm处的荧光来检测肽的洗脱。收集荧光示踪剂峰并于浓缩至较小体积(50-200μl)后再注入相同管柱中。使用10-20％或20-35％线性梯度的乙腈以0.5ml/min的流速经60分钟间隔进行第二轮洗脱。使所分离的经丹酰基尸胺或丹酰基-PGGQQIV标记的肽经受质谱分析。
质谱分析。对于所分离的肽的分子质量的测定是使用MALDI-TOF质量分光计Voyager DE-STR(Perseptive Biosystems，Foster City，CA)进行。以反射器模式于20kV的加速电压下记录由337nm处激光(N2激光)解吸所形成的离子。一般来说，积累200个单一光谱以提高信/杂比，并通过使用Data Explorer软件进行分析。将α-氰基-4-羟基肉桂酸(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)用作基质。将1μl 10mg/ml基质化合物于70％乙腈/0.1％三氟乙酸中的溶液与1μl肽溶液(5-10pmol/μl)混合。对于MALDI-TOFMS而言，将1μl此混合物点于不锈钢样本标靶上，并在室温下干燥。使用人Glu1-纤维蛋白肽B、人血管紧缩素I和合成des-Arg1-缓激肽外部校准质谱。
SDS-PAGE和免疫印迹分析(Western Blot Analysis)。使用预制3-8％Tris-乙酸盐梯度凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行SDS-PAGE。用考马斯亮蓝R(BioRadLaboratories，Hercules，CA)将此项研究中的所有SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色。对于免疫印迹分析而言，蛋白质样本是电渍于硝基纤维素膜上并经相对应的兔多克隆或小鼠单克隆抗体免疫染色。用山羊抗兔或抗小鼠碱性磷酸酶接合的二级抗体处理所述膜，并将碱性磷酸酶活性用碱性磷酸酶接合物底物(BioRad Laboratories，Hercules，CA)显色。
活化因子XIII。通过在含有10mM二硫代苏糖醇和20mM CaCl2的TBS，pH7.4缓冲液中用0.25U/ml凝血酶(Sigma，St.Louis，MO)处理500μg/ml因子XIII(Haematologic Technologies，Inc.，Essex Junction，VT)达成活化。在37℃下培养20分钟后，通过添加摩尔过量的水蛭素(Sigma，St.Louis，MO)使凝血酶失活，并将此混合物用作因子XIIIa(Takagi等人1995)。
并入丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV探针。使用经活化的因子XIII将丹酰基尸胺(Sigma，St.Louis，MO)或丹酰基-PGGQQIV(New England Peptide，Inc.，Gardner，MA)并入FnbA物质中。利用丹酰基尸胺探查因子XIIIa反应性谷氨酰胺，并使用肽丹酰基-PGGQQIV探查反应性赖氨酸。在3℃下，在2mM丹酰基尸胺或2mM丹酰基-PGGQQIV的存在下，于20mM Tris pH7.4、150mM NaCl、5mM DTT、5mM CaCl2或20mM TrispH8.5、15mM NaCl、5mM DTT、5mM CaCl2中通过分别将2μM野生型或突变FnbA与30μg/ml因子XIIIa一起培养来进行并入。对照反应也是在含有2mM EDTA的相同缓冲液中进行。通过添加2％SDS和10％β-巯基乙醇于各种时间终止反应，在95℃下加热，并通过SDS-PAGE加以分析。于紫外光下检测凝胶且随后用考马斯亮蓝染色。
与纤维蛋白的交联。通过将0.5U/ml凝血酶添加至含有5μM人纤维蛋白原(Calbiochem，San Diego，CA)和15ng/ml因子XIII的溶液中起始在存在或不存在2μM野生型或突变型FnbA的情况下的纤维蛋白聚合和因子XIIIa催化的纤维蛋白交联。交联反应是在含有5mM CaCl2的TBS，pH7.4缓冲液中于37℃下进行。通过添加20mMTris pH7.2、9M脲、40mM二硫代苏糖醇、2％SDS在各种时间终止反应。在37℃下，使凝块溶解30分钟，在95℃下加热，并通过SDS-PAGE/免疫印迹分析样本。
与纤连蛋白的交联。通过将15μg/ml经活化的因子XIII添加至含有1μM野生型或突变型FnbA和2μM人类细胞质型纤连蛋白(Sigma，St.Louis，MO)的溶液中来起始与纤连蛋白的交联反映。所述反应是在37℃下于含有5mM CaCl2的TBS pH7.4缓冲液中进行。此后，通过添加2％SDS和10％β-巯基乙醇在各种时间终止交联反应，在95℃下加热，并通过SDS-PAGE/免疫印迹加以分析。
交联的动力学。因子XIIIa介导的FnbA物质与纤维蛋白和纤连蛋白的交联的动力学是通过密度计分析经考马斯亮蓝染色的凝胶来检测。使用Personal Densitometer SI(Molecular Dynamics，Piscataway，NJ)进行激光密度测定。扫描每一凝胶，并使用ImageQuant 5.2软件分析所产生的影像。反应速率是在FnbA与纤维蛋白或纤连蛋白交联后通过所述FnbA减少量进行评估。使用与FnbA谱带相对应的峰下的面积确定反应混合物中FnbA的相对量，且随后绘制为时间的函数。
结果丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV探针的并入。在大肠肝菌中使用pET-28a表达载体制造包含残基Ala1至Pro839的野生和突变(1Q、4Q4K)形式的FnbA(图7)，并如上文所述将其自细菌溶菌液的可溶部分中分离(Matsuka等人2003)。每一种经分离的蛋白质都在SDS-PAGE上展现单一谱带(图7B)，并显示以ASEQKTTTVE起始的单一NH2末端序列。为测定用Ala残基置换经鉴别的Gln和Lys位点是否影响FnbA对于因子XIIIa的反应性，设计其中测试作为因子XIIIa的底物的野生和突变形式(1Q和4Q4K)FnbA的一系列实验。最初使用丹酰基尸胺和丹酰基-PGGQQIV探针进行对于野生型FnbA与1Q和4Q4K FnbA突变体对因子XIIIa反应性的比较(图8)。在各种时间收集反应混合物与丹酰基尸胺或丹酰基-PGGQQIV的等分试样，通过SDS-PAGE加以分析，并在用考马斯蓝染色之前于紫外光下进行检测。在因子XIIIa和摩尔过量的丹酰基尸胺的存在下，与野生型FnbA相对应的谱带经历荧光的持续增加，其反映探针分子酶附着的增加(图8A)。在相同的实验条件下，1Q FnbA突变体中丹酰基尸胺的并入急剧降低，表明103位的Gln确实充当FnbA中的主要反应性Gln位点。关于4Q4K rFnbA突变体观察到荧光强度的进一步降低，在所述4Q4K rFnbA突变体中，所有四个经鉴别的反应性Gln残基(Gln103、Gln105、Gln783和Gln830)都经Ala置换(图8A)。然而，将4Q4K FnbA突变体与丹酰基尸胺和因子XIIIa一起培养60分钟产生弱但可检测的探针的并入(图8A)。在与丹酰基尸胺的反应中所观察到的4Q4K FnbA突变体的残余反应性可指示FnbA中其他次要反应性Gln位点的存在。
因子XIIIa催化的丹酰基-PGGQQIV探针并入野生型FnbA在图8B中得以证实。当在相同反应中检定1Q FnbA突变体时，其蛋白质谱带展现当与野生型FnbA的蛋白质谱带相比时略微更高的荧光强度(图8)。此结果表明以Ala取代主要反应性Gln103导致1Q FnbA突变体内Lys位点更有效的丹酰基-PGGQQIV标记。此效应有助于Gln103位点的高反应性，其可能通过参与分子内和/或分子间蛋白质交联而与丹酰基-PGGQQIV肽探针有效地竞争。将丹酰基-PGGQQIV探针并入野生型FnbA时蛋白质交联的出现是通过紫外光下和用考马斯蓝染色后可检测的低移动性谱带的存在加以支持(图8B)。因子XIIIa以降低的速率和较低的效率将丹酰基-PGGQQIV探针并入4Q4K FnbA突变体，表明突变的Lys157、Lys503、Lys620和Lys762充当胺供体位点。然而，显而易见的是就4Q4K FnbA突变体对丹酰基-PGGQQIV探针所观察到的因子XIIIa反应性的全面降低并不比其对丹酰基尸胺所观察到的反应性显著。其指示额外的反应性Lys位点仍可用于用丹酰基-PGGQQIV探针的酶促修饰。
因子XIIIa介导的与纤维蛋白的交联。1Q和4Q4K FnbA突变体的因子XIIIa反应性是在纤维蛋白交联反应中得以评估。在对照反应中，野生型FnbA经历与纤维蛋白α链的交联，其导致高分子质量杂聚复合物的形成(Matsuka等人2003)。交联伴有与野生型FnbA相对应的谱带的损耗和具有对应于FnbA-α链杂二聚体的表观分子质量的突出谱带的出现(图9A、B和C，谱带a)。交联反应的产物(谱带a、b、c和d)与抗-FnbA多克隆抗体和抗-纤维蛋白原α链单克隆抗体反应(图9B和C)，表明这些复合物是由共价连接的FnbA和纤维蛋白α链构成。在相同的实验条件下，两种FnbA突变体(1Q和4Q4K)展现极低的因子XIIIa交联反应反应性。在考马斯蓝染色后(图9A)或用抗FnbA多克隆抗体(图9B)和抗纤维蛋白原α链单克隆抗体(图9C)免疫染色后检测到仅痕量的FnbA突变体-α纤维蛋白链杂二聚体。使用密度计分析评估在与纤维蛋白和因子XIIIa一起培养后野生型和突变型FnbA物质的消耗(图10)。如图10所示，野生型FnbA是以比1Q或4Q4K FnbA突变体高得多的速率反应。培养120分钟后，剩余游离(未交联)1Q或4Q4K FnbA突变体的量与野生型FnbA的量相比多大约85％。这些数据表明103位的Gln位点主要负责因子XIIIa催化的FnbA与纤维蛋白α链的连接。所获得的数据也指示1Q与4Q4K FnbA突变体都展现与纤维蛋白交联反应的反应性降低约85％。
因子XIIIa介导的与纤连蛋白的交联。1Q和4Q4K FnbA突变体的反应性也是在与细胞质型纤连蛋白的反应中进行测试。出于此目的，再次利用SDS-PAGE和免疫印迹分析来检定FnbA突变体的反应性。与纤连蛋白一起培养后，当蛋白质变得交联成高分子质量杂聚复合物时，对应于野生或突变形式的FnbA的谱带不断损耗(图11A、B和C)。由使用抗FnbA多克隆抗体(图11B)和抗纤连蛋白单克隆抗体(图11C)进行的免疫印迹分析的结果显而易见由野生型或突变型FnbA和纤连蛋白组成的共价交联高分子质量复合物的形成。SDS-PAGE与免疫印迹法揭露野生型与突变型FnbA物质反应性之间的极小差异(图11)。然而，当使用密度计分析来分析反应的动力学时，交联速率的差异即变得显而易见(图12)。1Q FnbA突变体是以与野生型FnbA反应速率接近的速率反应，而4Q4K FnbA突变体展现较慢的交联速率。培养360分钟后，剩余游离(未交联)4Q4K FnbA突变体的量当与野生型FnbA或1Q FnbA突变体的所述量相比时小约35％。这些数据表明157、503、620和762位的Lys位点都涉及于因子XIIIa介导的FnbA与纤连蛋白的交联中，且总计贡献约35％的FnbA的反应性。所述数据也指示FnbA中其他未经鉴别的反应性Lys残基涉及于与纤连蛋白的交联中。
对于作为FnbA中额外反应性位点的Lys720的鉴别。用丹酰基-PGGQQIV探针进行的标记实验和与纤连蛋白交联的结果表明在4Q4K FnbA突变体中额外反应性Lys位点也可用于因子XIIIa。如先前关于因子XIIIa反应性Lys位点的鉴别所报导(美国专利申请案60/573,724和Anderson等人2004)，使用利用丹酰基-PGGQQIV标记FnbA的程序(Parameswaran等人1990；Lorand等人(1992))。使用丹酰基-PGGQQIV作为荧光示踪剂，我们用所述探针标记FnbA，用Glu-C蛋白酶消化经修饰的蛋白质并对经标记的FnbA肽进行HPLC分离。随后经分离的荧光峰(含有示踪剂的肽)的质谱和NH2末端序列分析导致鉴别出除了一个峰(指定为峰3)之外的所有峰(Anderson等人2004)。为鉴别FnbA中的额外反应性Lys位点，使用逆相HPLC进一步纯化与荧光峰3相对应的物质，且随后使其经受质谱分析。对来自峰3的经探针修饰的物质的分析揭露了观察质量[M+H]+为1941.98的肽的存在(图13)。这一值与含有单一丹酰基-PGGQQIV修饰的9聚体NSHVDIKSE肽的计算质量相对应(表4)。所述NSHVDIKSE肽是源自FnbA的COOH末端区域，并于702位处含有单一Lys残基。因此，将Lys702鉴别为因子XIIIa所靶向的经探针修饰的残基。来自不同金黄色葡萄球菌菌株的已知FnbA和FnbB物质的多重序列比对揭露Lys702极其保守并存在于所有经分析的序列中(图14)。Lys702位点是位于定位于FnbA的Du与D1纤连蛋白结合重复(图7)之间的区域中，且因此，其应易于用于与纤连蛋白的Gln3的交联。此外，新近鉴别的Lys702与反应性Lys620(Anderson等人2004)是在所有经分析的FnbA和FnbB序列中发现的唯一的两个Lys位点。Lys620(荧光峰5，图11D[7])与yLys702(荧光峰3，图11D(Anderson等人2004))位点也展现对丹酰基-PGGQQIV探针最高的反应性。在FnbA和FnbB序列中所观察到的新近鉴别的Lys702的高反应性及其高保存程度表明此位点对于因子XIIIa催化的交联反应的重要性。
应了解，上述讨论和实例仅呈现对于某些实施例的详细描述。因此，所属领域技术人员应显而易见在不悖离本发明的精神和范畴的情况下可进行各种修改和等效代换。
在本专利申请案中所鉴别的所有杂志文章、其他参考文献、专利和专利申请案都是以其全文引用的方式并入。
