专利名称：作为潜在抗肿瘤治疗剂的单克隆抗体sc104及其特异性结合至唾液酸丁糖基碳水化合物 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合因子(members)，特别是抗体及其片段，其结合到与癌症和子宫内膜异位有关的表位。这样的因子可用于肿瘤的诊断和治疗。
结合到GM2、GD3和GM3神经节苷脂的抗体是已知的，但是结合到唾液酸丁糖基(sialyltetraosyl)神经酰胺但不结合到GM1、GD1a、GT1b或唾液酸Lewis抗原的抗体先前还没有介绍过。一种小鼠单克隆抗体(mab)，这里已知作为“SC104”，被制备，依次用4种结直肠癌细胞系免疫并结合71％的结直肠肿瘤。SC104对唾液酸丁糖基碳水化合物是特异的，其可以存在于脂质(神经酰胺)或蛋白质骨架上，并识别食管、结直肠、胃、乳房、腮和子宫内膜肿瘤。因为它是IgG1抗体，SC104是罕见的。碳水化合物抗原的免疫学特征之一是它们通常引起不依赖于T-细胞的应答，导致产生IgM抗体。通过使用来自结直肠细胞系C170的脂质提取物的免疫染色HPTLC板显示，SC104结合至一种唾液酸丁糖基神经酰胺。SC104也显示结合至具有该唾液酸丁糖基碳水化合物的一种蛋白质结构。对正常组织的识别是最小的并且限制于对大肠、唾腺、小肠、胸腺、扁桃腺和子宫颈的中度染色。令人惊奇地，本发明还发现了这种抗体诱导细胞死亡。
根据本发明的第一个方面，提供一种分离的特异性结合因子，其能结合一种唾液酸丁糖基碳水化合物并可以在不需要免疫效应细胞的情况下直接诱导细胞死亡。
本发明的第二个方面提供能结合一种唾液酸丁糖基碳水化合物的分离的特异性结合因子，该唾液酸丁糖基碳水化合物能被一种包含一或多个结合结构域的因子所结合，所述结合结构域选自这些结构域，其包含基本如
图1a氨基酸序列中第44或49至54、69至84或117至127位残基所列的氨基酸序列。
所述结合结构域可以包含基本如图1a中第117至127位残基所列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明第二个方面的分离的特异性结合因子包含一或多个选自这些结构域的结合结构域，所述结构域包含基本如图1a中氨基酸序列中第44或49至54、69至84或117至127位残基所列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该因子包含一种结合结构域，其包含基本如图1a的氨基酸序列中第117至127位残基所列的氨基酸序列。在该实施方案中，分离的特异性结合因子可以另外包含一个或全部两个结合结构域，优选全部两个，所述结合结构域基本如图1a所示氨基酸序列的第44或49至54位残基和第69至84位残基所列出。
本发明第二个方面的一种分离的特异性结合因子包含基本如图1a所示氨基酸序列的第19至138位残基所列的氨基酸序列。
在第三个方面中，本发明提供一种能结合一种唾液酸丁糖基碳水化合物的分离的特异性结合因子，所述唾液酸丁糖基碳水化合物能被包含一或和多个结合结构域的因子所结合，所述结合结构域选自这些结构域，其包含基本如图1c氨基酸序列中第46至55、71至77和110至118位残基所列的氨基酸序列。
所述结合结构域可以包含基本如图1c氨基酸序列中第110至118位残基所列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明第三个方面的分离的特异性结合因子包含一或多个结合结构域，所述结合结构域选自这些结构域，其包含基本如图1c氨基酸序列中第46至55、71至77和110至118位残基所列出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，这种因子包含一种结合结构域，其包含基本如图1c氨基酸序列中第110至118位残基所列的氨基酸序列。在这个实施方案中，这种分离的特异性结合因子可以另外包含一个或全部两个结合结构域，优选全部两个，所述结合结构域基本如图1c所示的氨基酸序列中第46至55和71至77位残基所列出。
包含大量相同或不同序列达到结合结构域的特异性结合因子、或其组合，包括在本发明之内。所述或每个结合结构域可以由人抗体框架来携带。例如，可以用一个或多个结合结构域替换全人抗体或其可变结构域的CDR。
本发明第三个方面的一种分离的特异性结合因子包含基本如图1c所示的氨基酸序列中第23至128位残基所述的序列。
在第四个方面，本发明提供一种特异性结合因子，其包含本发明第二方面的结合因子和本发明第三方面的结合因子的组合或联合。这种结合因子可以是Fv、(Fab’)2、或scFV抗体片段的形式。
本发明的特异性结合因子可以携带可检测或功能性标记。
在进一步的方面中，本发明提供一种分离的核酸，其包含编码本发明第一、第二、第三和第四方面的特异性结合因子的序列，并提供制备本发明特异性结合因子的方法，其包括在能表达所述结合因子的条件下表达所述核酸，并回收结合因子。
根据本发明的特异性结合因子可以用于人或动物体的治疗或诊断方法，诸如治疗患者(优选人)中肿瘤的方法，其包括向所述患者施用有效量的本发明特异性结合因子。本发明也提供一种本发明的特异性结合因子用于医药，以及本发明的特异性结合因子在制造用于治疗或诊断肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供与本发明特异性结合因子相结合的抗原。在一个实施方案中，提供一种唾液酸丁糖基碳水化合物，其能被本发明的特异性结合因子结合，优选特异性结合。所述唾液酸丁糖基碳水化合物可以分离的形式提供，并且可以用于筛选，以开发其进一步的特异性结合因子。例如，可以筛选化合物库，以筛选该库中特异性结合至所述唾液酸丁糖基碳水化合物的成员因子。所述唾液酸丁糖基碳水化合物可以在脂质骨架上(即一种唾液酸丁糖基神经酰胺)或在蛋白质骨架上。当在蛋白质骨架上时，它的分子量可以是约50-75kDa，由SDS-PAGE测定。
本发明的这些和其他方面将在下文中进一步描述。
如此处所用，“特异性结合因子”是可以互相具有结合特异性的一对分子中的一个成员。特异性结合对的该成员可以是天然来源的或者整体或部分合成生产的。分子对的一个成员在其表面上具有一个区域，它可以是突出或者凹腔，它特异性结合到该分子对另外成员的特定空间和极性结构并因此与之互补。因而，分子对的成员具有互相特异性结合的特性。特异性结合对的类型的实例是抗原-抗体、生物素-亲合素、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明一般地涉及抗体-抗原类型的反应，尽管也涉及结合至本文定义抗原的小分子。
如这里所使用，“治疗”包括任何能有益于人或非人动物、优选哺乳动物的治疗方案。治疗可以是关于现有疾病或者可以是预防性(预防性治疗)。
如这里所使用，“肿瘤”是一种非正常生长的组织。它可以是局部的(良性的)或者侵袭临近组织(恶性的)或远处组织(转移的)。肿瘤包括可以导致癌症的新生物生长，包括食管、结直肠、胃、乳房和子宫内膜肿瘤，以及癌性组织或细胞系，包括但不仅限于白血病细胞。如这里所使用，在其范围内“肿瘤”也包括子宫内膜异位。
这里所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，无论是天然的或者是部分或者完全合成产生的。该术语还涵盖就是抗体结合结构域或与之同源的多肽或蛋白质。这些可以来源于天然源，或它们可以由部分或全部合成产生。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。抗体可以是多克隆或者单克隆的。单克隆抗体在这里可以称为“mab”。
有可能利用单克隆或其它抗体，并使用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，例如，EP-A-184187，GB 2188638A或EP-A-239400。可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
抗体可以通过许多方式修饰，术语“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子或物质。因而，这个术语涵盖了抗体片段、衍生物、抗体的功能等同物和同源物、人源化抗体，包括含有免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成产生的。融合至另一多肽的、包含免疫球蛋白结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述。人类化的抗体可以是一种修饰抗体，其具有非人如鼠科动物的可变区以及人抗体的恒定区。制造人源化抗体的方法描述于，例如美国专利No.5225539。
已经表明完整抗体的片段可以完成结合抗原的功能。结合片段的例子是(I)由VL、VH、CL和CHI结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature 341544-546(1989))；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab’)2片段，包含两个相连接Fab片段的双价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由允许两个结构域结合形成抗原结合位点的连接肽连接起来(Bird等，Science 242423-426(1988)；Huston等，PNASUSA 855879-5883(1988))；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；和(ix)“双链抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO 94/13804；P.Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993))。
双链抗体是多肽的多聚体，每一个多肽链包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包含免疫球蛋白轻链的结合结构域，第二结构域包含免疫球蛋白重链的结合结构域，两个结构域相连接(如通过连接肽)但不能相互结合形成抗原结合位点抗原结合位点是由在所述多聚体内的一个多肽的第一结构域与所述多聚体内的另一多肽的第二结构域相结合而形成的(WO 94/13804)。
这里可以使用双特异性抗体，这些可以是传统双特异性抗体，其可以利用多种方法制造(Hollinger & Winter，Current Opinion Biotechnol.4446-449(1993))，例如以化学方法制备或者利用杂合体杂交瘤进行制备，或者可以是上面所提及的任意双特异性片段。优选使用scFv二聚体或者双链抗体而不是完整抗体。双链抗体和scFv可以在没有Fc区域而仅仅利用可变结构域进行构建，潜在地减少了抗-独特型反应的作用。其他形式的双特异抗体包括单链“Janusins”，其描述于Traunecker等人，EMBO Journal 103655-3659(1991)。