参考文献Matsuka等人″Staphyloccoccus aureus Fibronectin-Binding Protein Serves as aSubstrate for Coagulation Factor XlllaEvidence for Factor Xllla-Cataiyzed CovalentCross-Linking to Fibronectin and Fibrin.″Biochemistry 42，14643-14652(2003)。
Aeschlimann，D.和Paulsson，M.TransglutaminasesProtein Cross-Linking Enzymes inTissues and Body Fluids.″Thrombosis and Haemostasis71，402-415(1994)。
Gorman J.J.和 Folk，J.E.″Structural features of glutamine substrates fortransglutaminasesSpecificities of human plasma factor Xllla and guinea pig liver enzymetoward syntheticpeptides.″.J.Biol.Chem.256，2712-2715(1981)。
Gorman J.J.和Folk，J.E.″Structural features of glutamine substrates fortransglutaminasesRole of extended interactions in the specificity of human plasma factorXllla and guinea pig liver enzyme.″J.Biol.Chem.259，9007-9010(1984)。
Fesus L，Metsis M.L，Muszbek L.和Koteliansky，V.E.″Transglutaminase-sensitiveglutamine residues of human plasma fibronectin revealed by studying its proteolyticfragments.″Eur.J.Biochem.154，371-374(1986)。
Henschen，A.和J.McDonagh.″Fibrinogen，fibrin and factor XIII.″Blood coagulation.H.C.Hemker.Amsterdam，Elsevier science Publishers171-241(1986)。
Lorand，L.″Factor XIIIStructure，Activation，and Interactions with Fibrinogen andFibrin.″Ann.N.Y.Acad.Sci.936291-311(2001)。
Lorand，L.和 R. M. Graham.″TransglutaminasesCrosslinking Enzymes withPleiotropic Functions.″Nature4140-156(2003)。
Signas，C，G.Raucci，等人″Nucleotide sequence of the gene for a fibronectin-bindingprotein from Staphylococcus aureusUse of this peptide sequence in the synthesis ofbiologically active peptides.″Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America86699-703(1989)。
Schneewind，O.，A.Fowler，等人″Structure of the Cell Wall Anchor of Surface Proteinsin Staphylococcus aureus.″Science268(5207)103-106(1995)。
Lorand，L，N.G. Rule，等人(1968).″Amine Specificity in Transpeptidation.Inhibitionof Fibrin Cross-Linking.″Biochemistry71214-1223(1968)。
Lorand，L.，G.E.Siefring，等人″Dansylcadaverine Specific Staining for TransamidatingEnzymes.″Analytical Biochemistry93453-458(1979)。
Parameswaran，K.，P.Velasco，等人″Labeling of D-lysine crosslinking sites inproteins with peptide substrates of factor Xllla and transglutaminase.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA878472-8475(1990)。
Lorand，L.，K.Parameswaran，等人″Biotinylated Peptides Containing a Factor Xula orTissue Transglutaminase-Reactive Glutaminyl Residue That Block Protein Cross-linkingPhenomena by Becoming Incorporated into Amine Donor Sites.″Bioconiuaate Chem.337-41(1992)。
Sobel，J.H.和M.A.Gawinowicz.″Identification of the Alpha Chain Lysine Donor SitesInvolved in Factor Xllla Fibrin Cross-linking.″J.Biol.Chem.27119288-19297(1996)。
Cottrell，B.A.，D.D.Strong，等人″Amino acid sequence studies on the alpha-chain ofhuman fibrinogen. Exact location of cross-linking acceptor sites.″Biochemistry185405-5410(1979)。
McDonagh，R.P.，J.McDonagh，等人″Amino acid sequence of the factor Xllla acceptorsite in bovine plasma fibronectin.″FEBS Lett127174-178(1981)。
Matsuka，Y.，L.Medved，等人″Factor Xllla-Catalyzed Cross-linking of RecombinantAlpha C Fragments of Human Fibrinogen.″Biochemistry355810-5816(1996)。
House-Pompeo，K.，Y.Xu，等人″Conformational Changes in the Fibronectin BindingMSCRAMMs Are Induced by Ligand Binding.″J.Biol.Chem.2711379-1384(1996)。
Penkett，C.J.，C.Redfield，等人″NMR Analysis of Main-chain ConformationalPreferences in an Unfolded Fibronectin-binding Protein.″J.Mol.Biol.274152-159(1997)。
Penkett，C.J.，C.Redfield，等人″Structural and Dynamical Characterization of aBiologically Active Unfolded Fibronectin-Binding Protein from Staphylococcus aureus.″Biochemistry3717054-17067(1998)。
Grootjans，J.J.，P.J.T.A.Groenen，等人″Substrate Requirements forTransglutaminases.Influence of the Amino Acid Residue Preceding the Amine Donor.″J.Biol.Chem.27022855-22858(1995)。
Jonsson，K.，C.Signas，等人″Two different genes encode fibronectin-binding proteinsin Staphylococcus aureusthe complete nucleotide sequence and characterization of thesecond gene.″Eur.J.Biochem.2021041-1048(1991)。
Baba，T.，Takeuchi，F.，Yuzawa，H.，Aoki，K.，Oguchi，A.Nagai，Y.，Iwama，N.，Asano，K.，Naimi，T.，Kuroda，H.，Cui，L，Yamamoto，K.和Hiramatsu，K.″Genome and virulencedeterminants of high virulence community-acquired MRSA″The Lancet359.第1819-1827页(2002)。
Kuroda，M.，T.Ohta，等人″Whole genome sequencing of meticillin-resistantStaphylococcus aureus.″The Lancet3571225-1240(2001)。
Thompson J.D.，Higgins，D.G.，Gibson，T.J.″CLUSTAL Wimproving the sensitivityof progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specificgap penalties and weight matrix choice.″Nucleic Acids Research22，第4673-4680页(1994)。
Mosesson，M.W.(1992).″The roles of fibrinogen and fibrin in hemostasis andthrombosis.″Semin.Hematol.29177-188(1992)。
Grinnel，F.，M.Feld，等人″Fibroblast Adhesion to Fibrinogen and Fibrin SubstrataRequirement for Cold-Insoluble Globulin(Plasma Fibronectin).″Cell 19517-55(1980)。
Knox，P.，S.Crooks，等人″Role of Fibronectin in the Migration of Fibroblasts intoPlasma Clots.″The Journal of Cell Biology1022318-2323(1986)。
Corbett，S.A.，L.Lee，等人″Covalent Cross-linking of Fibronectin to Fibrin IsRequired for Maximal Cell Adhesion to a Fibronectin-Fibrin Matrix.″J.Biol.Chem.27224999-25005(1997)。
Matsuka，Y.V.，L.V.Medved，等人″The N-terminal Fibrin-binding Site of FibronectinIs Formed by Interacting Fourth and Fifth Finger Domains.″The Journal of BiologicalChemistry.269(13)9539-9546(1994)。
Matsuka，Y.，M.Migliorini，等人″Cross-Linking of Fibronectin to C-TerminalFragments of the Fibrinogen a-Chain by Factor Xllla.″J Prot Chem16739-745(1997)。
美国专利第5,320,951号美国专利第5,571,514号美国专利第5,175,096号美国专利第5,652,217号Cunningham和Wells.Science2441081-1085(1989)。
Bowie等人，Science2471306-1310(1990)。
Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons，NY，6.3.1-6.3.6 (Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzvmology 185.Academic PressSan Diego，CA(1990)。
Broach，等人，Experimental Manipulation of Gene Expression，编辑M.Inouye，Academic Press(1983)，第83页.
Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.第2版.Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，第16章和第17章。
Wong，Chemistry of Protein Coniugation.CRC Press，Ann Arbor Ml(1991)。
Bernatowicz和Matsueda，Analytical Biochemistry15595-102(1986)。
Frisch等人，Bioconiuoate Chem.7180-186(1996)。
Boeckler等人，J.Immunolooical Methods1911-10(1996)。
Maniatis等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.第2版.Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)。
WO 96/21356美国专利第5,593,972号Takagi，J.，T.Aoyama，等人″Identification of factor-XIIla-reactive glutaminyl residuesin the propolypeptide of bovine von Willebrand factor.″Eur. J.Biochem.232773-777(1995)。
Clement，S.，P.T.Velasco，等人″The intermediate filament protein，vimentin，in thelens is a target for cross-linking by transglutaminase.″J Biol Chem273(13)7604-9(1998)。
F.D.Lowy，The New England Joumal ofMedicine339520-532(1998)。
J.M.Patti，B.L. Allen，M.J.McGavin and M.Hook，Annu.Rev.Microbiol.48585-617(1994)。
R.A.S.Ariens，T.-S.Lai，J.W.Weisel，C.S.Greenberg和P.J.Grant，Blood100743-754(2002)。
L.Lorand，G.E. Siefring，Y.S.Tong，J.Bruner-Lorand和A.J.Gray，AnalyticalBiochemistry93453-458(1979)。
K.Parameswaran，P.Velasco，J.Wilson和L.Lorand，Proc.Natl.Acad.Sci.USA878472-8475(1990)。
美国专利申请案60/573,724E.T.Anderson，L.Fletcher，A.Severin，E.Murphy，S.M.Baker和Y.V.Matsuka，Biochemistry4311842-11852(2004)。
J.Takagi，T.Aoyama，S.Ueki，H.Ohba，Y.Saito和L.Lorand，Eur.J.Biochem.232773-777(1995)。
L.Lorand，K.Parameswaran，P.Velasco和S.Murthy，Bioconiuqate Chem.337-41(1992)。
J.D.Thompson，D.G.Higgins和T.J.Gibson，Nucleic Acids Res.224673-4680(1994)表1.因子XIII底物


TAFI指示凝血酶活化纤维蛋白溶解抑制剂；PAI-2为血浆酶原活化剂抑制剂2。
Ariens，R.A.等人Blood(2002)100，743-754表2衍生自rFnbA的丹酰基尸胺修饰肽的NH2末端序列和质谱分析概要
-指示不回收已知氨基酸的埃德曼循环并指派为由因子XIIIa衍生的Gln。
胰蛋白酶肽1和3及Glu-C蛋白酶肽1、4和6的计算质量包括一个结合丹酰基尸胺分子的质量。Glu-C蛋白酶肽7的计算质量包括两个结合丹酰基尸胺分子的质量(参看材料和方法)。来自荧光峰2的胰蛋白酶肽和来自荧光峰2、3和5的Glu-C蛋白酶肽未经确切鉴别。
表3衍生自rFnbA的经丹酰基-PGGQQIV修饰的肽的NH2末端序列和质谱分析概要
-指示不回收已知氨基酸的埃德曼循环并指派为由因子XIIIa衍生的Lys。
计算质量包括一个结合丹酰基-PGGQQIV分子的质量(参看材料和方法)。
来自荧光峰3的肽未经确切鉴别。
表4通过Glu-C蛋白酶得到的衍生自rFnbA的经丹酰基-PGGQQIV修饰肽的质谱分析。

计算质量包括一个结合丹酰基-PGGQQIV分子的质量(参看材料和方法)。
序列表<110>惠氏公司<120>变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白<130>AM101503<140>To be assigned<141>2004-03-31<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>839<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>1Ala Ser Glu Gln Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn Gly Asn Ser Thr1 5 10 15Thr Asp Asn Lys Val Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr Thr Asn Val Asn20 25 30His Ile Glu Glu Thr Gln Ser Tyr Asn Ala Thr Val Thr Glu Gln Pro35 40 45Ser Asn Ala Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro Lys Ala Val Gln50 55 60Ala Pro Gln Thr Ala Gln Pro Ala Asn Val Glu Lys Val Lys Glu Glu65 70 75 80Val Val Lys Glu Glu Ala Lys Pro Gln Val Lys Glu Thr Thr Gln Ser85 90 95Gln Asp Asn Ser Gly Asp Gln Arg Gln Val Asp Leu Ile Pro Lys Lys100 105 110Ala Thr Gln Asn Gln Val Ala Glu Thr Gln Val Glu Val Ala Gln Pro115 120 125Arg Thr Val Ser Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg Ser Ala Asp Val130 135 140Val Glu Ala Lys Glu Gly Met Gly Val Ser Glu Val Lys Gly Thr Asp145 150 155 160Val Thr Ser Lys Val Thr Val Glu Ser Gly Ser Ile Glu Ala Pro Gln165 170 175Gly Asn Lys Val Glu Pro His Ala Gly Gln Arg Val Val Leu Lys Tyr180 185 190Lys Leu Lys Phe Ala Asp Gly Leu Lys Arg Gly Asp Tyr Phe Asp Phe195 200 205Thr Leu Ser Asn Asn Val Asn Thr Tyr Gly Val Ser Thr Ala Arg Lys210 215 220
Val Pro Glu Ile Lys Asn Gly Ser Val Val Met Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240Leu Gly Asn Gly Asn Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asn Glu Ile Glu His245 250 255Lys Val Glu Val Thr Ala Asn Leu Glu Ile Asn Leu Phe Ile Asp Pro260 265 270Lys Thr Val Gln Ser Asp Gly Glu Gln Lys Ile Thr Ser Lys Leu Asn275 280 285Gly Glu Glu Thr Glu Lys Thr Ile Pro Val Val Tyr Asn Pro Gly Val290 295 300Ser Asn Ser Tyr Thr Asn Val Asn Gly Ser Ile Glu Thr Phe Asn Lys305 310 315 320Glu Ser Asn Lys Phe Thr His Ile Ala Tyr Ile Lys Pro Met Asn Gly325 330 335Asn Gln Ser Asn Thr Val Ser Val Thr Gly Thr Leu Thr Glu Gly Ser340 345 350Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Thr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Gly355 360 365Lys Lys Asp Glu Leu Pro Gln Ser Val Tyr Ala Asn Thr Ser Asp Thr370 375 380Asn Lys Phe Lys Asp Val Thr Asn Glu Met Asn Gly Lys Leu Ser Val385 390 395 400Gln Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Leu Asn Leu Asp Lys Leu Asp Lys Thr405 410 415Tyr Val Ile His Tyr Thr Gly Glu Tyr Leu Gln Gly Ser Asp Gln Val420 425 430Asn Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Arg Ala Tyr Lys Ser435 440 445Tyr Tyr Val Tyr Gly Gly Tyr Arg Leu Thr Trp Asp Asn Gly Leu Val450 455 460Leu Tyr Ser Asn Lys Ala Asp Gly Asn Gly Lys Asn Gly Gln Ile Ile465 470 475 480Gln Asn Asn Asp Phe Glu Tyr Lys Glu Asp Thr Ala Lys Gly Thr Met485 490 495Ser Gly Gln Tyr Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Glu Glu Asn Gln500 505 510Asp Asn Thr Pro Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Ile Asp Gly Glu515 520 525
Gly Gly Tyr Val Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu Glu Thr Asp Ser530 535 540Ser Ala Ile Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp Ser Glu Ala Gly545 550 555 560His Val Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser Asn Pro Ile Asp565 570 575Phe Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala Asn Val Val580 585 590Glu Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Thr Thr Glu595 600 605Ser Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Val Thr610 615 620Gly Ala Val Ser Asp His Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr625 630 635 640Thr Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His645 650 655Gly Gln Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His660 665 670Ile Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly675 680 685Val Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu690 695 700Leu Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu705 710 715 720Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val725 730 735Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile Gln Gly Gln Asn Asn Gly740 745 750Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu755 760 765Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile770 775 780His Gly Phe Asn Lys His Asn Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys785 790 795 800Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu805 810 815Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr820 825 830
Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro835<210>2<211>1038<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>2Val Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Asp20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn35 40 45Gly Asn Ser Ala Thr Asp Asn Lys Thr Ser Glu Thr Gln Thr Thr Ala50 55 60Thr Asn Val Asn His Ile Glu Glu Thr Gln Ser Tyr Asn Ala Thr Val65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Lys Ala Val Gln Ala Pro Gln Thr Ala Gln Pro Ala Asn Val Glu Thr100 105 110Val Lys Glu Glu Glu Lys Pro Gln Val Lys Glu Thr Thr Gln Pro Gln115 120 125Asp Asn Ser Gly Asn Gln Arg Gln Val Asp Leu Thr Pro Lys Lys Val130 135 140Thr Gln Asn Gln Gly Thr Glu Thr Gln Val Glu Val Ala Gln Pro Arg145 150 155 160Thr Ala Ser Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg Ser Ala Asp Val Ala165 170 175Glu Ala Lys Glu Ala Ser Asp Val Ser Glu Val Lys Gly Thr Asp Val180 185 190Thr Ser Lys Val Thr Val Glu Ser Gly Ser Ile Glu Ala Pro Gln Gly195 200 205Asn Lys Val Glu Pro His Ala Gly Gln Arg Val Val Leu Lys Tyr Lys210 215 220Leu Lys Phe Ala Asp Gly Leu Lys Arg Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr225 230 235 240Leu Ser Asn Asn Val Asn Thr Tyr Gly Val Ser Thr Ala Arg Lys Val245 250 255
Pro Glu Ile Lys Asn Gly Ser Val Val Met Ala Thr Gly Glu Ile Leu260 265 270Gly Asn Gly Asn Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asn Glu Ile Glu His Lys275 280 285Val Glu Val Thr Ala Asn Leu Glu Ile Asn Leu Phe Ile Asp Pro Lys290 295 300Thr Val Gln Ser Asn Gly Glu Gln Lys Ile Thr Ser Lys Leu Asn Gly305 310 315 320Glu Glu Thr Glu Lys Thr Ile Pro Val Val Tyr Asn Pro Gly Val Ser325 330 335Asn Ser Tyr Thr Asn Val Asn Gly Ser Ile Glu Thr Phe Asn Lys Glu340 345 350Ser Asn Lys Phe Thr His Ile Ala Tyr Ile Lys Pro Met Asn Gly Asn355 360 365Gln Ser Asn Thr Val Ser Val Thr Gly Thr Leu Thr Glu Gly Ser Asn370 375 380Leu Ala Gly Gly Gln Pro Thr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Gly Lys385 390 395400Lys Asp Glu Leu Pro Gln Ser Val Tyr Ala Asn Thr Ser Asp Thr Asn405 410 415Lys Phe Lys Asp Val Thr Lys Glu Met Asn Gly Lys Leu Ser Val Gln420 425 430Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Leu Asn Leu Asp Lys Leu Asp Lys Thr Tyr435 440 445Val Ile His Tyr Thr Gly Glu Tyr Leu Gln Gly Ser Asp Gln Val Asn450 455 460Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Arg Ala Tyr Lys Ser Tyr465 470 475 480Tyr Val Tyr Gly Gly Tyr Arg Leu Thr Trp Asp Asn Gly Leu Val Leu485 490 495Tyr Ser Asn Lys Ala Asp Gly Asn Gly Lys Asn Gly Gln Ile Ile Gln500 505 510Asp Asn Asp Phe Glu Tyr Lys Glu Asp Thr Ala Lys Gly Thr Met Ser515 520 525Gly Gln Tyr Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Glu Glu Asn Gln Asp530 535 540Asn Thr Pro Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Ile Asp Gly Glu Gly545 550 555 560
Gly Tyr Val Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu Glu Thr Asp Ser Ser565 570 575Ala Ile Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp Ser Glu Val Gly His580 585 590Val Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser Asn Pro Ile Asp Phe595 600 605Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu610 615 620Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Thr Thr Glu Ser625 630 635 640Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Val Thr Gly645 650 655Ala Val Ser Asp His Thr Thr Ile Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr660 665 670Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly675 680 685Gln Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile690 695 700Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val705 710 715 720Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu725 730 735Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp740 745 750Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp755 760 765Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Lys Gly Asp770 775 780Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His785 790 795 800Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His805 810 815Gly Phe Asn Lys His Asn Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp820 825 830Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu835 840 845Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile850 855 860
Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser865 870 875 880Glu Pro Glu Thr Pro Met Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro885 890 895Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr900 905 910Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr915 920 925Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro930 935 940Thr Pro Glu Val Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala Lys945 950 955 960Glu Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val965 970 975Thr Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro Thr980 985 990Lys Lys Ala Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu995 10001005Glu Ser Thr Asn Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile101010151020Leu Gly Leu Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ala102510301035<210>3<211>1038<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>3Val Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Asp20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn35 40 45Gly Asn Ser Ala Thr Asp Asn Lys Thr Ser Glu Thr Gln Thr Thr Ala50 55 60Thr Asn Val Asn His Ile Glu Glu Thr Gln Ser Tyr Asn Ala Thr Val65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Lys Ala Val Gln Ala Pro Gln Thr Ala Gln Pro Ala Asn Val Glu Thr
100 105 110Val Lys Glu Glu Glu Lys Pro Gln Val Lys Glu Thr Thr Gln Pro Gln115 120 125Asp Asn Ser Gly Asn Gln Arg Gln Val Asp Leu Thr Pro Lys Lys Val130 135 140Thr Gln Asn Gln Gly Thr Glu Thr Gln Val Glu Val Ala Gln Pro Arg145 150 155 160Thr Ala Ser Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg Ser Ala Asp Val Ala165 170 175Glu Ala Lys Glu Ala Ser Asp Val Ser Glu Val Lys Gly Thr Asp Val180 185 190Thr Ser Lys Val Thr Val Glu Ser Gly Ser Ile Glu Ala Pro Gln Gly195 200 205Asn Lys Val Glu Pro His Ala Gly Gln Arg Val Val Leu Lys Tyr Lys210 215 220Leu Lys Phe Ala Asp Gly Leu Lys Arg Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr225 230 235 240Leu Ser Asn Asn Val Asn Thr Tyr Gly Val Ser Thr Ala Arg Lys Val245 250 255Pro Glu Ile Lys Asn Gly Ser Val Val Met Ala Thr Gly Glu Ile Leu260 265 270Gly Asn Gly Asn Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asn Glu Ile Glu His Lys275 280 285Val Glu Val Thr Ala Asn Leu Glu Ile Asn Leu Phe Ile Asp Pro Lys290 295 300Thr Val Gln Ser Asn Gly Glu Gln Lys Ile Thr Ser Lys Leu Asn Gly305 310 315 320Glu Glu Thr Glu Lys Thr Ile Pro Val Val Tyr Asn Pro Gly Val Ser325 330 335Asn Ser Tyr Thr Asn Val Asn Gly Ser Ile Glu Thr Phe Asn Lys Glu340 345 350Ser Asn Lys Phe Thr His Ile Ala Tyr Ile Lys Pro Met Asn Gly Asn355 360 365Gln Ser Asn Thr Val Ser Val Thr Gly Thr Leu Thr Glu Gly Ser Asn370 375 380Leu Ala Gly Gly Gln Pro Thr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Gly Lys385 390 395 400Lys Asp Glu Leu Pro Gln Ser Val Tyr Ala Asn Thr Ser Asp Thr Asn