双特异性双链抗体，与双特异性完整抗体相反，也可以被使用，因为它们可以在大肠杆菌中容易地构建和表达。适当结合特异性的双链抗体(和许多其它多肽如抗体片段)可以很容易地利用噬菌体展示(WO 94/13804)从库中选择。如果双链抗体的一个臂准备保持恒定，例如其具有抗抗原X的特异性，那么可以制备另外臂变化的库，并选择具有适当特异性的抗体。
“抗原结合结构域”是抗体的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并与之互补的区域。当抗原较大时，抗体可能只结合抗原的一个特定部分，其中这个部分被称为表位。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
“特异性”通常用于表示特异性结合对的一个成员对除了其特异性结合伴侣之外的分子不显示任何显著结合的情况，例如，与任何其它分子的交叉反应小于约30％，优选20％、10％或1％。该术语同样适用于，例如，抗原结合结构域对多种抗原携带的特定表位有特异性的情况，在此情况下，携带该抗原结合结构域的特异性结合因子将可以结合携带该表位的多种抗原。
“分离的”表示，根据本发明，本发明的特异性结合因子或编码这些结合因子的核酸所优选处于的状态。因子和核酸一般没有或基本没有它们在天然状态下相结合的材料，例如在其天然环境中、或当使用体内或体外重组DNA技术制备时在制备它们的环境中与之相结合的其它多肽或核酸。特异性结合因子和核酸可以利用稀释剂或者辅剂配制，并且对于实用目的仍然是分离的-例如，如果用于包被用于免疫测试的微滴定板时，所述因子通常与明胶或其它载体混合，或者当用在诊断或治疗中时其将与药学可接受的载体或稀释剂混合。特异性结合因子可以被糖基化，或者是天然的或者通过异源真核细胞系统，或者它们可以是(例如如果通过在原核细胞中表达来产生的)未糖基化的。
“基本如…所列出的”是指本发明的CDR区将与图1a和1c的指定区域是等同的或者是高度同源的。“高度同源的”包含在CDR中可以进行从1至5、从1至4、从1至3、2或1个位置的取代。
在其范围内本发明还包括具有图1a或1c中所列出氨基酸序列的多肽，具有图1a或1c中所列出核酸序列的多核苷酸，以及与它们基本一致如具有70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的序列。两个氨基酸序列或者两个核苷酸序列的一致性百分数通常如此确定为最优比较目的而比对序列(如为了与第二序列最佳匹配儿子第一序列中引入间隙)并且比较对应位置处的氨基酸残基或核苷酸。“最佳匹配”是使两个序列产生最高一致性百分比的校正。一致性百分比是通过比较序列中相同氨基酸残基或者核苷酸的数量来测定的(例如，％一致性＝相同位置的数量/位置总数×100)。
两个序列之间一致性百分比的测定可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成。对比两个序列的数学算法的例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268的数学算法，修饰后的如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中的数学算法。Altschul，等人，(1990)J.Mol.Biol.215403-410的NBLAST和XBLAST程序已经结合于这样的算法中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序完成，分数＝100，词长＝12，来得到与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序完成，分数＝50，词长＝3，以得到与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有间隙的比对，Gapped BLAST可以被使用，如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402中所述。作为替代，PSI-BLAST可以用来完成重新搜索来检测两个分子间(Id.)的远距离关系。当用BLAST、GappedBLAST和PSI-BLAST程序时，各个程序的默认参数(例如，XBLAST和NBALST)可以被使用。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用来进行序列比对的另一个数学算法的例子是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。ALIGN程序(2.0版)是GCG序列比对软件包的一部分，已经整合了这样的算法。在本领域内已知的其它序列分析算法包括ADVANCE和ADAM，如在Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，103-5中有详细描述；以及FASTA，如在Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-8中有描述。在FASTA中，ktup是一个设定搜索灵敏度和速度的控制选项。
本发明的分离的特异性结合因子能够结合唾液酸丁糖基碳水化合物，其可以是一种唾液酸丁糖基神经酰胺或者可以位于蛋白质结构上。在一个实施方案中，CDR3区，包含基本如图1a的第117至127位残基和图1c的110至118位残基所列出的氨基酸序列，其携带在一个结构中，这个结构允许这些区域结合至唾液酸丁糖基碳水化合物。
携带本发明CDR3的结构通常是抗体的重链或轻链序列或者是其实质性部分，其中CDR3区域定位于由重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变区的CDR3的相应位置。免疫球蛋白可变区的结构和位置可以参考文献Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th Edition，USDepartment of Health and Human Services，(1987)和其升级来确定，现在可以在因特网上使用(http//immuno.bme.nwu/edu)。
基本如图1a的第117至127位残基所列出的氨基酸序列可以在人重链可变结构域或其实质性部分中作为CDR3来携带，并且基本如图1c的第110至118位残基所列出的氨基酸序列可以在人轻链可变结构域或其实质性部分中作为CDR3来携带。
可变区可以源自于任何生殖系或者重排的人可变结构域，或者可以是基于已知人可变结构域的共有序列的合成的可变结构域。本发明的CDR3-来源序列可以利用DNA重组技术来引入到缺乏CDR3区的可变结构域的库中。
例如，Marks等人(Bio/Technology 10779-783(1992))描述了产生抗体可变结构域库的方法，其中针对可变结构域区域的5’末端或与之临近的共有引物、与针对人VH基因的第三框架区的共有引物相结合，以提供CDR3缺失的VH可变结构域的库。Marks等人进一步描述了这个库怎样与特定抗体的CDR3组合。利用相似的技术，本发明的CDR3-来源序列可以与缺失CDR3的VH或VL结构域的库组合(shuffle)，这种组合的完全VH或VL结构域与同源的(cognate)VL或VH结构域相结合，从而提供了本发明的特异性结合因子。然后库可以在适当的宿主系统中进行展示，如WO 92/01047的噬菌体展示系统，使得可以选择合适的特异性结合因子。库可以由104个以上的单独因子组成，如从106至108或1010个因子。
类似的组合或者组合技术也被公开于Stemmer(Nature 370389-391(1994))，他描述了关于β-内酰胺酶基因的技术但是观察到该方法可以用于生产抗体。
进一步的替代方案是产生运载本发明CDR3衍生序列的新的VH或者VL区域，利用随机突变例如SC104VH或VL基因以在整个可变结构域内产生突变体。这种技术在Gram等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893576-3580(1992))中有描述，他使用的是易错PCR技术。
另外一个可以使用的方法是直接突变VH或VL基因的CDR区域。这种技术被Barbas等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913809-3813(1994))和Schier等人(J.Mol.Biol.263551-567(1996))揭示。
免疫球蛋白可变结构域的实质性部分通常包含至少三个CDR区域，以及它们的介入框架区域。这部分也可以包括第一和第四框架区域其中一个或者两个的至少约50％，这50％是第一框架区域的C-末端50％和第四框架区域的N-末端50％。可变结构域实质部分的N-末端或C-末端的另外残基可以是那些通常不与天然存在的可变结构域区域结合的那些。例如，通过DNA重组技术制造的本发明特异性结合因子的构建可以导致引入由连接物编码的N-末端或C-末端残基，引入的连接物用于辅助克隆或者其它操作步骤，包括引入连接物以将本发明可变结构域连接至进一步的蛋白质序列，包括免疫球蛋白重链、其它可变结构域(如在双链抗体生产中)或者蛋白质标记，下面将更详细讨论。
本发明的一个实施方案提供特异性结合因子，其包含基于基本由图1a和1c列出的VL和VH区域氨基酸序列的一对结合结构域，即图1a中第19位至138位氨基酸以及图1c中第23至128位氨基酸。基于这些序列中任一个的单个结合结构域形成本发明的进一步方面。在基于基本如图1a所列VH区的氨基酸序列的结合结构域的情况下，这些结合结构域可以用作靶向剂，因为已知免疫球蛋白VH区域能够以特异性方式结合目标抗原。
在任一种单链特异性结合结构域的情况下，这些结构域可以用于筛选能够形成双结构域特异性结合因子的互补性结构域，其具有与此处公开的SC104抗体同样好的或者等同的体内特性。
这可以通过使用WO 92/01047中公开的被称为分级双组合方法(hierarchicaldual combinatorial approach)经噬菌体展示筛选方法来实现，其中使用包含H或L链克隆的单菌落来感染编码另外链(L或H)的克隆的完全库并且根据如参考文献所述的噬菌体展示技术选择所得两链特异性结合因子。这种技术也在先前由Marks等人公开。
本发明的特异性结合因子可以进一步包括抗体恒定区或者其中的部分。例如，基于图1c所示VL区域的特异性结合因子可以通过它们的C-末端被连接到包含Cκ或Cλ链的抗体轻链恒定区上。相似的，基于图1a或1b所示VH区域的特异性结合因子可以通过它们的C-末端被连接到免疫球蛋白重链的全部或部分上，所述重链源自于任何抗体亚型如IgG、IgA、IgE和IgM和任何亚型亚类，尤其是IgG1和IgG4。
SC104已经被证实导致悬浮肿瘤细胞系的死亡，并且在结直肠肿瘤中和源自分解的肿瘤组织的细胞中导致特异性发生细胞凋亡或程序性细胞死亡。因而，本发明的特异性结合因子可以用作治疗剂以抑制肿瘤生长或者诱导肿瘤的凋亡。凋亡是细胞主动自杀的过程。已经了解到细胞凋亡对正常发育的很多方面是必要的并且是维持组织动态平衡所必须的。但是，自杀性细胞死亡，有时被称为程序性细胞死亡，对于破坏那些对有机体的完整性产生威胁的细胞是必须的。细胞通过细胞凋亡来自杀有两种不同的机制。其中之一是由来自于细胞内的信号触发的，另一种是由结合在细胞表面受体上的外部信号(例如分子)触发的。
本发明的特异性结合因子可以用于诊断和治疗人或者动物中肿瘤的方法。
当用于诊断中时，本发明的特异性结合因子可以利用可检测标记物进行标记，例如，放射性同位素如131I或者99TC，其可以利用抗体成像领域中已知的常规化学方法与本发明的特异性结合因子进行结合。标记物也包括酶标记如辣根过氧化酶。标记物进一步包括化学结构如生物素，其可以通过结合到特异性对应可检测结构来进行检测，例如，标记的亲合素。
虽然本发明的特异性结合因子自身已经显示可以有效杀死癌细胞，但是它们可以被功能性标记物进行标记。功能性标记物包括那些被设计为可以靶向癌症部位并对其进行破坏的物质。这些功能性标记物包括毒素例如篦麻毒素和酶例如细菌羧肽酶或硝基还原酶，其可以将前药转化成活性药物。另外，这种特异性结合因子可以与化疗剂或细胞毒性剂连接或结合，例如卡里奇霉素(calicheamicin)，或放射性标记，例如90Y或131I。
进而，根据待治疗疾病，本发明的特异性结合因子可以单独进行给药或者可以与其它治疗结合使用，或者同时或者先后进行。因此本发明进一步提供了包含本发明特异性结合因子和活性剂的产品，作为一种组合制剂经同时、分开或依次使用于肿瘤治疗。活性剂可以包括化疗剂或细胞毒性剂，包括5-氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素C、奥沙利铂和他莫昔芬，其可以与本发明结合因子协同作用。其它的活性剂可以包括合适剂量的疼痛缓解药例如非甾类消炎药(例如，阿斯匹林，扑热息痛，布洛芬或酮洛芬)或者阿片类物质(opitates)例如吗啡，或止吐剂。
不希望被理论所限制，本发明结合因子与活性剂协同作用以增强肿瘤杀死效果的能力可能不是由于免疫效应机制，而更可能是所述结合分子结合到细胞表面结合的唾液酸丁糖基碳水化合物的直接结果。
本发明特异性结合因子通常以药物组合物的形式进行给药，其除了特异性结合因子外还可以包含至少一种组分。除了活性成分外，所述药物组合物可以包含药学可接受的赋形剂、稀释剂、载体、缓冲剂、稳定剂或者本领域技术人员公知的其它材料。这些材料应该是无毒的并且应该不影响活性成分的功效。载体或其它材料的确切种类将依赖于给药的途径，其可以是口服、或注射如静脉注射。
可以想到注射将是治疗性施用组合物的主要方式，虽然也可以通过导管或其它外科管输送。一些合适的给药途径包括静脉内、皮下和肌肉内给药。液体制剂可以在从粉末制剂重构后使用。
对于静脉注射，或者在病痛位点注射，活性成分应该是注射可接受的水溶液形式，其是没有热源的，并具有适当的pH、等渗度(isotonicity)和稳定性。本领域的相关技术人员可以使用例如等渗介质如氯化钠注射液，Ringer’s注射液，乳酸化Ringer’s注射液等来制备合适的溶液。如果需要，也可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
用于口服的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。生理盐水溶液、葡萄糖、或其它糖溶液或二元醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇可以被包括。制剂是液体时，它例如可以是含非磷酸缓冲剂pH为6.8-7.6的生理盐溶液，或者是冻干粉末。
所述组合物可以通过微球、脂质体、其它微颗粒递送系统或者放置在包括血液的某种组织中的持续释放制剂进行施用。持续释放载体的适当例子包括共用物品形式的半渗透聚合物基质，例如栓剂或微胶囊。可植入的或者微胶囊持续释放基质包括聚交酯(美国专利No.3,773,919；EP-A-0058481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22(1)547-556，1985)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或乙二醇乙烯基乙酸酯(ethylene vinyl acetate)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15167-277，1981，以及Langer，Chem.Tech.1298-105，1982)。含多肽的脂质体可用公知方法制备DE 3,218,121A；Epstein等人，PNAS USA，823688-3692，1985；Hwang等人，PNAS USA，774030-4034，1980；EP-A-0052522；E-A-0036676；EP-A-0088046；EP-A-0143949；EP-A-0142541；JP-A-83-11808；美国专利Nos4,485,045和4,544,545。通常，这些脂质体是小的(约200-800埃)单层型，其中脂含量高于约30mol.％胆固醇，调整选择的比例以优化多肽的释放速率。
组合物可以局部给药至肿瘤部位或者其它需要部位，或者可以靶向肿瘤或其它细胞的方式进行递送。
组合物优选以“治疗有效量”向个体施用，这足以显示对个体的益处。实际的给药量，以及给药的速率和时间曲线，将依赖于待治疗对象的种类和严重程度。治疗处方，例如剂量决定等，在一般医生和其它医生的义务范围内，并且通常需要考虑将要处理的病症，个体患者的状况、递送部位、给药方法以及医生公知的其它因素。本发明的化合物特别适合治疗现有的肿瘤，特别是癌症，以及在初步治疗或手术后预防这种疾病的复发。上面提到的技术和策略的例子可以在Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Oslo，A.(ed)，1980中找到。
最佳剂量可以由医师在大量数据基础上确定，这些数据包括例如，年龄，性别，体重，待治疗疾病的严重程度，施用的活性成分以及给药途径。一般地，多肽和抗体的血清浓度使受体得到饱和是期望的。浓度超过约0.1nM通常是足够的。例如，100mg/m2的抗体剂量提供约20nM血清浓度持续约8天。
作为一个大致的方针，抗体的剂量可以每周给予10-300mg/m2的量。抗体片段的等价剂量应该在更频繁的间隔使用以保持血清水平超过使唾液酸丁糖基碳水化合物达到饱和的浓度。
组合物的剂量将依赖于结合因子的性质，例如，其结合活性以及体内血浆半衰期，制剂中多肽浓度，给药途径，用药部位和速率，参与患者的临床耐受性，影响患者的病理状况等等，这些都在医师的技术范围内。例如，每个患者每次用药300μg的抗体剂量是优选的，虽然范围可以在约10μg至6mg之间变化。不同的剂量可以在一系列连续给药期间使用；医生可以给予初次接种并随后以相对较小剂量的抗体来增强。
本发明还涉及为了增强抗癌症的保护性免疫应答来优化免疫接种方案。
本发明的结合因子可以全部地或者部分地通过化学合成来产生。这种结合因子可以按照已经成熟建立的、标准液相或优选固相肽合成方法来容易地制备，其一般性描述是广泛公知的(参见，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase PeptideSynthesis，2nd edition，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)，和M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，NewYork(1984)；和Applied Biosystems 430A Users Manual，ABI Inc.，Foster City，California)，或者它们可以在溶液中制备，通过液相方法或者通过固相、液相和溶液化学结合的方法，例如，通过首先制备各自的肽部分，随后，如果需要和适合，就在除去存在的任何保护基团后，通过各自的碳酸和磺酸或其活性衍生物的反应来引入残基X。
另一个生产本发明结合因子的便利方法是表达编码其的核酸，通过在表达系统中使用核酸。
本发明进一步提供一种编码本发明特异性结合因子的分离核酸。核酸包括DNA和RNA。在一个优选的方面，本发明提供一种核酸，其编码本发明上述的特异性结合因子。这种核酸的例子显示在图1a、1b和1c中。技术人员可以确定对这种核酸的替换、删除和/或添加，而其仍然可以提供本发明所述的特异性结合因子。
本发明还提供质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一个上述的核酸。本发明还提供重组宿主细胞，其包含一个或多个上述的构建体。如所提到的，编码本发明特异性结合因子的核酸形成了本发明的一个方面，以及生产特异性结合因子的方法，这种方法包括从编码核酸中进行表达。表达可以通过在适当的条件下培养包含核酸的重组宿主细胞来方便地实现。通过表达进行生产后，特异性结合因子可以使用任何适当的技术进行分离和/或纯化，随后适当地使用。
在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是公知的。适当的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中已有的表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、地鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞以及许多其它细胞。常规的和优选的细菌宿主是大肠杆菌。抗体和抗体片段在原核细胞如大肠杆菌中的表达是本领域中已经完备建立的。对于综述，参见例如Plückthun，Bio/Technology 9545-551(1991)。作为生产特异性结合因子的一个选项，在培养的真核细胞中表达也是本领域技术人员已知的，参考最近的综述，例如Reff，Curr.Opinion Biotech.4573-576(1993)；Trill等人，Curr.Opinion Biotech.6553-560(1995)。
适当的载体可以被选择和构建，包含适当的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多(聚)腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它适当的序列。载体可以是质粒，病毒，例如噬菌体，或者噬菌粒，是适当的。进一步细节参考，例如，Sambrook等人，分子克隆实验室手册第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。许多已知的技术和方法被用来操作核酸，例如核酸构建体的制备、突变、测序、向细胞中引入DNA以及基因表达、和蛋白质分析，其被详细描述于Ausubel等人编辑的，Short Protocols in Molecular Biology，2nd Edition，John Wiley & Sons(1992)。