405 410 415Lys Phe Lys Asp Val Thr Lys Glu Met Asn Gly Lys Leu Ser Val Gln420 425 430Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Leu Asn Leu Asp Lys Leu Asp Lys Thr Tyr435 440 445Val Ile His Tyr Thr Gly Glu Tyr Leu Gln Gly Ser Asp Gln Val Asn450 455 460Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Arg Ala Tyr Lys Ser Tyr465 470 475 480Tyr Val Tyr Gly Gly Tyr Arg Leu Thr Trp Asp Asn Gly Leu Val Leu485 490 495Tyr Ser Asn Lys Ala Asp Gly Asn Gly Lys Asn Gly Gln Ile Ile Gln500 505 510Asp Asn Asp Phe Glu Tyr Lys Glu Asp Thr Ala Lys Gly Thr Met Ser515 520 525Gly Gln Tyr Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Glu Glu Asn Gln Asp530 535 540Asn Thr Pro Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Ile Asp Gly Glu Gly545 550 555 560Gly Tyr Val Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu Glu Thr Asp Ser Ser565 570 575Ala Ile Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp Ser Glu Val Gly His580 585 590Val Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser Asn Pro Ile Asp Phe595 600 605Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu610 615 620Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Thr Thr Glu Ser625 630 635 640Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Val Thr Gly645 650 655Ala Val Ser Asp His Thr Thr Ile Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr660 665 670Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly675 680 685Gln Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile690 695 700Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val
705 710 715 720Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu725 730 735Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp740 745 750Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp755 760 765Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Lys Gly Asp770 775 780Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His785 790 795 800Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His805 810 815Gly Phe Asn Lys His Asn Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp820 825 830Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu835 840 845Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile850 855 860Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser865 870 875 880Glu Pro Glu Thr Pro Met Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro885 890 895Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr900 905 910Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr915 920 925Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro930 935 940Thr Pro Glu Val Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala Lys945 950 955 960Glu Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val965 970 975Thr Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro Thr980 985 990Lys Lys Ala Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu995 1000 1005Glu Ser Thr Asn Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile
101010151020Leu Gly Leu Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ala102510301035<210>4<211>1015<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>4Val Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Asp20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn35 40 45Gly Asn Ser Ala Thr Glu Asn Lys Val Asn Glu Thr Gln Thr Thr Thr50 55 60Thr Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ala65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Lys Ala Val Gln Ala Pro Gln Thr Ala Gln Pro Ala Asn Leu Glu Thr100 105 110Val Lys Glu Glu Val Val Lys Glu Glu Ala Lys Pro Gln Val Lys Glu115 120 125Thr Thr Gln Ser Gln Asp Asn Ser Gly Asp Gln Arg Gln Val Asp Leu130135 140Thr Pro Lys Lys Ala Thr Gln Asn Gln Val Ala Glu Thr Gln Val Glu145 150 155 160Val Ala Gln Pro Arg Thr Ala Ser Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg165 170 175Ser Ala Asp Val Val Glu Ala Lys Glu Ala Ser Asp Glu Lys Val Glu180 185 190Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys Val Thr Val Glu Ser Gly Ser Ile195 200 205Glu Ala Pro Gln Gly Asn Lys Val Glu Pro His Ala Gly Gln Arg Val210 215 220Val Leu Lys Tyr Lys Leu Lys Phe Ala Asp Gly Leu Lys Arg Gly Asp225 230 235 240Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asn Asn Val Asn Thr Tyr Gly Val Ser245 250 255
Thr Ala Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Asn Gly Ser Val Val Met Ala260 265 270Thr Gly Glu Ile Leu Gly Asn Gly Asn Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asn275 280 285Glu Ile Glu His Lys Val Glu Val Thr Ala Asn Leu Glu Ile Asn Leu290 295 300Phe Ile Asp Pro Lys Thr Val Gln Ser Asn Gly Glu Gln Lys Ile Thr305 310 315 320Ser Lys Leu Asn Gly Glu Glu Thr Glu Lys Thr Ile Pro Val Val Tyr325 330 335Asn Pro Gly Val Ser Asn Ser Tyr Thr Asn Val Asn Gly Ser Ile Glu340 345 350Thr Phe Asn Lys Glu Ser Asn Lys Phe Thr His Ile Ala Tyr Ile Lys355 360 365Pro Met Asn Gly Asn Gln Ser Asn Thr Val Ser Val Thr Gly Thr Leu370 375 380Thr Glu Gly Ser Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Thr Val Lys Val Tyr385 390 395 400Glu Tyr Leu Gly Lys Lys Asp Glu Leu Pro Gln Ser Val Tyr Ala Asn405 410 415Thr Ser Asp Thr Asn Lys Phe Lys Asp Val Thr Lys Glu Met Asn Gly420 425 430Lys Leu Ser Val Gln Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Leu Asn Leu Asp Lys435 440 445Leu Asp Lys Thr Tyr Val Ile His Tyr Thr Gly Glu Tyr Leu Gln Gly450 455 460Ser Asp Gln Val Asn Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Arg465 470 475 480Ala Tyr Lys Ser Tyr Tyr Val Tyr Gly Gly Tyr Arg Leu Thr Trp Asp485 490 495Asn Gly Leu Val Leu Tyr Ser Asn Lys Ala Asp Gly Asn Gly Lys Asn500 505 510Gly Gln Ile Ile Gln Asn Asn Asp Phe Glu Tyr Lys Glu Asp Thr Ala515 520 525Lys Gly Thr Met Ser Gly Gln Tyr Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr530 535 540Glu Glu Asn Gln Asp Asn Thr Pro Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala545 550 555 560
Ile Asp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu565 570 575Glu Thr Asp Ser Ser Ala Ile Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp580 585 590Ser Glu Ala Gly His Val Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser595 600 605Asn Pro Ile Asp Phe Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His610 615 620Ala Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln625 630 635 640Val Thr Thr Glu Ser Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys645 650 655Gly Ile Val Thr Gly Ala Val Ser Asp His Thr Thr Ile Glu Asp Thr660 665 670Lys Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu675 680 685Pro Glu Glu His Gly Gln Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu690 695 700Asn Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His705 710 715 720Gly Asn Tyr Gly Val Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp725 730 735Ile Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln740 745 750Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly755 760 765Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile Gln Gly770 775 780Gln Asn Asn Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys785 790 795 800Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser805 810 815Val Pro Gln Ile His Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu820 825 830Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser835 840 845Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu850 855 860
Gly Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Thr Pro Pro Thr865 870 875 880Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu885 890 895Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro900 905 910Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ala Glu915 920 925Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala Lys Glu Glu Pro Lys Lys Pro Ser930 935 940Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val Thr Pro Val Ile Glu Ile Asn945 950 955 960Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro Thr Lys Lys Ala Gln Ser Lys Lys965 970 975Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu Glu Ser Thr Asn Lys Gly Met980 985 990Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile Leu Gly Leu Ala Leu Leu Arg Arg995 10001005Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ala10101015<210>5<211>1023<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>5Leu His Leu Lys Gly Asp Ile Ile Val Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly1 5 10 15Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met20 25 30Ile Val Val Gly Met Gly Gln Asp Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln35 40 45Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn Gly Asn Ser Ala Thr Glu Asn Lys50 55 60Val Asn Glu Thr Gln Thr Thr Thr Thr Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu65 70 75 80Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ala Thr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Thr85 90 95Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro Lys Ala Val Gln Ala Pro Gln Thr100 105 110
Ala Gln Pro Ala Asn Leu Glu Thr Val Lys Glu Glu Val Val Lys Glu115 120 125Glu Ala Lys Pro Gln Val Lys Glu Thr Thr Gln Ser Gln Asp Asn Ser130 135 140Gly Asp Gln Arg Gln Val Asp Leu Thr Pro Lys Lys Ala Thr Gln Asn145 150 155 160Gln Val Ala Glu Thr Gln Val Glu Val Ala Gln Pro Arg Thr Ala Ser165 170 175Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg Ser Ala Asp Val Val Glu Ala Lys180 185 190Glu Ala Ser Asp Glu Lys Val Glu Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys195 200 205Val Thr Val Glu Ser Gly Ser Ile Glu Ala Pro Gln Gly Asn Lys Val210 215 220Glu Pro His Ala Gly Gln Arg Val Val Leu Lys Tyr Lys Leu Lys Phe225 230 235 240Ala Asp Gly Leu Lys Arg Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asn245 250 255Asn Val Asn Thr Tyr Gly Val Ser Thr Ala Arg Lys Val Pro Glu Ile260 265 270Lys Asn Gly Ser Val Val Met Ala Thr Gly Glu Ile Leu Gly Asn Gly275 280 285Asn Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asn Glu Ile Glu His Lys Val Glu Val290 295 300Thr Ala Asn Leu Glu Ile Asn Leu Phe Ile Asp Pro Lys Thr Val Gln305 310 315 320Ser Asn Gly Glu Gln Lys Ile Thr Ser Lys Leu Asn Gly Glu Glu Thr325 330 335Glu Lys Thr Ile Pro Val Val Tyr Asn Pro Gly Val Ser Asn Ser Tyr340 345 350Thr Asn Val Asn Gly Ser Ile Glu Thr Phe Asn Lys Glu Ser Asn Lys355 360 365Phe Thr His Ile Ala Tyr Ile Lys Pro Met Asn Gly Asn Gln Ser Asn370 375 380Thr Val Ser Val Thr Gly Thr Leu Thr Glu Gly Ser Asn Leu Ala Gly385 390 395 400Gly Gln Pro Thr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Gly Lys Lys Asp Glu405 410 415
Leu Pro Gln Ser Val Tyr Ala Asn Thr Ser Asp Thr Asn Lys Phe Lys420 425 430Asp Val Thr Lys Glu Met Asn Gly Lys Leu Ser Val Gln Asp Asn Gly435 440 445Ser Tyr Ser Leu Asn Leu Asp Lys Leu Asp Lys Thr Tyr Val Ile His450 455 460Tyr Thr Gly Glu Tyr Leu Gln Gly Ser Asp Gln Val Asn Phe Arg Thr465 470 475 480Glu Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Arg Ala Tyr Lys Ser Tyr Tyr Val Tyr485 490 495Gly Gly Tyr Arg Leu Thr Trp Asp Asn Gly Leu Val Leu Tyr Ser Asn500 505 510Lys Ala Asp Gly Asn Gly Lys Asn Gly Gln Ile Ile Gln Asn Asn Asp515 520 525Phe Glu Tyr Lys Glu Asp Thr Ala Lys Gly Thr Met Ser Gly Gln Tyr530 535 540Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Glu Glu Asn Gln Asp Asn Thr Pro545 550 555 560Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Ile Asp Gly Glu Gly Gly Tyr Val565 570 575Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu Glu Thr Asp Ser Ser Ala Ile Asp580 585 590Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp Ser Glu Ala Gly His Val Gly Gly595 600 605Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser Asn Pro Ile Asp Phe Glu Glu Ser610 615 620Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu625 630 635 640Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Thr Thr Glu Ser Asn Leu Val645 650 655Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Val Thr Gly Ala Val Ser660 665 670Asp His Thr Thr Ile Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn675 680 685Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly Gln Ala Gln690 695 700Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile Ser His Ser705 710 715 720
Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val Ile Glu Glu725 730 735Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu740 745 750Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu755 760 765Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe770 775 780Asp Ser Val Pro Gln Ile Gln Gly Gln Asn Asn Gly Asn Gln Ser Phe785 790 795 800Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn805 810 815Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Phe Asn820 825 830Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn835 840 845Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu850 855 860Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp865 870 875 880Thr Thr Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu885 890 895Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro900 905 910Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro915 920 925Pro Thr Pro Glu Val Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala930 935 940Lys Glu Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val945 950 955 960Val Thr Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro965 970 975Thr Lys Lys Ala Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly980 985 990Glu Glu Ser Thr Asn Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile995 10001005Leu Gly Leu Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ala101010151020
<210>6<211>1018<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>6Val Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Asp20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn35 40 45Gly Asn Ser Ala Thr Asp Asn Lys Thr Ser Glu Thr Gln Thr Thr Ala50 55 60Thr Asn Val Asn His Ile Glu Glu Thr Gln Ser Tyr Asn Ala Thr Val65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Lys Ala Val Gln Ala Pro Gln Thr Ala Gln Pro Ala Asn Ile Glu Thr100 105 110Val Lys Glu Glu Val Val Lys Glu Glu Ala Lys Pro Gln Val Lys Glu115 120 125Thr Thr Gln Ser Gln Asp Asn Ser Gly Asp Gln Arg Gln Val Asp Leu130 135 140Thr Pro Lys Lys Ala Thr Gln Asn Gln Val Ala Glu Thr Gln Val Glu145 150 155 160Val Ala Gln Pro Arg Thr Ala Ser Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg165 170 175Ser Ala Asp Val Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ser Asn Ala Lys Val Glu180 185 190Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys Val Thr Val Glu Ile Gly Ser Ile195 200 205Glu Gly His Asn Asn Thr Asn Lys Val Glu Pro His Ala Gly Gln Arg210 215 220Ala Val Leu Lys Tyr Lys Leu Lys Phe Glu Asn Gly Leu His Gln Gly225 230 235 240Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asn Asn Val Asn Thr His Gly Val245 250 255Ser Thr Ala Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Asn Gly Ser Val Val Met260 265 270
Ala Thr Gly Glu Val Leu Glu Gly Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Phe Thr275 280 285Asn Asp Ile Glu Asp Lys Val Asp Val Thr Ala Glu Leu Glu Ile Asn290 295 300Leu Phe Ile Asp Pro Lys Thr Val Gln Thr Asn Gly Asn Gln Thr Ile305 310 315 320Thr Ser Thr Leu Asn Glu Glu Gln Thr Ser Lys Glu Leu Asp Val Lys325 330 335Tyr Lys Asp Gly Ile Gly Asn Tyr Tyr Ala Asn Leu Asn Gly Ser Ile340 345 350Glu Thr Phe Asn Lys Ala Asn Asn Arg Phe Ser His Val Ala Phe Ile355 360 365Lys Pro Asn Asn Gly Lys Thr Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Thr Leu370 375 380Met Lys Gly Ser Asn Gln Asn Gly Asn Gln Pro Lys Val Arg Ile Phe385 390 395 400Glu Tyr Leu Gly Asn Asn Glu Asp Ile Ala Lys Ser Val Tyr Ala Asn405 410 415Thr Thr Asp Thr Ser Lys Phe Lys Glu Val Thr Ser Asn Met Ser Gly420 425 430Asn Leu Asn Leu Gln Asn Asn Gly Ser Tyr Ser Leu Asn Ile Glu Asn435 440 445Leu Asp Lys Thr Tyr Val Val His Tyr Asp Gly Glu Tyr Leu Asn Gly450 455 460Thr Asp Glu Val Asp Phe Arg Thr Gln Met Val Gly His Pro Glu Gln465 470 475 480Leu Tyr Lys Tyr Tyr Tyr Asp Arg Gly Tyr Thr Leu Thr Trp Asp Asn485 490 495Gly Leu Val Leu Tyr Ser Asn Lys Ala Asn Gly Asn Gly Lys Asn Gly500 505 510Pro Ile Ile Gln Asn Asn Lys Phe Glu Tyr Lys Glu Asp Thr Ile Lys515 520 525Glu Thr Leu Thr Gly Gln Tyr Asp Lys Asn Leu Val Thr Thr Val Glu530 535 540Glu Glu Tyr Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Ile545 550 555 560Asp Gly Gly Gly Gly Tyr Val Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu Glu565 570 575
Thr Asp Ser Ser Ala Ile Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp Ser580 585 590Glu Ala Gly His Val Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser Asn595 600 605Pro Ile Asp Phe Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala610 615 620Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val625 630 635 640Thr Thr Glu Ser Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly645 650 655Ile Val Thr Gly Ala Val Ser Asp His Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys660 665 670Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro675 680 685Glu Glu His Gly Gln Ala Gln Gly Pro Val Glu Glu Ile Thr Glu Asn690 695 700Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly705 710 715 720Asn Tyr Asp Val Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile725 730 735Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser740 745 750Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly755 760 765Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln770 775 780Asn Lys Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro785 790 795800Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val805 810 815Pro His Ile His Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp820 825 830Thr Asn Lys Asp Lys Pro Ser Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val835 840 845Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly850 855 860Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Ile Val Pro Pro Thr865 870 875 880
Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro885 890 895Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro900 905 910Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val915 920 925Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala Lys Glu Glu Pro Lys930 935 940Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val Thr Pro Val Ile945 950 955 960Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro Thr Lys Lys Pro Gln965 970 975Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu Glu Ser Thr Asn980 985 990Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile Leu Gly Leu Ala Leu995 10001005Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn His Lys Ala10101015<210>7<211>1018<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>7Val Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Asp20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn35 40 45Gly Asn Ser Ala Thr Asp Asn Lys Thr Ser Glu Thr Gln Thr Thr Ala50 55 60Thr Asn Val Asn His Ile Glu Glu Thr Gln Ser Tyr Asn Ala Thr Val65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Lys Ala Val Gln Ala Pro Gln Thr Ala Gln Pro Ala Asn Ile Glu Thr100 105 110Val Lys Glu Glu Val Val Lys Glu Glu Ala Lys Pro Gln Val Lys Glu115 120 125Thr Thr Gln Ser Gln Asp Asn Ser Gly Asp Gln Arg Gln Val Asp Leu
130 135 140Thr Pro Lys Lys Ala Thr Gln Asn Gln Val Ala Glu Thr Gln Val Glu145 150 155 160Val Ala Gln Pro Arg Thr Ala Ser Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg165 170 175Ser Ala Asp Val Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ser Asn Ala Lys Val Glu180 185 190Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys Val Thr Val Glu Ile Gly Ser Ile195 200 205Glu Gly His Asn Asn Thr Asn Lys Val Glu Pro His Ala Gly Gln Arg210 215 220Ala Val Leu Lys Tyr Lys Leu Lys Phe Glu Asn Gly Leu His Gln Gly225 230 235 240Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asn Asn Val Asn Thr His Gly Val245 250 255Ser Thr Ala Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Asn Gly Ser Val Val Met260 265 270Ala Thr Gly Glu Val Leu Glu Gly Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Phe Thr275 280 285Asn Asp Ile Glu Asp Lys Val Asp Val Thr Ala Glu Leu Glu Ile Asn290 295 300Leu Phe Ile Asp Pro Lys Thr Val Gln Thr Asn Gly Asn Gln Thr Ile305 310 315 320Thr Ser Thr Leu Asn Glu Glu Gln Thr Ser Lys Glu Leu Asp Val Lys325 330 335Tyr Lys Asp Gly Ile Gly Asn Tyr Tyr Ala Asn Leu Asn Gly Ser Ile340 345 350Glu Thr Phe Asn Lys Ala Asn Asn Arg Phe Ser His Val Ala Phe Ile355 360 365Lys Pro Asn Asn Gly Lys Thr Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Thr Leu370 375 380Met Lys Gly Ser Asn Gln Asn Gly Asn Gln Pro Lys Val Arg Ile Phe385 390 395 400Glu Tyr Leu Gly Asn Asn Glu Asp Ile Ala Lys Ser Val Tyr Ala Asn405 410 415Thr Thr Asp Thr Ser Lys Phe Lys Glu Val Thr Ser Asn Met Ser Gly420 425 430Asn Leu Asn Leu Gln Asn Asn Gly Ser Tyr Ser Leu Asn Ile Glu Asn
435 440 445Leu Asp Lys Thr Tyr Val Val His Tyr Asp Gly Glu Tyr Leu Asn Gly450 455 460Thr Asp Glu Val Asp Phe Arg Thr Gln Met Val Gly His Pro Glu Gln465 470 475 480Leu Tyr Lys Tyr Tyr Tyr Asp Arg Gly Tyr Thr Leu Thr Trp Asp Asn485 490 495Gly Leu Val Leu Tyr Ser Asn Lys Ala Asn Gly Asn Glu Lys Asn Gly500 505 510Pro Ile Ile Gln Asn Asn Lys Phe Glu Tyr Lys Glu Asp Thr Ile Lys515 520 525Glu Thr Leu Thr Gly Gln Tyr Asp Lys Asn Leu Val Thr Thr Val Glu530 535 540Glu Glu Tyr Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Ile545 550 555 560Asp Gly Gly Gly Gly Tyr Val Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu Glu565 570 575Thr Asp Ser Ser Ala Ile Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp Ser580 585 590Glu Ala Gly His Val Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser Asn595 600 605Pro Ile Asp Phe Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala610 615 620Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val625 630 635 640Thr Thr Glu Ser Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly645 650 655Ile Val Thr Gly Ala Val Ser Asp His Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys660 665 670Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro675 680 685Glu Glu His Gly Gln Ala Gln Gly Pro Val Glu Glu Ile Thr Lys Asn690 695 700Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly705 710 715 720Asn Tyr Asp Val Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile725 730 735Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser
740 745 750Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly755 760 765Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln770 775 780Asn Lys Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro785 790 795 800Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val805 810 815Pro His Ile His Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp820 825 830Thr Asn Lys Asp Lys Pro Ser Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val835 840 845Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly850 855 860Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Ile Val Pro Pro Thr865 870 875 880Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro885 890 895Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro900 905 910Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val915 920 925Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala Lys Glu Glu Pro Lys930 935 940Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val Thr Pro Val Ile945 950 955 960Glu Tle Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro Thr Lys Lys Pro Gln965 970 975Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu Glu Ser Thr Asn980 985 990Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile Leu Gly Leu Ala Leu995 10001005Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn His Lys Ala10101015<210>8<211>973<212>PRT<213>Staphylococcus aureus
<400>8Leu His Leu Lys Gly Asp Ile Ile Val Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly1 5 10 15Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met20 25 30Ile Val Ile Gly Met Gly Gln Asp Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln35 40 45Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn Gly Asn Ser Ala Thr Asp Asn Lys50 55 60Val Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr Thr Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu65 70 75 80Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ala Thr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Thr85 90 95Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro Lys Ala Val Gln Ala Pro Gln Thr100 105 110Ala Gln Pro Ala Asn Val Glu Thr Val Lys Glu Glu Val Val Lys Glu115 120 125Glu Ala Asn Pro Gln Val Lys Glu Thr Thr Gln Ser Gln Asp Asn Ser130 135 140Gly Asp Gln Arg Gln Val Asp Leu Thr Pro Lys Lys Ala Thr Gln Asn145 150 155 160Gln Val Ala Glu Thr Gln Val Glu Val Ala Gln Pro Arg Thr Ala Leu165 170 175Glu Ser Lys Pro Arg Val Thr Arg Ser Thr Asp Val Ala Glu Ala Lys180 185 190Glu Ala Ser Asp Ala Lys Val Glu Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys195 200 205Val Thr Val Glu Asp Glu Ser Lys Ile Glu Ala Pro Lys Gly Asn Asn210 215 220Val Gln Pro His Glu Gly Gln Arg Val Val Leu Lys Tyr Lys Leu Lys225 230 235 240Phe Gln Asp Gly Leu Lys Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser245 250 255Asn Asn Val Asn Thr His Gly Val Ala Thr Thr Arg Lys Val Pro Asp260 265 270Ile Lys Asn Gly Ser Leu Val Met Ala Lys Gly Gln Val Leu Asp Asn275 280 285Gly Arg Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Lys Asp Lys Val Asn290 295 300