因此，本发明进一步的方面提供含有此处所述核酸的宿主细胞。另一个方面提供包括将这种核酸引入宿主细胞中的方法。这种引入可以应用任意已有的技术。对于真核细胞，适当的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆转录病毒和其它病毒进行的转导，例如，痘苗病毒，或者对于昆虫细胞，杆状病毒。对于细菌细胞，适当的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。这种引入可以通过导致或允许从核酸表达来实现，例如，通过在表达所述基因的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明的核酸被整合入宿主细胞的基因组(例如，染色体)中。按照标准技术，通过包含可以促进基因组重组的序列可以促进这种整合。
本发明还提供一种方法，其包括在表达系统中使用上面所述的构建体以上述的表达特异性结合因子或多肽。
本发明每个方面的优选特征是对于任意其它方面已作必要的修正。提到的现有技术文献在法律允许的最大范围内并入本文。
实施例这里本发明将通过下面的非限定性实施例进行进一步的描述。使用附图作为参考，其中图1a显示了SC104抗体重链可变区以及一部分恒定区的核酸和氨基酸序列，图1b显示了在图1a中略述的同样序列但是已经使用了Kabat计数系统，以及图1c显示了SC104抗体轻链可变区和一部分恒定区的核酸和氨基酸序列。图1d证明了SC104抗体的结合到目标细胞系上的嵌合体形式，其是通过转染细胞系产生的。
图2a的图证明了SC104与一组细胞系的结合(Colo205，C170，MCF-7，MDA-231，MDA-435，T47D，ZR75，MKN45，RID9，T24，A431，PA1和OA W28(得自ECACC))。细胞利用ELISA进行染色并且对于每种细胞系结果以吸光度(405nm)的形式表达。图2b的图证明了SC104与下述细胞系进行结合C170，HT-29，LoVo，Colo205，MKN45，RID9和A431。细胞通过间接免疫荧光进行染色并利用流式细胞术进行分析。对于每种细胞系结果以X-平均值的形式表达。SC101/29由Scancell提供作为阳性对照，并识别Lewisy/b。一种亚型匹配抗体被用作阴性对照。
图3证明了单克隆抗体与新分解的结直肠肿瘤细胞的结合，通过间接免疫荧光进行分析并利用流式细胞术进行分析。每个点代表每个单独肿瘤的平均荧光值。
图4证明了SC104mab与纯化的CEA，C14抗原和肿瘤糖脂提取物的结合。C14抗原(从唾液中通过C14单克隆亲和色谱技术纯化得到的90KDa糖蛋白)，CEA(从结直肠肿瘤活体转移物中通过365mab的亲和色谱技术纯化得到的180KDa糖蛋白)和糖脂提取物(从结直肠肿瘤中以3∶1甲醇氯仿w/v提取的糖脂)通过在37℃下培养过夜被干燥在微滴定板上。SC104mab的结合通过ELISA进行检测并且结果以405nm吸光度的形式表示。SC101和抗-CEA抗体被包括作为阳性对照。
图5显示了HPTLC板，其显示出A.从36ml床体积柱上收集SC104免疫染色的组分。泳道W是分级前的全C170提取物。最早的6×10ml收集级分被点加到泳道1至6，同时后面的14条泳道代表随后的14×3ml收集级分。SC104抗原被定位在级分6，RF0.53。B.仅有二级抗体显示了没有条带提示结合对SC104有特异性。
图6是HPTLC板，其显示了(A)级分6的苔黑酚染色反映出三个条带RF值在0.50至0.61之间。(B)相同级分的SC104免疫染色给出了三个紧密的条带RF在0.36至0.39之间。
图7是HPTLC板，其显示了全C170提取物(泳道W)、级分6(泳道6)和去糖基化脂类(泳道L)的SC104免疫染色。抗原在全提取物和级分6中观察到(RF值为0.38至0.46)，但是在通过神经酰胺聚糖酶去糖基化后，在脂类级分中没有检测到抗原。
图8是HPTLC板，其显示了部分纯化的抗原的SC104免疫染色。铅笔标记显示了通过碘蒸汽染色检测到的脂类的定位。泳道1和2含有神经酰胺聚糖酶处理的抗原随后分别分配到水相和有机相中。释放入水相中的寡糖组分和进入有机相中的游离脂类。任意没有消化的糖脂将根据总极性分配进入任意相中。泳道3和4是在神经酰胺聚糖酶存在下相同的水相和有机相级分。在去糖基化前检测到抗原(RF为0.48和0.40)但是随后除去寡糖后没有检测到。
图9是HPTLC板，其显示了来自C170细胞组分的简单样(泳道S)、糖脂(泳道G)和磷脂(泳道P)级分的SC104免疫染色(A)以及苔黑酚染色(B)。抗原在简单样和磷脂级分中检测到(RF为0.54，0.51和0.41)但是在中性糖脂级分中没有检测到。苔黑酚染色在磷脂级分中显示出两个清晰的条带(RF为0.54和0.51)其与抗原联合迁移。
图10显示了进行了苔黑酚(A)和SC104免疫染色(B)的C170全脂质提取物的二维HPTLC板。一维是在50∶40∶10氯仿∶甲醇∶CaCl2(0.5％w/v)中展开的，以及二维是在10∶4∶2∶2∶1氯仿∶丙酮∶甲醇∶醋酸∶水中展开的。抗原在一维中具有RF为0.48的迁移以及在二维中没有迁移。苔黑酚染色带中再一次观察到与抗原的共迁移。
图11是HPTLC板，其显示了通过唾液酸苷酶消化有(泳道1和2)和没有(泳道3)去唾液酸化(de-sialylation)的抗原的SC104免疫染色。去唾液酸化(de-sialylation)在更小极性(RF为0.46)簇产生了更强的染色并且在更大极性(RF为0.62)簇降低了染色的强度。
图12显示了从硅胶柱上得到的C170脂类级分的HPTLC板。板使用SC104(A)，单独二级抗体(B)进行检测或者使用苔黑酚(C)和茚三酮(D)进行染色。抗原在全提取物(泳道W)和唾液酸化糖脂级分(泳道N1，N2和N3)中检测到。在简单样(泳道S)或磷脂/中性糖脂(泳道P)级分中没有观察到抗原。
图13的图证明了在观察到SC104抗原与SC104交叉反应的同时，它没有与抗-唾液酸Lewisa(一种先前被评价为临床潜力的生物分子)或19/9抗体交叉反应。
图14证明了，使用SC104-蛋白A琼脂糖柱，在银染色胶上确认了50-75KDa之间的SC104免疫纯化抗原的一条带。
图15显示了从唾液中纯化得到的SC104级分与SC104生物素竞争结合到C170细胞上。
图16是一种柱状图，其证明了SC104，或者对照样791T/36抗体，对于C170肿瘤细胞的作用。细胞利用FITC标记的膜联蛋白和碘化丙啶进行染色并随后通过双色流式细胞术进行分析。结果显示为利用膜联蛋白、PI或二者染色的细胞百分率(％)。SC101/29被包括作为阳性对照。
图17显示了暴露于贴壁C170细胞6小时后pan caspase的FITC-z-FMK-vad活化。这种结果以X-平均值进行表达。
图18证明了caspase 6在利用SC104抗体处理的粘着细胞上的活化。SC101抗体处理细胞被包括作为阴性对照。
图19证明了如果SC104处理细胞(A)也暴露于3uM z-FMK-vad抑制剂(B)，使用膜联蛋白V FITC和碘化丙啶进行测试的时候可以显著降低细胞死亡。
图20显示的图以生存力％进行显示(暴露给药物的细胞数/暴露给对照体的细胞数)，如果属于一系列的肿瘤细胞系(Colo 205，C170，HT29和LoVo)。存活的细胞数通过MTS进行确定并且在490nm处读取光密度。
图21证明了IC50适合于肿瘤细胞系C170，Colo 205，HT29和LoVo，其从典型细胞生存能力的结论中推断出来的(％生存度＝暴露给药物的细胞数/暴露给对照体的细胞数)，当利用MTS进行检测时候并且在490nm处读取光密度。
图22的图显示了通过Cellfix或者戊二醛实现的肿瘤细胞的固定，与单独介质中的没有处理的相比没有显著改变抗体与肿瘤细胞系C170的结合。细胞通过间接免疫荧光进行染色，通过流式细胞术进行分析并且结果以平均线性荧光值进行表达。
图23a显示了SC104在没有抗原的情况下没有嗜同性型结合。微孔板利用山羊抗-鼠IgG Fc特异抗体进行包被后，加入增加浓度的SC104抗体。结合SC104抗体利用山羊抗-鼠辣根过氧化物酶和TMB通过ELISA进行检测。为了确定是否SC104可以结合到其自身，加入SC104生物素并且利用SA-HRP/TMB来检测它的结合。对照包括，SC104其不能被SA-HRP/TMB检测到，但是SC104和SC104生物素都可以被山羊抗-鼠HRP检测到。结果以570nm吸光度表示。图23b随后显示在C14抗原的存在下SC104不结合成嗜同性的形式。
板利用C14抗原进行包被并且在每孔中针对抗原添加SC104。这利用山羊抗-鼠HRP/TMB进行确认。随后添加浓度增加的SC104生物素，并且它的结合通过SA-HRP/TMB进行检测。结果以650nm吸光度表示。
图24的图证明了5-氟尿嘧啶和SC104抗体对细胞的功效。C170细胞暴露给SC104或者对照样791T/36抗体(没有显示)和5-FU。利用MTS检测细胞的量，并在490nm读取光密度。
图25的图证明了5-FU，顺铂，丝裂霉素C，奥沙利铂和他莫昔芬对单独的C170细胞或者C170细胞与SC104抗体的结合，或者与单独的SC104抗体的功效。
图26显示的图证明了SC104，5-FU/亚叶酸以及SC104和5FU/亚叶酸的结合对于裸鼠中C170异种移植物的生长的功效。a)当动物在第1，3，5，7，21，22天用SC104ip(0.2mg)、对照抗体ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)或者用SC104ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)处理的时候，在第7，9，12，14和16天通过测量横截面积(mm2)来计量C170异种移植物的生长。b)一幅生存图证明了SC104，5-FU/亚叶酸或者SC104和5-FU的结合对于表达C170异种移植物的裸鼠的存活的功效。动物利用SC104ip(0.2mg)，对照抗体ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)或者SC104ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)在第1，3，5，7，21，22天进行处理。c)在利用SC104ip(0.2mg)、对照抗体ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)或者SC104ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)在第1，3，5，7，21，22天进行处理后，在第7，14，21，28和36天对动物称重。
图27的图证明了SC104，5FU/亚叶酸以及SC104和5FU/亚叶酸对生存在裸鼠中的C170异种移植物的生长的功效。小鼠在第1，3，5，7，21，22天利用5FU/亚叶酸25mg/Kgiv进行处理，并且从第5天开始每周利用SC104抗体(0.2mg)处理三次。当动物利用SC104ip(0.2mg)，对照抗体ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)或SC104ip(0.2mg)和5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kgiv)处理的时候，在第7，9，12，14和16天通过测量截面积(mm2)来测量C170异种移植物的生长。一幅图证明了SC101，5FU/亚叶酸或者SC101和5FU的结合对表达C170异种移植物的裸鼠的存活的功效。
实施例1-SC104单克隆抗体的生产方法免疫大规模的分离肿瘤细胞系被用于SC104生产的免疫策略中，如表1中所给出的方案进行。BALB/c雌性小鼠(6-12周龄，Bantin和Kingman，Hull)使用C146，C168，C170和JW细胞的100μl的悬浮物分别在0，4，13和14月对BALB/c小鼠进行免疫。以5×106细胞/ml的细胞密度被用于开始的两次免疫，密度被降低至5×105细胞/ml以进行其次的两次免疫。在第一种免疫中细胞被悬浮在Freund的完整辅剂中，第二种以及随后的免疫使用Freund的不完整辅剂。在最后的免疫进行后5天，收获脾细胞并与PSNS1细胞融合。
表1-免疫方案
杂交瘤的生产小鼠通过在无菌条件下摘除子宫颈和除去脾脏而处死。脾脏被转移到含有无血清RPMI的培养皿内(20ml，37℃)，并且细胞被轻微地释放到培养基中。组织碎片被允许将细胞悬浮液在重力下处理2分钟。包含在悬浮液中的单独脾细胞随后通过离心进行回收，再悬浮在无血清RPMI中并进行计数。收获的P3NS1细胞被计数和再次悬浮。两个细胞类型以P3NS1∶脾细胞为1∶10的细胞比例进行混合。这种细胞混合物以小球的形式进行回收并且通过轻微地敲打而打散。在1分钟内加入暖和的聚乙烯乙二醇1500(来自Sigma化学的商业上已有的50％溶液)，随后在室温下进行培养(1min)。暖和的无血清培养基在随后的一分钟内被添加，并随后缓慢添加另外的20ml无血清培养基。再悬浮的细胞以小球的形式被回收，并轻微地分散在含有15％胎儿牛血清和HAT选择剂的暖和的RPMI1640中。细胞悬浮物被平分到事先用鼠腹膜分泌细胞(PECS)包被的96板上。这种板随后在37℃，5％CO2，95％空气下进行培养，直到可以观察到存活的杂交瘤细胞的克隆。结肠瘤特异抗体的生产被筛选用于C170细胞作为非竞争性夹层ELISA的基层。来自大量阳性孔的细胞被收集并且以5，2.5，1和0.5细胞/孔(100μl/孔)的细胞密度平铺96-孔板。将孔板在37℃，5％CO2和95％空气中培养，直到具有克隆体的孔中的培养基变成橙色。
筛选工艺ELISA 免疫小鼠血清中的抗体反应使用标准非竞争性ELISA工艺通过滴定进行化验。96-孔组织培养板使用10％胎儿牛血清液中的细胞密度为5×105细胞/ml(100μl/孔)的C170细胞在RPMI1640中进行包被。孔板在37℃，，5％CO2，和95％空气中培养过夜。随后细胞在磷酸缓冲液(pH7.3，PBS)中冲洗两次，然后在PBS中使用0.5％戊二醛进行固定(10min，25℃，100μl/孔)。通过使用1％牛血清蛋白(来自Sigma Chemicals Ltd.的组分V)在PBS中培养1小时以封闭剩余的非特异性结合位点。细胞使用包含0.05％Tween 20的磷酸缓冲液冲洗三次，然后使用非竞争性夹层ELISA来分析结合到C170细胞的激发后(post-boost)血清。前免疫血清被用作阴性对照。
免疫组织化学 杂交瘤悬浮物与肿瘤组织的结合通过冷冻结肠肿瘤切片的间接免疫过氧化酶染色来进行检测。低温贮藏肿瘤的组织切片(5μm)在0.1％NaN3中利用0.3％H2O2进行处理15分钟以抑制内源过氧化酶。其随后在室温下利用在PBS中制备的10％人类血清和1％BSA培养30min，随后杂交瘤悬浮物以饱和水平添加，其提供了最小量的非特异性背景染色进一步持续30min。这种结合抗体利用结合到过氧化酶(Dako Ltd.，Bucks.，UK)的兔抗-鼠Ig进行检测并随后在0.005M Tris-HClpH 7.6中充分冲洗并利用0.05％二氨基联苯胺和0.01％H2O2进行玻片染色，并且利用苏木素进行复染色。
结果SC104是单克隆抗体(mab)其通过具有4种结直肠癌细胞系的小鼠的免疫来进行饲养。它是通过免疫组织化学进行筛选用于结直肠肿瘤切片，并通过ELISA进行筛选用于一种免疫细胞系。它被克隆三次并显示为一种鼠IgG1mab。表2显示了与识别Lewisy/b半抗原的阳性对照抗体相比，它以更大的强度与C170细胞的结合。与Lewisy/b抗体或抗-CEA抗体相比它还显示了结直肠肿瘤具有更强的染色。它显示了正常结肠组织与抗-CEA抗体具有相似的弱染色。
表2-SC104mab的筛选
a--阴性，+最小，2+强，3+非常强实施例2-SC104抗体的测序方法小鼠免疫球蛋白SC104的重链和轻Kappa链可变结构域的扩增和测序。在预先利用ELISA检测了抗体产物后，将总RNA从杂交瘤SC104/1E9中分离出来。利用5μg总RNA合成得到的cDNA用作SC104重链和轻链可变结构域扩增的模板。下面的正向寡聚核苷酸连接到前导序列上，以及反向寡聚核苷酸连接到每条链的恒定区域的CH1区域上，二者分别被用在使用高保真酶pfu turbo(Stratgene)的PCR反应中。
正向引物5’-ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TG-3’重链5’-ATG GAT TT(A/T)CA(A/G)GTG CAG ATT(A/T)TC AGC TTC-3’Kappa链反向引物5’-CCC AAG CTT CCA GGG(A/G)CC A(A/G)(G/T)GGA TA(A/G)ACGG(A/G)T GG-3’重链5’-CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA-3’Kappa链扩增得到的片段被克隆到TA载体pCR2.1(Invitrogen)中。含有插入体的克隆通过限制性分析来进行识别，并通过使用引物T7和M13反向引物(LarkTechnologies)的DNA测序来进行确认。序列被进行分析并且针对抗体SC104的重链和轻链来进行下面的互补决定区的确认(图1a，b和c)。
为了验证测序分析和翻译对于两条链都是正确的，将10μg纯化的和浓缩的SC104抗体进行变性，通过电泳分离在0.75mm的薄层8％SDS-PAGE凝胶上并通过半干电印迹将其转移到PVDF上。利用氨基黑(Amido black)进行染色后Kappa链(25Kda)和重链(50Kda)被分离并利用Edman降解法进行N末端的测序(AltaBiosciences)。进行蛋白测序以确认两个链的分析DNA和翻译序列。
重链可变结构域(55bp-414bp)CDR1(130bp-162bp)G Y S I T S G Y S W HGGCTACTCCATCACGAGTGGTTATAGTTGGCAC按照kabat计数(145bp-162bp)S G Y S W HAGTGGTTATAGTTGGCACCDR2(205bp-252bp)H I H F S G R P T Y N P S L S SCACATTCACTTCAGTGGTAGACCTACTTACAATCCATCTCTCAGCAGT
CDR3(349bp-381bp)K G K G S D D G L N YAAGGGAAAAGGTTCCGACGATGGTTTGAACTAC信号前导序列(1bp-54bp)FR1(55bp-129bp)FR2(163bp-204bp)FR3(253bp-348bp)FR4(382bp-414bp)CH1(415bp在先地)Kappa轻链可变结构域(67bp-384bp)CDR1(136bp-165bp)S A S S S L S Y I HAGTGCCAGCTCAAGTTTAAGTTACATACACCDR2(211bp-231bp)D T S N L A SGACACATCCAACCTGGCTTCTCDR3(328bp-354bp)F Q G S E Y P L TTTTCAGGGGAGTGAGTATCCACTCACG信号前导序列(1bp-66bp)FR1(67bp-135bp)FR2(166bp-210bp)FR3(232bp-327bp)FR4(355bp-384bp)CH1(385bp在先地)实施例3-嵌合SC104单克隆抗体的表达为了验证来自DNA序列的功能性抗体的表达，通过使用设计的互补寡聚核苷酸进行位点引导的突变来将Afe1和BsiW1限制位点连接到pCR2.1内框架4的末端以结合到重链和轻链可变结构域中。
重链可变区Afe1正向引物5’-CTCA GTC ACC GTC TCTAGC GCTAAA ACG ACA CCC CCA CC-3’反向引物5’-GG TGG GGG TGT CGT TTTAGC GCTAGA GAC GGT GAC TGA G-3’轻链可变区BsiW1正向引物5’-CC AAG CTG GAA ATG ACACGT ACGGAT GCT GCA CCA ACT G-3’反向引物5’-C AGT TGG TGC AGC ATCCGT ACGTGT CAT TTC CAG CTT GG-3’鼠科动物的SC104的重链和轻链可变结构域从pCR2.1中分离出来并分别克隆到哺乳动物表达载体pDCORIG IB融合框的HindIII/Afe1和BamHI/BsiW1位点，并且这种载体分别融合了每条链的人类Fc恒定区域。这种质粒通过限制性分析来识别并通过DNA测序来确认。
按照生产商的说明书利用15μg上述的质粒和genejuice(Novagen)对CHO-S进行稳定地转染。转染被选择在含有Zeocin(300μg/ml)的培养基中进行14天。分泌自转染体的功能性嵌入型SC104抗体的表达通过结合到细胞系C170细胞的表面和流式细胞术来确认(图1d)。
简要地在RPMI/10％FCS中清洗后，C170细胞在含有嵌入型抗体的消耗培养基中或者在单独的培养基中在4℃培养30分钟。细胞被清洗并随后在含有结合了兔抗-人IgG抗体的FITC(DAKO，F0123)中继续在4℃培养30分钟，其中这种抗体对CH2区域具有抗体特异性。细胞再次被清洗，再次悬浮并利用流式细胞术来分析。