Val Thr Ala Asn Leu Glu Ile Asn Leu Phe Ile Asp Pro Lys Thr Val305 310 315 320Gln Ser Asn Gly Gln Gln Thr Ile Thr Ser Lys Leu Asn Gly Lys Glu325 330 335Thr Ser Gly Thr Met Gln Ile Thr Tyr Lys Asp Gly Val Lys Asn Gln340 345 350Tyr Thr Asn Val Asn Gly Ser Ile Glu Thr Phe Asp Lys Glu Lys Asn355 360 365Lys Phe Thr His Val Ala Tyr Ile Lys Pro Ile Asn Gly Asn Asn Ser370 375 380Asp Ser Val Thr Val Thr Gly Met Leu Thr Gln Gly Ser Asn Glu Asn385 390 395 400Gly Thr Gln Pro Asn Val Lys Ile Tyr Glu Tyr Val Gly Val Glu Asn405 410 415Gly Leu Pro Gln Ser Val Tyr Ala Asn Thr Val Asp Ser Thr Gln Leu420 425 430Lys Asp Val Thr Asn Gln Met Gly Asp Lys Leu Lys Val Gln Asn Asn435 440 445Gly Ser Tyr Ser Leu Asn Phe Asp Lys Leu Asp Lys Thr Tyr Val Ile450 455 460His Tyr Thr Gly Asp Tyr Leu Asn Gly Thr Ser Glu Val Asn Phe Arg465 470 475 480Thr Gln Leu Thr Gly Tyr Pro Glu Asn Arg Tyr Lys Thr Tyr Tyr Tyr485 490 495Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr Leu Thr Trp Asp Asn Gly Leu Val Leu Tyr500 505 510Ser Asn Lys Ala Asn Gly Asp Gly Lys Tyr Gly Pro Ile Val Asp Ser515 520 525Asn Asn Phe Glu Phe Ser Glu Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Ser Gly530 535 540Gln Tyr Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Glu Glu Asn Gln Asp Asn545 550 555 560Thr Pro Leu Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Ile Asp Gly Glu Gly Gly565 570 575Tyr Val Asp Gly Tyr Ile Glu Thr Ile Glu Glu Thr Asp Ser Ser Ala580 585 590Ile Asp Ile Asp Tyr His Thr Ala Val Asp Ser Glu Ala Gly His Val595 600 605
Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Glu Ser Asn Pro Ile Asp Phe Glu610 615 620Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu Tyr625 630 635 640Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Thr Thr Glu Ser Asn645 650 655Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Val Thr Gly Ala660 665 670Val Ser Asp His Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr Glu675 680 685Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly Gln690 695 700Ala Gln Gly Pro Val Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile Ser705 710 715 720His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val Ile725 730 735Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu Gly740 745 750Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr755 760 765Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile770 775 780Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Phe Asn Lys His Asn Glu785 790 795 800Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly805 810 815Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser820 825 830Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro835 840 845Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly Thr Pro Thr Pro850 855 860Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly Lys Pro Thr Pro Pro Thr865 870 875 880Pro Glu Val Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala Lys Glu885 890 895Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val Thr900 905 910
Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro Thr Lys915 920 925Gln Lys Gln Ala Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu Glu930 935 940Ser Thr Asn Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile Leu Gly945 950 955 960Leu Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn His Lys Ala965 970<210>9<211>961<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>9Val Lys Ser Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Glu20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Asn Asn Thr Thr Val Glu Glu Ser35 40 45Gly Ser Ser Ala Thr Glu Ser Lys Ala Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr50 55 60Asn Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ser65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Lys Ser Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Thr Thr Val Gln Ala Pro Lys Val Glu Thr Glu Met Lys Ser Gln Glu100 105 110Asp Leu Pro Ser Glu Lys Val Ala Asp Lys Glu Thr Thr Gly Thr Gln115 120 125Val Asp Ile Ala Gln Pro Ser Asn Val Ser Glu Ile Lys Pro Arg Met130 135 140Lys Arg Ser Ala Asp Val Thr Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Ala Glu145 150 155 160Glu Ala Lys Ala Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Lys Val Glu Val Thr165 170 175Glu Ser Ser Leu Glu Gly His Asn Lys Asp Ser Asn Ile Val Asn Pro180 185 190His Asn Ala Gln Arg Val Thr Leu Lys Tyr Lys Trp Lys Phe Gly Glu195 200 205
Gly Ile Lys Ala Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asp Asn Val210 215 220Glu Thr His Gly Ile Ser Thr Leu Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Ser225 230 235 240Ser Thr Glu Asp Lys Val Met Ala Asn Gly Gln Val Ile Asn Glu Arg245 250 255Thr Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Lys Asp Leu260 265 270Thr Ala Glu Leu Asn Leu Asn Leu Phe Ile Asp Pro Thr Thr Val Thr275 280 285Lys Gln Gly Ser Gln Lys Val Glu Val Thr Leu Gly Gln Asn Lys Val290 295 300Ser Lys Glu Phe Asp Ile Lys Tyr Leu Asp Gly Val Lys Asp Arg Met305 310 315 320Gly Val Thr Val Asn Gly Arg Ile Asp Thr Leu Asn Lys Glu Glu Gly325 330 335Lys Phe Ser His Phe Ala Tyr Val Lys Pro Asn Asn Gln Ser Leu Thr340 345 350Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Val Thr Ser Gly Tyr Lys Gln Ser Ala355 360 365Asn Asn Pro Thr Val Lys Val Tyr Lys His Ile Gly Ser Asp Glu Leu370 375 380Ala Glu Ser Val Tyr Ala Lys Leu Asp Asp Thr Ser Lys Phe Glu Asp385 390 395 400Val Thr Glu Lys Val Asn Leu Ser Tyr Thr Ser Asn Gly Gly Tyr Thr405 410 415Leu Asn Leu Gly Asp Leu Asp Asn Ser Lys Asp Tyr Val Ile Lys Tyr420 425 430Glu Gly Glu Tyr Asp Gln Asn Ala Lys Asp Leu Asn Phe Arg Thr His435 440 445Leu Ser Gly Tyr His Lys Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Pro Tyr450 455 460Tyr Pro Val Gln Leu Thr Trp Asn Asn Gly Val Ala Phe Tyr Ser Asn465 470 475 480Asn Ala Lys Gly Asp Gly Lys Asp Lys Pro Asn Asp Pro Ile Ile Glu485 490 495Lys Ser Glu Pro Ile Asp Leu Asp Ile Lys Ser Glu Pro Pro Val Glu500 505 510
Lys His Glu Leu Thr Gly Thr Ile Glu Glu Ser Asn Asp Ser Lys Pro515 520 525Ile Asp Phe Glu Tyr His Thr Ala Val Glu Gly Ala Glu Gly His Ala530 535 540Glu Gly Ile Ile Glu Thr Glu Glu Asp Ser Ile His Val Asp Phe Glu545 550 555 560Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu Tyr565 570 575Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Thr Thr Glu Ser Asn580 585 590Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser ThrLys Gly Ile Val Thr Gly Ala595 600605Val Ser Asp His Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr Glu610 615 620Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly Gln625 630 635 640Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile Ser645 650 655His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val Ile660 665 670Asp Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu Gly675 680 685Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr690 695 700Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile705 710 715 720Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Asn Gly Asn Gln725 730 735Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly740 745 750Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly755 760 765Phe Asn Lys His Asn Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys770 775 780Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp785 790 795 800Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile Glu805 810 815
Glu Asp Thr Thr Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu820 825 830Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly835 840 845Glu Pro Thr Pro Pro Lys Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro850 855 860Val Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro865 870 875 880Pro Ala Lys Glu Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly885 890 895Lys Val Val Thr Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val900 905 910Ala Pro Thr Lys Gln Lys Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr915 920 925Gly Gly Glu Glu Ser Thr Asn Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe930 935 940Ser Ile Leu Gly Leu Val Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn Asn Lys945 950 955 960Ala<210>10<211>961<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>10Val Lys Ser Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Glu20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Asn Asn Thr Thr Val Glu Glu Ser35 40 45Gly Ser Ser Ala Thr Glu Ser Lys Ala Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr50 55 60Asn Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ser65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Lys Ser Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Thr Thr Val Gln Ala Pro Lys Val Glu Thr Glu Met Lys Ser Gln Glu100 105 110
Asp Leu Pro Ser Glu Lys Val Ala Asp Lys Glu Thr Thr Gly Thr Gln115 120 125Val Asp Ile Ala Gln Pro Ser Asn Val Ser Glu Ile Lys Pro Arg Met130 135 140Lys Arg Ser Ala Asp Val Thr Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Ala Glu145 150 155 160Glu Ala Lys Ala Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Lys Val Glu Val Thr165 170 175Glu Ser Ser Leu Glu Gly His Asn Lys Asp Ser Asn Ile Val Asn Pro180 185 190His Asn Ala Gln Arg Val Thr Leu Lys Tyr Lys Trp Lys Phe Gly Glu195 200 205Gly Ile Lys Ala Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asp Asn Val210 215 220Glu Thr His Gly Ile Ser Thr Leu Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Ser225 230 235 240Ser Thr Glu Asp Lys Val Met Ala Asn Gly Gln Val Ile Asn Glu Arg245 250 255Thr Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Lys Asp Leu260 265 270Thr Ala Glu Leu Asn Leu Asn Leu Phe Ile Asp Pro Thr Thr Val Thr275 280 285Lys Gln Gly Ser Gln Lys Val Glu Val Thr Leu Gly Gln Asn Lys Val290 295 300Ser Lys Glu Phe Asp Ile Lys Tyr Leu Asp Gly Val Lys Asp Arg Met305 310 315 320Gly Val Thr Val Asn Gly Arg Ile Asp Thr Leu Asn Lys Glu Glu Gly325 330 335Lys Phe Ser His Phe Ala Tyr Val Lys Pro Asn Asn Gln Ser Leu Thr340 345 350Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Val Thr Ser Gly Tyr Lys Gln Ser Ala355 360 365Asn Asn Pro Thr Val Lys Val Tyr Lys His Ile Gly Ser Asp Glu Leu370 375 380Ala Glu Ser Val Tyr Ala Lys Leu Asp Asp Thr Ser Lys Phe Glu Asp385 390 395 400Val Thr Glu Lys Val Asn Leu Ser Tyr Thr Ser Asn Gly Gly Tyr Thr405 410 415
Leu Asn Leu Gly Asp Leu Asp Asn Ser Lys Asp Tyr Val Ile Lys Tyr420 425 430Glu Gly Glu Tyr Asp Gln Asn Ala Lys Asp Leu Asn Phe Arg Thr His435 440 445Leu Ser Gly Tyr His Lys Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Pro Tyr450 455 460Tyr Pro Val Gln Leu Thr Trp Asn Asn Gly Val Ala Phe Tyr Ser Asn465 470 475 480Asn Ala Lys Gly Asp Gly Lys Asp Lys Pro Asn Asp Pro Ile Ile Glu485 490 495Lys Ser Glu Pro Ile Asp Leu Asp Ile Lys Ser Glu Pro Pro Val Glu500 505 510Lys His Glu Leu Thr Gly Thr Ile Glu Glu Ser Asn Asp Ser Lys Pro515 520 525Ile Asp Phe Glu Tyr His Thr Ala Val Glu Gly Ala Glu Gly His Ala530 535 540Glu Gly Ile Ile Glu Thr Glu Glu Asp Ser Ile His Val Asp Phe Glu545 550 555 560Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu Tyr565 570 575Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Thr Thr Glu Ser Asn580 585 590Leu Val Glu Phe Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Val Thr Gly Ala595 600 605Val Ser Asp His Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr Glu610 615 620Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly Gln625 630 635 640Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile Ser645 650 655His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val Ile660 665 670Asp Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu Gly675 680 685Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr690 695 700Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile705 710 715 720
Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Asn Gly Asn Gln725 730 735Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly740 745 750Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly755 760 765Phe Asn Lys His Asn Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys770 775 780Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp785 790 795 800Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile Glu805 810 815Glu Asp Thr Thr Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu820 825 830Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly835 840 845Glu Pro Thr Pro Pro Lys Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro850 855 860Val Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro865 870 875 880Pro Ala Lys Glu Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly885 890 895Lys Val Val Thr Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val900 905 910Ala Pro Thr Lys Gln Lys Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr915 920 925Gly Gly Glu Glu Ser Thr Asn Lys Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe930 935 940Ser Ile Leu Gly Leu Val Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn Asn Lys945 950 955 960Ala<210>11<211>943<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>11Val Lys Ser Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Glu
20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Asn Asn Thr Thr Val Glu Glu Ser35 40 45Gly Ser Ser Ala Thr Glu Arg Lys Ala Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr50 55 60Asn Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ser65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Thr Thr Val Gln Ala Pro Lys Val Glu Thr Ser Arg Val Asp Leu Pro100 105 110Ser Glu Lys Val Ala Asp Lys Glu Thr Thr Gly Thr Gln Val Asp Thr115 120 125Ala Gln Pro Ser Asn Val Ser Glu Ile Lys Pro Arg Met Lys Arg Ser130 135 140Thr Asp Val Thr Ala Val Thr Glu Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Lys145 150 155 160Ala Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys Val Glu Val Glu Glu Gly Ser165 170 175Glu Ile Val Gly His Asn Asn Lys Glu Thr Asn Val Val Asn Pro His180 185 190Asn Ala Glu Arg Val Thr Leu Lys Tyr Lys Trp Lys Phe Glu Asp Gly195 200 205Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asn Asn Val Glu210 215 220Thr His Gly Ile Ser Pro Leu Arg Lys Val Pro Asp Ile Lys Ser Lys225 230 235 240Asp Asp Asn Ile Leu Ala Val Gly Lys Val Met Asp Glu Arg Lys Ile245 250 255Arg Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Asn Asn Leu Met Ala260 265 270Glu Leu Asn Leu Asn Leu Phe Ile Asp Pro Thr Thr Val Thr Lys Gln275 280 285Gly Lys Gln Thr Val Glu Val Lys Leu Gly Glu Asn Lys Ile Ser Lys290 295 300Glu Phe Asp Ile Lys Tyr Leu Asp Gly Val Lys Asp Asn Trp Gly Val305 310 315 320Thr Val Asn Gly Arg Ile Thr Leu Leu Asp Lys Glu Asn Ser Lys Ile