实施例4-使用SC104单克隆抗体的结合研究试验1方法正常和肿瘤组织的免疫组织化学染色 人组织来自于Inveresk认可的提供者。使用的每种组织被急速冷冻在液氮中并储存在接近-70℃(±10℃)下。冷冻切片被切割并放置到超冷冻正片(super frost plus slides)上。所有的组织样品都使用适应于每种组织的抗原标记进行处理来确认在那种组织中抗原的保留性。所使用的标记物是，角蛋白对应上皮支撑组织，CD45对应所有淋巴组织，以及结蛋白对应所有的心脏和骨骼肌组织。每种组织都对来自于三个不相关的提供者的组织进行试验。所使用的染色方法是间接的、2或3步的方法，使用与亲合素-生物素复合体结合的二级和三级抗体。使用过氧化氢来阻断内源性过氧化物酶活性。利用系列的亲合素-生物素来处理所有的组织切片从而阻断内源生物素。当使用三级抗体时，所有的组织切片都利用正常猪血清来处理，其抑制三级抗体和组织的结合。免疫组织化学染色方法的确认是通过对阳性对照组织的染色、对阴性对照的没有染色以及固定对对照组织染色的影响来确定。针对六个提供者的结肠肿瘤和一个心脏在50μg/ml浓度下测验SC1040。组织在丙酮或者中性缓冲的福尔马林中进行固定。两个结肠肿瘤样品染色良好，足以用作阳性对照，而心脏中没有染色。中性缓冲的福尔马林被发现是最佳固定剂。提供最大染色强度的SC104的最低浓度是1μg/ml，并且这种浓度被用于接下来的工作中。
结果筛选SC104对大量的冷冻肿瘤和正常组织切片的结合(表3)。结肠、子宫内膜、食管、腮唾液腺和胃的新生上皮细胞具有阳性染色，而在六个乳房肿瘤的三个中少数上皮细胞具有较低强度的染色。阳性染色出现在正常大肠、腮唾液腺、扁桃腺和子宫颈的上皮细胞中。较低强度的染色出现在膀胱的少数移行上皮细胞、一个提供者的散在的胸腺淋巴细胞、皮肤的腺上皮细胞、前列腺、乳房和输卵管的上皮细胞、卵巢卵泡细胞、肺部的肺泡衬里细胞，以及一个提供者脑部的胶质细胞中的少数细胞。胃和小肠中的粘膜染色呈阳性。在正常人心脏、肾脏、胎盘或脾中没有特异性染色。这些结果提示抗原可以在大量的上皮细胞中表达，但是它主要定位于消化道内。免疫组织化学提示这种抗原在结直肠肿瘤上比临近的正常组织更为强烈的表达。
表3-SC104抗体与冷冻肿瘤和正常组织切片的免疫反应性
注ND未做。
试验2
方法通过间接免疫荧光和流式细胞术分析与肿瘤细胞系的结合。将C170、Colo205、MKN45、R1D9和791T细胞(105)重悬在50μl的SC104mab中(0-20μg/ml)并在冰浴上培养20分钟。在RPMI/10％FCS中洗涤样品三次后，细胞与FITC标记的兔抗小鼠(1/50Dako Ltd，Bucks，UK)抗体一起培养并在FACScan上(BectonDickinson，Sunnyvale，CA)进行分析前在冰浴上培养30分钟。结果表示为平均线性荧光(MLF)。
通过ELISA分析与肿瘤细胞的结合。使用细胞浓度为5×105细胞/ml(100μl/ml)在含10％胎牛血清的RPMI1640中利用细胞包被96-孔组织培养板。将这种板在37℃、5％CO2、95％空气中培养过夜。在使用含0.5％戊二醛的PBS进行固定前(10分钟，25℃，100μl/孔)，先利用磷酸盐缓冲液(pH7.3，PBS)洗涤细胞两次。通过在含1％牛血清白蛋白(来自Sigma Chemicals Ltd.的组分V)的PBS溶液中培养1小时来将剩余的非特异性结合位点封闭。细胞使用含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤三次。细胞与SC104(1μg/ml)在室温下一起培养1小时并随后用山羊抗小鼠辣根过氧化物酶和ABTS检测结合的抗体。结果表示为405nm处的吸光度。
结果抗原表达的进一步表征通过在大量肿瘤细胞系上的ELISA反应来进行(图2a)。SC104抗体主要与消化道来源的细胞系结合。SC104结合到C170、Colo205和R1D9细胞，MLF为1500至4,000。
试验3方法原代肿瘤的结合。肿瘤标本在进行结直肠肿瘤切除术时获得。标本被精细切碎并利用0.05％胶原酶(IV型，Boehringer Mannheim，Lewes，UK)在37℃下解体20分钟。取肿瘤细胞悬浮物并利用Hanks平衡盐溶液(Gibco BRL，Paisley，UK)洗涤3次。向剩余的组织中加入新鲜的胶原酶并将其进一步再培养20分钟。将这种过程重复两次后，合并来自全部解体物的细胞并将它们再次悬浮到含20％胎牛血清(Gibco)的Dulbecco培养基中。细胞与SC104mab(1μg)一起在4℃下培养1小时。细胞被洗涤两次并与FITC-结合的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako Ltd.，Bucks.，UK)一起进一步培养1小时。正常的小鼠免疫球蛋白被用作阴性对照，其荧光值从由SC104获得的荧光值中减去。将细胞洗涤三次后在FACSan(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)上进行分析。结果表示为平均线性荧光(MLF)。实体肿瘤的解体产生了包括血红细胞、淋巴细胞、基质细胞、巨噬细胞和内皮细胞的混合细胞群体。通过细胞角蛋白mab Cam 5.2染色测量得到的上皮细胞的百分比仅仅为22±13％(范围10-60)。但是，按照前向角光散射门控(forward angle scatter gating)选择性分析细胞，分析细胞中恶性细胞大小范围内79±4％(范围69-86)是上皮细胞。进而，肿瘤之间的变异被相当地降低。通过抗-CD45mab F-10-89染色测量得到的全部有核细胞中自细胞的百分比为74±16(范围40-90)。FACS IV门控恶性大小以后，这被显著降低至5.5±5％(范围1-20)。恶性大小范围的分析细胞群体中基质细胞的百分比为3.5±3％(范围1-13)。
结果SC104也显示可以强烈结合到＞80％的新鲜解体的结直肠肿瘤细胞，该细胞中平均抗原浓度为4×105抗原/细胞(范围1.5-10×106抗原/细胞；图3)。
试验4方法肿瘤和正常膜提取物的结合。制备得到结直肠肿瘤的和正常结肠膜的核外提取物，并通过ELISA来检测与SC104的结合。
结果为了进一步定量通过免疫组织化学获得的差异染色，制备来自于切除术边缘的原代结直肠肿瘤和正常结肠的核外膜制备物。这些膜与SC104的ELISA染色反映出对于正常结肠为轻度染色，而对于肿瘤膜为中度至重度染色，观察到的平均T∶N值为6∶1(表4)。
表4-SC104对肿瘤和正常膜提取物的相对结合
试验5方法与纯化的抗原制备物的结合。C14抗原(通过在C14单克隆柱上的亲和层析而从唾液中纯化得到的90KDa糖蛋白)，CEA(利用365mab通过亲和层析从结直肠肿瘤活体转移物中纯化得到的180KDa糖蛋白)和糖脂提取物(用3∶1甲醇氯仿w/v从结直肠肿瘤中提取的糖脂)通过在37℃培养过夜以干燥在微孔板上。SC104mab的结合通过上面所述的ELISA进行检验。
Lewisy半抗原与I型和II型H血型抗原(Sigma，Poole，Dorset)通过在37℃过夜培养来干燥在微孔板上。SC104mab的结合通过上面所述的ELISA进行检测。
结果为了试验和鉴定由SC104抗体识别的抗原的本质，它被用来染色三种不同的抗原制备物(图4)。第一个是CEA，因为它是公知的由结直肠肿瘤表达的免疫原性抗原。虽然抗-CEA抗体显示了很好的反应性，但是没有观察到CEA的显著染色，确认了功能性抗原的存在。第二个制备物是表达从唾液提取的糖蛋白的Lewisy/b。这种抗原是一种90KDa的糖蛋白，其携带了宽范围的碳水化合物残基。抗-Lewisy/b抗体和SC104抗体都结合到这种糖蛋白上，但是抗-CEA抗体没有实现结合。当使用甲醇/氯仿肿瘤糖脂提取物进行检测时得到了相似的结果。这些结果证明SC104识别表达在糖蛋白和糖脂上的碳水化合物残基，并且它可以识别Lewisy/b。为了验证SC104是否不结合到血型类抗原上，通过ELISA来筛选它与Lewisy、I型和II型H血型抗原的结合(表5)。抗-H抗体强烈结合到所有三种半抗原上，Lewisy/b抗体结合到Lewisy半抗原上，但是SC104不与这些半抗原中的任意一种反应。
表5-SC104与血型抗原的结合
实施例5-鉴定由SC104单克隆抗体识别的肿瘤糖脂试验1脂提取和免疫染色方案的优化方法从C170肿瘤细胞中提取脂质 C170细胞的沉淀(1ml压积细胞体积)通过胰酶处理静止贴壁的组织培养物得到。将沉淀在PBS中进行洗涤并吸取多余的缓冲液，接下来进行离心，并随后储存在-80℃。沉淀物利用氯仿/甲醇(3∶1，v/v，19ml)进行提取。得到的乳化液在50ml抗溶剂的(Tefzel)离心管中在8,000rpm下4℃离心15分钟。使用旋转蒸发器在30℃对悬浮物进行干燥，并再次悬浮在小体积(～1ml)的氯仿∶甲醇∶0.5％CaCl2(水)(50∶40∶10)中。
脂提取物的HPTLC分析 样品重复点样在Merck HPTLC板上并以氯仿∶甲醇∶0.5％CaCl2(aq)(50∶40∶10)展开以作为标准。板被干燥并随后放置在碘蒸气罐中。条带用铅笔进行标记并且进行蒸发过夜以从板上除去碘。板随后进行免疫染色从而定位这种抗原。
展开的HPTLC板的免疫染色 为了进行SC104免疫染色，将板在聚异丁基甲基丙烯酸甲酯(0.1％w/v溶液)正己烷∶氯仿(9∶1)中浸入15秒随后进行干燥。板随后在含3％BSA的PBS中在室温下封闭1小时，随后培养在测试抗体溶液中(10μg/ml)或者BSA溶液中，在室温下培养1小时。随后将板在PBS/Tween-20(0.1％)中洗涤三次后，将板与来自Dako的兔抗小鼠HRP偶联体一起在室温下培养1小时。板随后在PBS/Tween-20(0.1％)中洗涤三次并在10mM Tris，100mM NaCl pH7.0，0.1％Tween-20中洗涤一次，并在Sigma-FAST BCP/NBT试剂中进行显色。
展开的HPTLC板的化学染色 苔黑酚染色用于检测碳水化合物结构的存在。展开的HPTLC板被干燥后，利用苔黑酚试剂进行喷洒直到完全包被。板在热空气流中进行干燥并且在100℃培养15分钟。茚三酮染色被用来检测包含氨基基团的分子。展开的HPTLC板首先进行干燥，并随后浸没在茚三酮溶液中(0.25％茚三酮w/v的丙酮溶液)直到完全湿润。板随后允许在室温下显色几个小时。
结果发现这种抗原可以成功地从3∶1氯仿∶甲醇混合物中提取出来，与原始的2∶1溶剂提取比例相比没有改变检测到的条带数目。但是，增加溶剂至4∶1氯仿∶甲醇时明显减少了通过HPTLC检测到的条带数，并且因此不能被用于提取目的。早期的免疫染色试验也使用了在0.1％w/v聚异丁烯甲基丙烯酸酯的正己烷溶液中培养HPTLC板60秒的时间；但是发现必须将时间减少到15秒的时间来提供抗原的可重复性检测。最后发现在与磷酸酯酶一起培养前必须包括HPTLC板的无磷酸盐洗涤步骤从而保证最大的灵敏度。
SDS-PAGE以及Western印迹试验先前显示了SC104抗原可以在全细胞提取物、细胞裂解物和细胞膜制备期间产生的不溶性沉淀中检测到。但是这种抗原不能在细胞膜制备物自身中探测到。另外，HPTLC分离和免疫染色膜制备中产生的不溶性沉淀也可以检测到抗原。这表示抗原是一种脂质或者一种极疏水性的蛋白质。