325 330 335His His Leu Ala Tyr Ile Asn Pro Lys Lys Ser Asp Met Thr Ser Ile340 345 350Thr Ile Asn Gly Phe Phe Ala Lys Gly Gly Leu Tyr Thr Gly Asn Val355 360 365Pro Thr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Arg Ser Asp Glu Leu Pro Glu370 375 380Ser Val Tyr Ala Asn Thr Asn Asp Gln Glu Lys Phe Lys Asp Val Thr385 390 395 400Asn Asp Met Ser Asp Lys Leu Thr Leu Ser Glu Asn Gly Ser Tyr Lys405 410 415Leu Thr Leu Asp Ala Leu Asn Lys Lys Ser Tyr Val Val Ser Phe Glu420 425 430Gly Lys Tyr Asn Glu Asn Asp Lys Glu Leu Leu Phe Arg Thr Asn Leu435 440 445His Gly Tyr His Ala Asn Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Val Ser450 455 460Leu Thr Trp Asp Asn Gly Val Ala Phe Tyr Ser Asn Asn Ala Gln Gly465 470 475 480Asp Gly Lys Asp Lys Pro Asn Asp Pro Ile Ile Glu Lys Ser Glu Pro485 490 495Ile Glu Leu Asp Ile Lys Ser Glu Pro Pro Val Glu Lys His Glu Leu500 505 510Thr Gly Thr Ile Glu Glu Ser Asn Asp Ser Lys Pro Ile Asp Phe Glu515 520 525Tyr His Thr Ala Val Glu Gly Val Glu Gly His Ala Glu Gly Ile Ile530 535 540Glu Thr Glu Glu Asp Ser Ile His Val Asp Phe Glu Glu Ser Thr His545 550 555 560Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu Asp Thr565 570 575Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Ile Thr Glu Ser Asn Leu Val Glu Phe580 585 590Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Leu Thr Gly Ala Val Ser Asp His595 600 605Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn Leu Ile610 615 620Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly Gln Ala Gln Gly Pro
625 630 635 640Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu645 650 655Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val Ile Glu Glu Ile Glu660 665 670Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly675 680 685Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys690 695 700Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser705 710 715 720Val Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Lys Gly Asp Gln Ser Phe Glu Glu725 730 735Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile740 745 750Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro His Ile His Gly Phe Asn Lys His755 760 765Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln770 775 780Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Gln785 790 795 800Val Ser Gly His Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr805 810 815Leu Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro820 825 830Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro835 840 845Pro Thr Pro Glu Val Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala850 855 860Lys Glu Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val865 870 875 880Val Thr Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro885 890 895Thr Lys Lys Ala Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly900 905 910Glu Glu Ser Thr Asn Lys Gly Ile Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile915 920 925Leu Gly Phe Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn His Lys Ala
930 935 940<210>12<211>957<2l2>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>12Val Lys Ser Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Glu20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Asn Asn Thr Thr Val Glu Glu Ser35 40 45Gly Ser Ser Ala Thr Glu Arg Lys Ala Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr50 55 60Asn Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ser65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Thr Thr Val Gln Ala Pro Lys Val Glu Thr Ser Arg Val Asp Leu Pro100 105 110Ser Glu Lys Val Ala Asp Lys Glu Thr Thr Gly Thr Gln Val Asp Thr115 120 125Ala Gln Pro Ser Asn Val Ser Glu Ile Lys Pro Arg Met Lys Arg Ser130 135 140Thr Asp Val Thr Ala Val Thr Glu Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Lys145 150 155 160Ala Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys Val Glu Val Glu Glu Gly Ser165 170 175Glu Ile Val Gly His Asn Asn Lys Glu Thr Asn Val Val Asn Pro His180 185 190Asn Ala Glu Arg Val Thr Leu Lys Tyr Lys Trp Lys Phe Glu Asp Gly195 200 205Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asn Asn Val Glu210 215 220Thr His Gly Ile Ser Pro Leu Arg Lys Val Pro Asp Ile Lys Ser Lys225 230 235 240Asp Asp Asn Ile Leu Ala Val Gly Lys Val Met Asp Glu Arg Lys Ile245 250 255Arg Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Asn Asn Leu Met Ala260 265 270
Glu Leu Asn Leu Asn Leu Phe Ile Asp Pro Thr Thr Val Thr Lys Gln275 280 285Gly Lys Gln Thr Val Glu Val Lys Leu Gly Glu Asn Lys Ile Ser Lys290 295 300Glu Phe Asp Ile Lys Tyr Leu Asp Gly Val Lys Asp Asn Trp Gly Val305 310 315 320Thr Val Asn Gly Arg Ile Thr Leu Leu Asp Lys Glu Asn Ser Lys Ile325 330 335His His Leu Ala Tyr Ile Asn Pro Lys Lys Ser Asp Met Thr Ser Ile340 345 350Thr Ile Asn Gly Phe Phe Ala Lys Gly Gly Leu Tyr Thr Gly Asn Val355 360 365Pro Thr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Arg Ser Asp Glu Leu Pro Glu370 375 380Ser Val Tyr Ala Asn Thr Asn Asp Gln Glu Lys Phe Lys Asp Val Thr385 390 395 400Asn Asp Met Ser Asp Lys Leu Thr Leu Ser Glu Asn Gly Ser Tyr Lys405 410 415Leu Thr Leu Asp Ala Leu Asn Lys Lys Ser Tyr Val Val Ser Phe Glu420 425 430Gly Lys Tyr Asn Glu Asn Asp Lys Glu Leu Leu Phe Arg Thr Asn Leu435 440 445His Gly Tyr His Ala Asn Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Val Ser450 455 460Leu Thr Trp Asp Asn Gly Val Ala Phe Tyr Ser Asn Asn Ala Gln Gly465 470 475 480Asp Gly Lys Asp Lys Pro Asn Asp Pro Ile Ile Glu Lys Ser Glu Pro485 490 495Ile Glu Leu Asp Ile Lys Ser Glu Pro Pro Val Glu Lys His Glu Leu500 505 510Thr Gly Thr Ile Glu Glu Ser Asn Asp Ser Lys Pro Ile Asp Phe Glu515 520 525Tyr His Thr Ala Val Glu Gly Val Glu Gly His Ala Glu Gly Ile Ile530 535 540Glu Thr Glu Glu Asp Ser Ile His Val Asp Phe Glu Glu Ser Thr His545 550 555 560Glu Asn Ser Lys His His Ala Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu Asp Thr565 570 575
Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val Ile Thr Glu Ser Asn Leu Val Glu Phe580 585 590Asp Glu Glu Ser Thr Lys Gly Ile Leu Thr Gly Ala Val Ser Asp His595 600 605Thr Thr Val Glu Asp Thr Lys Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn Leu Ile610 615 620Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro Glu Glu His Gly Gln Ala Gln Gly Pro625 630 635 640Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu645 650 655Gly Thr Glu Asn Gly His Gly Asn Tyr Gly Val Ile Glu Glu Ile Glu660 665 670Glu Asn Ser His Val Asp Ile Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly675 680 685Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys690 695 700Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser705 710 715 720Val Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Lys Gly Asp Gln Ser Phe Glu Glu725 730 735Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile740 745 750Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro His Ile His Gly Phe Asn Lys His755 760 765Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln770 775 780Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Gln785 790 795 800Val Ser Gly His Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr805 810 815Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro820 825 830Thr Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro835 840 845Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr850 855 860Pro Glu Val Pro Ala Glu Pro Gly Lys Pro Val Pro Pro Ala Lys Glu865 870 875 880
Glu Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val Thr885 890 895Pro Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Ala Pro Thr Lys900 905 910Lys Ala Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu Glu915 920 925Ser Thr Asn Lys Gly Ile Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile Leu Gly930 935 940Phe Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn His Lys Ala945 950 955<210>13<211>940<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>13Val Lys Ser Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Glu20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Asn Asn Thr Thr Val Glu Glu Ser35 40 45Gly Ser Ser Ala Thr Glu Ser Lys Ala Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr50 55 60Asn Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ser65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Lys Thr Val Gln Ala Pro Lys Val Glu Thr Ser Arg Val Asp Leu Pro100 105 110Ser Glu Lys Val Ala Asp Lys Glu Thr Thr Gly Thr Gln Val Asp Ile115 120 125Ala Gln Pro Ser Asn Val Ser Glu Ile Lys Pro Arg Met Lys Arg Ser130 135 140Thr Asp Val Thr Ala Val Ala Glu Lys Glu Val Val Glu Glu Thr Lys145 150 155 160Ala Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Lys Val Glu Val Glu Glu Gly Ser165 170 175Glu Ile Val Gly His Lys Gln Asp Thr Asn Val Val Asn Pro His Asn180 185 190
Ala Glu Arg Val Thr Leu Lys Tyr Lys Trp Lys Phe Gly Glu Gly Ile195 200 205Lys Ala Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asp Asn Val Glu Thr210 215 220His Gly Ile Ser Thr Leu Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Ser Thr Asp225 230 235 240Gly Gln Val Met Ala Thr Gly Glu Ile Ile Gly Glu Arg Lys Val Arg245 250 255Tyr Thr Phe Lys Glu Tyr Val Gln Glu Lys Lys Asp Leu Thr Ala Glu260 265 270Leu Ser Leu Asn Leu Phe Ile Asp Pro Thr Thr Val Thr Gln Lys Gly275 280 285Asn Gln Asn Val Glu Val Lys Leu Gly Glu Thr Thr Val Ser Lys Ile290 295 300Phe Asn Ile Gln Tyr Leu Gly Gly Val Arg Asp Asn Trp Gly Val Thr305 310 315 320Ala Asn Gly Arg Ile Asp Thr Leu Asn Lys Val Asp Gly Lys Phe Ser325 330 335His Phe Ala Tyr Met Lys Pro Asn Asn Gln Ser Leu Ser Ser Val Thr340 345 350Val Thr Gly Gln Val Thr Lys Gly Asn Lys Pro Gly Val Asn Asn Pro355 360 365Thr Val Lys Val Tyr Lys His Ile Gly Ser Asp Asp Leu Ala Glu Ser370 375 380Val Tyr Ala Lys Leu Asp Asp Val Ser Lys Phe Glu Asp Val Thr Asp385 390 395 400Asn Met Ser Leu Asp Phe Asp Thr Asn Gly Gly Tyr Ser Leu Asn Phe405 410 415Asn Asn Leu Asp Gln Ser Lys Asn Tyr Val Ile Lys Tyr Glu Gly Tyr420 425 430Tyr Asp Ser Asn Ala Ser Asn Leu Glu Phe Gln Thr His Leu Phe Gly435 440 445Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Thr Trp Lys Asn Gly Val450 455 460Ala Phe Tyr Ser Asn Asn Ala Gln Gly Asp Gly Lys Asp Lys Leu Lys465 470 475 480Glu Pro Ile Ile Glu His Ser Thr Pro Ile Glu Leu Glu Phe Lys Ser485 490 495
Glu Pro Pro Val Glu Lys His Glu Leu Thr Gly Thr Ile Glu Glu Ser500 505 510Asn Asp Ser Lys Pro Ile Asp Phe Glu Tyr His Thr Ala Val Glu Gly515 520 525Ala Glu Gly His Ala Glu Gly Thr Ile Glu Thr Glu Glu Asp Ser Ile530 535 540His Val Asp Phe Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala545 550 555 560Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val565 570 575Thr Thr Glu Ser Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Asp Ser Thr Lys Gly580 585 590Ile Val Thr Gly Ala Val Ser Asp His Thr Thr Ile Glu Asp Thr Lys595 600 605Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro610 615 620Glu Glu His Gly Gln Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn625 630 635 640Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly645 650 655Asn Tyr Gly Val Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile660 665 670Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser675 680 685Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly690 695 700Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln705 710 715 720Asn Asn Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro725 730 735Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val740 745 750Pro His Ile His Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp755 760 765Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val770 775 780Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Gln Val Ser Gly His Asn Glu Gly785 790 795 800
Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Ile Val Pro Pro Thr805 810 815Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro820 825 830Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro835 840 845Glu Val Pro Thr Glu Pro Gly Lys Pro Ile Pro Pro Ala Lys Glu Glu850 855 860Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val Thr Pro865 870 875 880Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Val Pro Thr Lys Lys885 890 895Ala Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu Glu Ser900 905 910Thr Asn Asn Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile Leu Gly Leu915 920 925Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn His Lys Ala930 935 940<210>14<211>940<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>14Val Lys Ser Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Glu20 25 30Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Asn Asn Thr Thr Val Glu Glu Ser35 40 45Gly Ser Ser Ala Thr Glu Ser Lys Ala Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr50 55 60Asn Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ser65 70 75 80Thr Glu Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro85 90 95Lys Thr Val Gln Ala Pro Lys Val Glu Thr Ser Arg Val Asp Leu Pro100 105 110Ser Glu Lys Val Ala Asp Lys Glu Thr Thr Gly Thr Gln Val Asp Ile115 120 125
Ala Gln Pro Ser Asn Val Ser Glu Ile Lys Pro Arg Met Lys Arg Ser130 135 140Thr Asp Val Thr Ala Val Ala Glu Lys Glu Val Val Glu Glu Thr Lys145 150 155 160Ala Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Lys Val Glu Val Glu Glu Gly Ser165 170 175Glu Ile Val Gly His Lys Gln Asp Thr Asn Val Val Asn Pro His Asn180 185 190Ala Glu Arg Val Thr Leu Lys Tyr Lys Trp Lys Phe Gly Glu Gly Ile195 200 205Lys Ala Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asp Asn Val Glu Thr210 215 220His Gly Ile Ser Thr Leu Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Ser Thr Asp225 230 235 240Gly Gln Val Met Ala Thr Gly Glu Ile Ile Gly Glu Arg Lys Val Arg245 250 255Tyr Thr Phe Lys Glu Tyr Val Gln Glu Lys Lys Asp Leu Thr Ala Glu260 265 270Leu Ser Leu Asn Leu Phe Ile Asp Pro Thr Thr Val Thr Gln Lys Gly275 280 285Asn Gln Asn Val Glu Val Lys Leu Gly Glu Thr Thr Val Ser Lys Ile290 295 300Phe Asn Ile Gln Tyr Leu Gly Gly Val Arg Asp Asn Trp Gly Val Thr305 310 315 320Ala Asn Gly Arg Ile Asp Thr Leu Asn Lys Val Asp Gly Lys Phe Ser325 330 335His Phe Ala Tyr Met Lys Pro Asn Asn Gln Ser Leu Ser Ser Val Thr340 345 350Val Thr Gly Gln Val Thr Lys Gly Asn Lys Pro Gly Val Asn Asn Pro355 360 365Thr Val Lys Val Tyr Lys His Ile Gly Ser Asp Asp Leu Ala Glu Ser370 375 380Val Tyr Ala Lys Leu Asp Asp Val Ser Lys Phe Glu Asp Val Thr Asp385 390 395 400Asn Met Ser Leu Asp Phe Asp Thr Asn Gly Gly Tyr Ser Leu Asn Phe405 410 415Asn Asn Leu Asp Gln Ser Lys Asn Tyr Val Ile Lys Tyr Glu Gly Tyr420 425 430
Tyr Asp Ser Asn Ala Ser Asn Leu Glu Phe Gln Thr His Leu Phe Gly435 440 445Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Thr Trp Lys Asn Gly Val450 455 460Ala Phe Tyr Ser Asn Asn Ala Gln Gly Asp Gly Lys Asp Lys Leu Lys465 470 475 480Glu Pro Ile Ile Glu His Ser Thr Pro Ile Glu Leu Glu Phe Lys Ser485 490 495Glu Pro Pro Val Glu Lys His Glu Leu Thr Gly Thr Ile Glu Glu Ser500 505 510Asn Asp Ser Lys Pro Ile Asp Phe Glu Tyr His Thr Ala Val Glu Gly515 520 525Ala Glu Gly His Ala Glu Gly Thr Ile Glu Thr Glu Glu Asp Ser Ile530 535 540His Val Asp Phe Glu Glu Ser Thr His Glu Asn Ser Lys His His Ala545 550 555 560Asp Val Val Glu Tyr Glu Glu Asp Thr Asn Pro Gly Gly Gly Gln Val565 570 575Thr Thr Glu Ser Asn Leu Val Glu Phe Asp Glu Asp Ser Thr Lys Gly580 585 590Ile Val Thr Gly Ala Val Ser Asp His Thr Thr Ile Glu Asp Thr Lys595 600 605Glu Tyr Thr Thr Glu Ser Asn Leu Ile Glu Leu Val Asp Glu Leu Pro610 615 620Glu Glu His Gly Gln Ala Gln Gly Pro Ile Glu Glu Ile Thr Glu Asn625 630 635 640Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His Gly645 650 655Asn Tyr Gly Val Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp Ile660 665 670Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser675 680 685Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly690 695 700Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln705 710 715 720Asn Asn Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro725 730 735
Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val740 745 750Pro His Ile His Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp755 760 765Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val770 775 780Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Gln Val Ser Gly His Asn Glu Gly785 790 795 800Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Ile Val Pro Pro Thr805 810 815Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro820 825 830Thr Pro Glu Val Pro Ser Glu Pro Glu Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro835 840 845Glu Val Pro Thr Glu Pro Gly Lys Pro Ile Pro Pro Ala Lys Glu Glu850 855 860Pro Lys Lys Pro Ser Lys Pro Val Glu Gln Gly Lys Val Val Thr Pro865 870 875 880Val Ile Glu Ile Asn Glu Lys Val Lys Ala Val Val Pro Thr Lys Lys885 890 895Ala Gln Ser Lys Lys Ser Glu Leu Pro Glu Thr Gly Gly Glu Glu Ser900 905 910Thr Asn Asn Gly Met Leu Phe Gly Gly Leu Phe Ser Ile Leu Gly Leu915 920 925Ala Leu Leu Arg Arg Asn Lys Lys Asn His Lys Ala930 935 940
权利要求
1.一种经分离、变异的金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)(S.aureus)纤连蛋白结合蛋白(Fnb)，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)103、Gln105、赖氨酸(Lys)157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组。
2.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其是衍生自FnbA或FnbB。
3.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Gln103处。
4.根据权利要求3所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由谷氨酰胺变为丙氨酸。
5.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Gln105处。
6.根据权利要求5所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由谷氨酰胺变为丙氨酸。
7.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Lys157处。
8.根据权利要求7所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由赖氨酸变为丙氨酸。
9.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Lys503处。
10.根据权利要求9所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由赖氨酸变为丙氨酸。
11.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Lys620处。
12.根据权利要求11所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由赖氨酸变为丙氨酸。
13.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Lys762处。
14.根据权利要求13所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由赖氨酸变为丙氨酸。
15.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Gln783处。
16.根据权利要求15所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由谷氨酰胺变为丙氨酸。
17.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Gln830处。
18.根据权利要求17所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由谷氨酰胺变为丙氨酸。
19.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在残基Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830的每一者处。
20.根据权利要求19所述的经分离、变异的Fnb，其中所述在残基Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830中每一者处的突变是突变为Ala。
21.根据权利要求19所述的经分离、变异的Fnb，其中所述在残基Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830中任一者处的突变是突变为Ala。
22.一种免疫原性组合物，其包含生理学上可接受的媒剂和经分离、变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白(Fnb)，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，且其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入所述免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述变异Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
23.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
24.一种免疫脊椎动物以对抗金黄色葡萄球菌的方法，其包含向所述脊椎动物投与组合物，所述组合物包含生理学上可接受的媒剂和免疫有效量的经分离、变异的金黄色葡萄球菌Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，且其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述经分离、变异的Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述脊椎动物是血清反应阴性的人类。
26.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株Mu50的FnbA的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)134、Gln136、赖氨酸(Lys)188、Lys534、Lys651、Lys793、Gln814和Gln861。
27.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株N315的FnbA的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)134、Gln136、赖氨酸(Lys)188、Lys534、Lys651、Lys793、Gln814和Gln861。
28.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株MW2的FnbA的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)139、Gln141、赖氨酸(Lys)539、Lys656、Lys798、Gln819和Gln866。
29.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株MSSA-476的FnbA的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)147、Gln149、赖氨酸(Lys)547、Lys664、Lys806、Gln827和Gln874。
30.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株COL的FnbA的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)139、Gln141、赖氨酸(Lys)655、Lys797和Gln865。
31.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株8325-4的FnbA的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)139、Gln141、赖氨酸(Lys)655、Lys797和Gln865。
32.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株EMRSA-16的FnbA的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)147、Gln149、赖氨酸(Lys)549、Lys666、Gln791和Gln838。
33.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株Mu50的FnbB的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)111、赖氨酸(Lys)602、Gln765和Gln812。
34.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株N315的FnbB的下列残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)111、赖氨酸(Lys)602、Gln765和Gln812。
35.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株MW2的FnbB的下列残基组成的群组赖氨酸(Lys)598、Lys740和谷氨酰胺(Gln)808。
36.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株MSSA-476的FnbB的下列残基组成的群组赖氨酸(Lys)598、Lys740和谷氨酰胺(Gln)808。
37.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株COL的FnbB的下列残基组成的群组赖氨酸(Lys)591、Lys733和谷氨酰胺(Gln)801。
38.根据权利要求1所述的经分离、变异的Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由金黄色葡萄球菌菌株8325-4的FnbB的下列残基组成的群组赖氨酸(Lys)591、Lys733和谷氨酰胺(Gln)801。
39.一种经分离的编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)103、Gln105、赖氨酸(Lys)157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组。
40.一种表达载体，其包含操作性连接至调节序列的根据权利要求39所述的经分离的核酸分子。
41.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求40所述的表达载体。
42.一种制造变异Fnb的方法，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)103、Gln105、赖氨酸(Lys)157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，其中所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，所述方法包含在适于表达所述变异Fnb的条件下维持根据权利要求41所述的重组宿主细胞。
43.一种免疫原性组合物，其包含生理学上可接受的媒剂和经分离的编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入所述免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述变异Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
44.根据权利要求43所述的免疫原性组合物，其进一步包含促转染剂。
45.一种诱导脊椎动物中的免疫反应的方法，其包含向所述脊椎动物投与诱导免疫反应有效量的根据权利要求43所述的免疫原性组合物。
46.一种免疫脊椎动物以对抗金黄色葡萄球菌的方法，其包含向所述脊椎动物投与组合物，所述组合物包含生理学上可接受的媒剂和免疫有效量的编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys762、Gln783和Gln830，且其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述变异Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述脊椎动物是血清反应阴性的人类。
48.一种经分离、变异的金黄色葡萄球菌(S.aureus)纤连蛋白结合蛋白(Fnb)，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)103、Gln105、赖氨酸(Lys)157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组。
49.根据权利要求48所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在Lys702处。
50.根据权利要求49所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是由赖氨酸变为丙氨酸。
51.根据权利要求48所述的经分离、变异的Fnb，其中所述突变是在残基Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830的每一者处。
52.根据权利要求51所述的经分离、变异的Fnb，其中所述在残基Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830中每一者处的突变是突变为Ala。
53.根据权利要求48所述的经分离、变异的Fnb，其中所述在残基Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830中任一者处的突变是突变为Ala。
54.一种免疫原性组合物，其包含生理学上可接受的媒剂和经分离、变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白(Fnb)，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830，且其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入所述免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述变异Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
55.根据权利要求54所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
56.一种免疫脊椎动物以对抗金黄色葡萄球菌的方法，其包含向所述脊椎动物投与组合物，所述组合物包含生理学上可接受的媒剂和免疫有效量的经分离、变异的金黄色葡萄球菌Fnb，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830，且其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述经分离、变异的Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述脊椎动物是血清反应阴性的人类。
58.一种经分离的编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)103、Gln105、赖氨酸(Lys)157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，且所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组。
59.一种表达载体，其包含操作性连接至调节序列的根据权利要求58所述的经分离的核酸分子。
60.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求59所述的表达载体。
61.一种制造变异Fnb的方法，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组谷氨酰胺(Gln)103、Gln105、赖氨酸(Lys)157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，其中所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，所述方法包含在适于表达所述变异Fnb的条件下维持根据权利要求60所述的重组宿主细胞。
62.一种免疫原性组合物，其包含生理学上可接受的媒剂和经分离的编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830，其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入所述免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，所述变异Fnb与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述变异Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
63.根据权利要求62所述的免疫原性组合物，其进一步包含促转染剂。
64.一种诱导脊椎动物中的免疫反应的方法，其包含向所述脊椎动物投与诱导免疫反应有效量的根据权利要求62所述的免疫原性组合物。
65.一种免疫脊椎动物以对抗金黄色葡萄球菌的方法，其包含向所述脊椎动物投与组合物，所述组合物包含生理学上可接受的媒剂和免疫有效量的编码变异金黄色葡萄球菌Fnb的核酸分子，其中所述变异是至少一个氨基酸的突变，所述氨基酸是选自由与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的下列残基相对应的残基组成的群组Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830，且其中所述变异Fnb保持免疫原性，且当并入免疫原性组合物并投与至脊椎动物时，其与充当因子XIII、因子XIIIa或组织型转谷氨酰胺酶的底物的人类蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱，所述人类蛋白是选自由纤连蛋白和纤维蛋白组成的群组，且所述变异Fnb在所述脊椎动物随后感染金黄色葡萄球菌后并不增强野生型Fnb与纤连蛋白和纤维蛋白的结合。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述脊椎动物是血清反应阴性的人类。
全文摘要
本发明描述一种经分离、变异的金黄色葡萄球菌(S.aureus)纤连蛋白结合蛋白(Fnb)，其在选自与金黄色葡萄球菌菌株ATCC49525的FnbA的Gln103、Gln105、Lys157、Lys503、Lys620、Lys702、Lys762、Gln783和Gln830相对应的残基的氨基酸中具有至少一个突变。这些反应性残基在所述纤连蛋白结合蛋白内的置换使得这一蛋白与纤连蛋白和纤维蛋白共价交联的能力比野生型Fnb弱。所述变异纤连蛋白结合蛋白有效干扰金黄色葡萄球菌与纤连蛋白和纤维蛋白的粘着，且因此，包含所述变异Fnb的免疫原性组合物展现改良的免疫原特性且使用更安全。
文档编号C07K14/31GK1953991SQ200580015439
公开日2007年4月25日 申请日期2005年5月17日 优先权日2004年5月21日
发明者尤里·弗拉基米罗维奇·马茨卡, 史蒂文·莫里斯·贝克, 伊丽莎白·特里米·安德森 申请人:惠氏公司