试验2用硅胶柱色谱分析含抗原的级分方法脂提取物的硅胶柱分级 重力柱(150mm i.d)用氯仿∶甲醇∶0.5％CaCl2(水)(50∶40∶10)中的硅胶浆进行填充。C170提取物，再溶解在～1ml氯仿∶甲醇∶0.5％CaCl2(水)(50∶40∶10)中，并被装入这种柱上，使用相同的溶剂条件进行洗脱。收集各级分并使用HPTLC进行分析。SC104免疫染色被用于定位抗原，使用化学染色方法来进一步标记所述级分。
神经酰胺聚糖酶消化抗原 神经酰胺聚糖酶(glycanase)消化被用来从糖脂类分子中释放寡糖。将在50mM醋酸钠，pH5.0，0.1％w/v胆酸钠中的抗原溶液和神经酰胺聚糖酶溶液(每50μl抗原使用1μl)进行混合并在37℃下培养3小时。通过与250μl氯仿∶甲醇(2∶1)进行混合并随后进行简单分离来将这种去糖基化的脂类从被释放出的寡糖中分离出来。上层的水相从下层的有机相中分离，二者分别进行干燥。
结果C170脂质提取物的小规模级分(从～0.5ml压积细胞体积中获得)通过使用50∶40∶10氯仿∶甲醇∶0.5％CaCl2(0.5％w/v水溶液)作为流动相而在～10ml床体积硅胶柱上进行证明。但是，为了进行抗原表征，必须将这种方法按比例扩大。这可以显示为可以使用～10ml的压积细胞体积来获得脂提取物，并将柱体积增加至～36ml。
全脂提取物被装填在按比例增加体积的柱上，收集级分，并利用免疫染色来检测包含抗原的级分(图5)。检测得到一种RF为0.53的抗原。HPTLC和化学染色随后被用于进一步表征这种级分。HPTLC板的苔黑酚染色被用来检测糖脂的碳水化合物结构。这显示出RF为0.50至0.61之间的三个条带，并似乎相当于抗原的原始RF值。但是，与苔黑酚染色同时进行的重复免疫染色显示出了抗原RF值的不寻常变化，在RF为0.36至0.39之间检测到3个条带(图6)。这可以说明通过苔黑酚染色检测到的条带不相当于抗原，而是代表糖脂污染物。
为了确定这种抗原是否是蛋白，通过SDS-PAGE和Western印迹来分析所得的级分。凝胶的银染色显示了非常低水平的蛋白污染物；但是Western印迹反应在制备物中没能特异性检测到任何抗原，表明这种抗原自身不是一种蛋白。
含抗原的级分的一部分通过使用神经酰胺聚糖酶进行消化来除去碳水化合物。使用2∶1氯仿∶甲醇来从脂质部分分离得到聚糖；这种预测的游离多糖分配进入甲醇部分，而去糖基化的脂质分配进入氯仿部分。随后对完整的糖脂以及去糖基化脂类的HPTLC板实施免疫染色和化学染色技术。免疫染色显示出完整的糖脂中存在抗原(RF0.38-0.46)而去糖基化的脂质中没有(图7)。但是，随后的试验证明了未消化抗原的分配是高度可变的，这种抗原有时在水相中检测到，有时在有机相中或者在两个液相中都存在。因此，没能在神经酰胺聚糖酶处理的有机相中检测到抗原不能作出结论性判断。这可能是由于抗原分配进入了水相，而不是神经酰胺聚糖酶除去了抗原。
为了确认上面的试验，在降解后对将被分析的有机相和水相重复上面的试验。HPTLC和碘染色样品的分析证明SC104没能结合到除去了的寡糖的两个级分上(图8)。这表示SC104识别完整的糖脂，并且这种识别在除去寡糖后不能实现。
磷脂例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和相关的脂肪lyso基团具有游离氨基，其可以通过茚三酮染色来检测。完整的糖脂以及神经酰胺聚糖酶处理的级分的HPTLC和茚三酮染色证明了RF值在0.51至0.51之间的磷脂的存在。但是，这可能是一种与抗原共迁移的污染物，特别是有文献提示当使用单个硅胶柱纯化方法时磷脂和糖脂的共洗脱是一个普遍的问题。这提示了这种方法不足以分辨这种来自完整提取物的抗原到足够纯度以帮助表征。
试验3方法如上所述从～2ml压积细胞体积的C170细胞中提取脂类。蒸发后提取物再次悬浮在～1ml氯仿中。在100％氯仿中制备得到10ml床体积的硅胶柱(150mm i.d.)。样品被加到柱上并用下述溶液进行梯度洗脱10个柱体积的氯仿，以洗脱简单脂类；40个柱体积的丙酮，以洗脱中性的糖脂；10个柱体积的甲醇，以洗脱神经节苷脂和磷脂。这些级分被收集并利用旋转蒸发进行干燥，在分析前储存在4℃下。
抗原的神经氨酸酶消化 抗原溶液(5μl)与5μl 10×缓冲液合并，提供神经氨酸酶，以及10μl的神经氨酸酶溶液。最终体积被调到50μl，混合并在37℃下培养1小时。
通过酸水解的化学去唾液酸 0.05M硫酸中的抗原溶液在80℃加热2小时。随后样品被冷却并在分析前储存在4℃下。
结果为了从磷脂中除去糖脂，使用氯仿平衡10ml的硅胶柱。从～2ml压积细胞体积中得到C170全脂提取物。这被加到柱上并使用氯仿进行洗柱，以洗脱简单的脂类；丙酮，以洗脱糖脂；以及最后用甲醇洗脱磷脂。
在全提取物和磷脂级分中的至少三个条带中(RF为0.54，0.51和0.41)以及单一脂类级分中的一个条带中(RF为0.51；图9)进行HPTLC分离和免疫染色检测。但是，在糖脂级分中没有检测到抗原。茚三酮染色反映了仅仅在全提取物和磷脂级分中存在磷脂。但是，苔黑酚染色证明了糖脂出现在糖脂级分和磷脂级分中。显著地，在磷脂级分中观察到两个明显的条带(RF为0.54和0.51)，这表明其与抗原共迁移，再次指出了抗原可以携带碳水化合物结构。
进一步研究表明，虽然上面的方法可以用于从磷脂、与磷脂共洗脱的唾液酸化糖脂中分离得到中性糖脂。这个，并结合与抗原共迁移和苔黑酚阳性条带，为这种抗原可能是一种唾液酸化糖脂提供了一些证据；而在中性糖脂级分中缺少抗原就提示这种糖脂必定是唾液酸化的以使其被SC104识别。
进一步证明抗原是唾液酸化糖脂而不是磷脂的证据是通过使用2D HPTLC分离全脂类和使用免疫染色和化学染色来分析HPTLC板来得到的。HPTLC板在一维方向上是使用标准50∶40∶10氯仿∶甲醇∶CaCl2溶液混合物进行展开的。这种板随后被干燥，在90℃旋转蒸发，并在氯仿∶丙酮∶甲醇∶醋酸∶水10∶4∶4∶2∶1中进行展开。免疫染色显示出在二维方向上抗原出现了很小的迁移(图10)。这再一次证明了抗原不是一种中性糖脂，因为中性糖脂在丙酮中是迁移的。碳水化合物的苔黑酚染色再次显示了一个条带，其在两维方向上都与抗原一起迁移，同时游离氨基基团的茚三酮染色证明了一种化合物其在一维方向上与抗原联合迁移，但是随后其在二维方向上与抗原实现分离。
神经氨酸酶消化被用于检测唾液酸的除去对抗体识别的影响。在神经氨酸酶处理之前或之后HPTLC分离的磷脂/神经节苷脂样品的免疫染色提供了两簇条带；其中极性较大的一簇在RF0.46，以及极性较小的一簇在RF0.62(图11)。虽然在神经氨酸酶处理之前或之后检测到相同的条带，但是在染色特性上存在强度方面的不同。与没有进行处理的对照样相比，神经氨酸酶处理在RF0.46簇处产生了更强的染色，以及在RF0.62簇处产生了更弱的染色。这表明虽然唾液酸仅仅除去了一部分，因为这种条件还没有被优化，但是从更大极性RF0.62簇中去除唾液酸导致形成了更小极性簇的分子，其仍然可以被抗体检测到。因为在部分神经氨酸酶消化后检测到的最小极性条带与未处理过磷脂/神经节苷脂级分中的最小极性条带共迁移，推测这种簇其自身一定对应于唾液酸化形式，可能是单唾液酸化的形式，同时更大的极性对应于二唾液酸化的形式。
随后硅胶柱色谱被用于分级差异唾液酸化的糖脂。脂质提取物的样品被装填在柱上，并且级分被洗脱以获得简单脂类(氯仿)；无唾液酸化糖脂和磷脂(氯仿∶甲醇∶丙酮∶醋酸∶水52∶8∶8∶18∶4，随后用氯仿∶甲醇4∶1)；单唾液酸化糖脂(氯仿∶甲醇2∶3)；二唾液酸化糖脂(氯仿∶甲醇∶水65∶25∶4)以及最后的多唾液酸化糖脂(氯仿∶甲醇∶水60∶35∶8)。然后级分被干燥并利用HPTLC进行分析，随后进行免疫染色和化学染色(图12)。
苔黑酚和茚三酮染色显示了磷脂和糖脂同时出现在唾液酸化糖脂级分中。但是这种抗原再次显示了仅仅与苔黑酚阳性糖脂共迁移，而不与茚三酮阳性磷脂一起迁移。
这些样品的HPTLC和免疫染色显示了在全提取物中的抗原的三个簇(RF～0.49，～0.38和～0.24)，其中最大极性的簇仅仅显示了非常微弱的染色。在简单脂类级分或者磷脂/中性糖脂级分中没有观察到抗原，但是在唾液酸化级分中检测到抗原。这证明了抗原是一种唾液酸化糖脂而不是磷脂。在单唾液酸化级分中检测到两个条带簇(RF～0.49和RF～0.38)。在二唾液酸化级分中可以看到针对最大极性簇(RF～0.24)和最小极性簇(RF～0.49)的微弱染色，以及在中间簇(RF～0.38)检测到最强的染色。在多唾液酸化级分中可以看到两个簇(RF～0.38和RF～0.24)。这表明最小极性簇是单唾液酸化，中间簇代表二唾液酸化结构以及最大极性簇具有三个和可能四个唾液酸。
随后用酸水解来对抗原进行化学法去唾液酸化。这种方法与酶处理相比更为有效并可以更好地产生唾液酸的完全去除。HPTLC和SC104免疫染色证明了唾液酸的化学去除产生了SC104结合的完全丧失，进一步提供了证据证明抗原的唾液酸化对于抗体结合是必需的。
因此SC104似乎结合到了单、二以及甚至多唾液酸化糖脂上。但是其不结合无唾液酸形式。这表明抗原必须是单唾液酸化的，但是存在更多唾液酸不影响与SC104的结合。对于二唾液酸化形式的染色强度的增加也证明了除了仅仅需要唾液酸的存在外，这种抗原通常还发现带有两个唾液酸。但是，是否这依赖于收获前C170细胞的年龄和培养条件，则目前是不清楚的。
试验4抗原与商品脂类标准样的比较方法SC104抗原已经与多种商品脂类标准样进行了比较。每种标准样的实例被点样在HPTLC板上并在50∶40∶10氯仿∶甲醇∶CaCl2(0.5％w/v)中进行展开。板也使用部分纯化的SC104抗体进行显色。每种标准样的迁移通过碘蒸汽染色进行检测以及每种标记在板上的位置。板随后用SC104进行检测。观察到没有标准样可以被SC104识别，这提示没有标准样可以代表该抗原。
结果从标准样中获得的RF值显示在下面的表6中。这些数值也与从不同唾液酸化SC104抗原中获得的RF值的范围进行比较，按照极性和唾液酸化程度增加的顺序进行排列。
表6
可以看出最小极性SC104抗原与GM3共迁移，同时最大极性分子以近似于GD1a和GD1b的RF值进行迁移。但是，在所有情况下标准样自身都没有被识别。
抗原迁移的RF值与许多标准神经节苷脂相当，以及需要唾液酸化，提示抗原具有由三个或四个单糖组成的短中性寡糖骨架。很可能这实际上是一种丁糖基(tetraosyl)结构，因为这可以更容易地进行多唾液酸化。检测到的最小极性的抗原可能是一种部分抗原结构，由较短的寡糖骨架组成。
实施例6-鉴定被SC104mab识别的肿瘤糖蛋白试验1方法
SC104抗原的纯化和表征 SC104特异性抗原从唾液样品中纯化得到并与0.1M pH7.6的Tris 0.5％NP40以1∶1进行混合。简单的说，使用二甲基庚二亚胺二盐酸盐作为共价连接剂将SC104 S136A交联至蛋白A Cl-6B琼脂糖而产生了免疫-亲和。
结果值得注意的是尽管发现抗原与SC104交叉反应(图13a)，它不与抗-唾液酸Lewisa或19/9抗体交叉反应。
试验2方法SC104抗原的序列鉴定 SC104特异性抗原按照上述试验1中所述从唾液中纯化得到，并且这种样品在10％SDS-PAGE上跑胶并且按照供应商说明书进行银染色(Bio-Rad银染试剂盒，目录号1610443)。感兴趣条带随后进行MALDI分析。
结果一条在50-75kDa之间的SC104抗原的条带在银染凝胶上被鉴定(图14)。MALDI序列分析提示几个可能的情况，包括P04839GP91-PHOX)(GP91-1)(血红素结合膜糖蛋白)Q99741细胞分裂控制蛋白6同源物(CDC6-相关蛋白)Q14451生长因子受体结合蛋白7(GRB7接头蛋白)P14618丙酮酸激酶，同功酶M1/M2(EC 2.7.1.40)(丙酮酸激酶肌肉同功酶)O96013丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶PAK 4(EC 2.7.1.37)(p21-活化激酶4)P01833(聚合的Ig受体)因为SC104识别一种碳水化合物，这些结果证明唾液酸丁糖基糖也可以在这些糖蛋白上表达。
试验3方法用SC104蛋白A琼脂糖柱并用免疫纯化的抗原进行竞争试验 利用基于ELISA技术的试验并使用SC104纯化级分作为SC104的竞争剂来结合C170细胞(图15)。微量滴定板用5×104/孔的C170进行包被，在与生物素化抗体和增加比例的抗原混合得到的溶液进行培养前，将细胞固定和封闭。通过SA-HRP和TMB来检测结合的SC104生物素化抗体。结果表示为650nm吸光度。
结果这种使用蛋白A Cl-6B琼脂糖免疫亲和柱免疫-纯化的SC104抗原已经证明了它可以特异性抑制抗体和它的目标物之间结合。
实施例7-SC104直接诱导肿瘤细胞死亡试验1方法膜联蛋白/PI. 悬浮的肿瘤细胞(1×105等分)与SC104抗体(1μg/ml)或者适当的对照样一起在室温下培养4小时，然后也可以利用FITC标记膜联蛋白和碘化丙啶(Sigma，Poole，Dorset)进行染色并随后使用双色流式细胞术来进行分析。
结果这项研究已经显示新解体的结直肠肿瘤的强染色。但是在这些研究中，没有发现SC104抗体显示加速肿瘤细胞死亡。当肿瘤细胞系被放入悬浮物中时其通常以粘贴壁层的形式生长，用SC104抗体进行染色以用于流式细胞术分析时发现了相似的情况。为了确定抗体是否引起细胞凋亡或细胞坏死，暴露于SC104抗体的细胞利用膜联蛋白和碘化丙啶进行反染色(图16)。使用对照抗体的细胞中少于25％的细胞显示了可以被膜联蛋白和碘化丙啶进行染色。相比较暴露于SC104浓度高于10μg/ml的溶液时显示强染色的为，细胞的30％被膜联蛋白染色，细胞的75％被PI染色以及65％被两者染色。单独使用膜联蛋白染色的细胞被描述为在细胞凋亡的早期，而细胞凋亡/细胞坏死的晚期细胞同时被膜联蛋白和PI所染色。
试验2方法Pan caspase活化 2×105结直肠C170细胞被暴露于30μg/ml的SC104中少于6小时的时间，并且pan caspase FITC-FMK-vad(caspACE FITC-vad-FMK，Promega，目录号G7462)被用于建立caspase活化。这种细胞利用流式细胞术进行分析。对照样包括一个阴性对照鼠抗体以及100ng/ml的Fas抗体。
结果试验的结果证明了5小时后SC104活化了pan caspase(图17)。
试验3方法由SC104mab活化Caspase6 2×105结直肠C170细胞被暴露于1-100μg/ml的SC104中6小时并且产生细胞裂解物。这种裂解物随后在12％的SDS-PAGE上跑胶，进行Western印迹反应并使用caspase 6特异性抗体(切割caspase 6抗体，CellSignalling Technology(NEB)，目录号9761)进行检测。暴露于SC101的细胞被作为阴性对照。
结果Western印迹显色(图18)清楚地证明了在这些暴露于10μg/ml以及更大浓度为100μg/ml的SC104mab的C170细胞中产生了caspase 6的活化。那些利用SC101mab处理的细胞显示没有caspase 6的这种活化。
试验4方法SC104对使用z-FMK-vad caspase抑制剂的细胞死亡的抑制 2×105C170细胞与3μg/ml的SC104反应，其中一半还与3μMz-FMK-vad抑制剂(Promega，目录号G7232)一起培养并培养过夜。随后时间中细胞生存力使用膜联蛋白V FITC和碘化丙啶进行测试。
结果在抑制剂的存在下活细胞增加了23％(图19)，提供了有利的证明说明SC104通过“经典”凋亡途径杀死了结直肠细胞。
试验5方法细胞生长的抑制 1×103结直肠C170，C168，C146，CaCO2，Colo205，LoVo和HT29细胞被平分到平底96-孔板的每个孔中并在37℃下放置过夜进行贴壁。接下来的时间里细胞使用10，3，1，0.3和0μg/ml的SC104mab进行处理。作为阴性对照的791T/36的浓度为100，30，10，3和0μg/ml，针对所用药物的每种浓度进行滴定。三倍重复的孔被使用。在向每个孔中加入MTS试剂之前细胞在37℃下放置5天，并在490nm处读取光密度。
结果利用MTS试验来测定SC104对贴壁细胞增殖的影响。在浓度超过10μg/ml的时候SC104，但对照抗体没有，抑制结直肠肿瘤细胞系C170和Colo205但没有抑制HT29和LoVo的生长(图20)。图21证明了IC50适用于肿瘤细胞系C170，Colo205，HT29和LoVo。从其它的乳房和结直肠肿瘤细胞系中获得了相似的结果(表7)。这些结果证明了SC104在高浓度下是通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增殖的。但是悬浮细胞已经丢失了细胞/细胞间的接触，在较低抗体浓度下被敏化而迅速死亡。
表7-SC104抑制细胞生长
试验3-嗜同性结合方法新鲜和固定细胞的FACS C170细胞(105)或者新鲜的或者是使用0.5％戊二醛固定1小时，将其重新悬浮在100μl的SC104mab中(0-100μg/ml)并在冰浴上培养1小时。在RPMI/10％FCS中洗涤样品三次后，细胞与FITC标记的兔抗-鼠(1/80Dako Ltd，Bucks，UK)抗体一起培养，并在上面所述的FACS分析前在冰浴上培养30分钟。
嗜同性结合的ELISA 平flexi 96孔ELISA板用抗-鼠IgG Fc特异性抗体进行包被，或者使用PBS中的3μg/ml C14抗原进行包被，并干燥过夜。在利用PBS/1％BSA在室温下封闭1小时之前将板洗涤3次。在冰浴上加入SC104抗体(0-100μg/ml)1小时。在PBS/0.05％Tween-20中将板洗涤3次后，加入生物素化SC104并在冰浴上培养30分钟。接下来进一步在PBS 0.05％Tween-20中洗涤3次，根据需要加入抗-鼠SA-HRP(1/1000；Dako，High Wycombe，UK)或者山羊抗-鼠Fc(1/1000；Dako，High Wycombe，UK)，并在冰浴上放置30分钟。在向每孔加入100μl TMB底物之前将板在PBS/0.05％Tween-20中洗涤5次，并在570nm读数。
结果在C170肿瘤细胞表面的SC104半抗原的数量为每个细胞约4×105个位点。但是抗原的数量在SC104为1μg/ml的时候很容易被饱和。因此很难解释为什么细胞死亡需要超过10倍量的抗体。可能是在抗体结合上暴露出了更多的位点。因此制作了关于新鲜和固定细胞的抗体饱和曲线。抗原甚至在SC104浓度为100μg/ml的时候还没有饱和，并且在新鲜和固定细胞上曲线的相似使其不可能显示出更多的抗原(图22)。这些结果与已经报道的在R24鼠mab上识别GD3神经节苷脂的数据相似。这种抗体显示了不可饱和的抗体结合并且在一系列完美试验中显示是嗜同性结合抗体，具有结合抗原和其自身的能力(结果没有显示)。因此利用没有标记的SC104包被的ELISA板来筛选具有结合自身能力的SC104，并且检测与SC104生物素HRP-亲合素的结合。SC104不能结合自身(图23)，但是当纯化的表达SC104半抗原的糖蛋白被用于包被板的时候，SC104计量的结合直到10μg/ml并且随后在这个浓度以上出现了指数性的结合(图23)。这些结果表明在低抗体浓度时抗体结合抗原，但是在高抗体浓度时结合于抗原的抗体也可以进一步结合抗体。这可以大大增加抗体的功能性亲合度，并导致在具有高浓度抗原的细胞上建立起抗体网格。在高抗体浓度时这种网格的形成可以产生多种引起细胞凋亡的信号。
试验4-与细胞毒性药物结合使用在体外对细胞生长的抑制1×103结直肠C170被平均分到平底96孔板的每个孔中并在37℃放置过夜进行贴壁。第二天中细胞利用顺铂、丝裂霉素C、奥沙利铂和他莫昔芬在最终浓度为10，3，1，0.3，0.1和0μM情况下进行处理。对于每种药物浓度滴定下述浓度的SC10410，3，1，0.3和0μg/ml。作为阴性对照的791/T36对于使用的每种药物浓度滴定下述的浓度100，30，10，3和0μg/ml。两倍重复的孔被使用。在向每个孔加入MTS试剂前将孔板在37℃下放置5天的时间并在490nm处读取光密度。
结果在体外通过MTS试验筛选SC104与化疗剂一起显示的加和性杀死能力。在存在SC104或者对照抗体的情况下(0.3-100μg/ml)所有的药物以如下浓度进行滴定(0.1-10μg/ml)。图24显示了一个利用SC104和5-FU的组合来处理细胞的代表性实验。图25总结的结果显示SC104与顺铂、丝裂霉素C、5-FU和他莫昔芬一起使用时表现出了加和性杀死作用。与奥沙利铂一起使用没有发现加和效果。
试验5-与细胞毒性药物结合使用在体外对于肿瘤细胞生长的抑制方法预防模型 结直肠肿瘤细胞系，C170被连续传代保持在裸鼠中。为了进行治疗小鼠被处死并切除肿瘤。肿瘤细胞被精细地切碎并在麻醉下植入3mm2的片到30只雄性小鼠的皮下，小鼠已经随机地分入四个实验组中。
小鼠被移植入3mm3的C170异种移植物片。小鼠组通过在第1，3，5，7和28天的静脉内注射进行5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kg)处理。在同一天里小鼠由腹膜内注射0.2mg的SC104mab。对照小鼠单独接受SC104或者对照小鼠IgG抗体及5-FU/亚叶酸。肿瘤的尺寸通过两脚规来进行测量，并且在第7，9，12，14和16天计算肿瘤的横截面积。称量动物体重来评价治疗的毒性。在实验的最后肿瘤被称重来评价抗肿瘤效果。
治疗模型 结直肠肿瘤细胞系，C170被连续传代保持在裸鼠中。为了进行治疗小鼠被处死并切除肿瘤。肿瘤细胞被精细地切碎并在麻醉下植入3mm2的片到30只雄性小鼠的皮下，小鼠已经随机地分入四个实验组中。
小鼠被移植入3mm3的C170异种移植物片。小鼠组通过在第3，5，7，21和22天的静脉内注射进行5-FU/亚叶酸(12.5mg/Kg)处理。在同一天里小鼠由腹膜内注射0.2mg的SC104mab。对照小鼠单独接受SC104或者对照小鼠IgG抗体及5-FU/亚叶酸。肿瘤的尺寸通过两脚规来进行测量，并且在第12，16，19和23天计算肿瘤的横截面积。
结果为了确定这些作用是否能被翻译为体内抑制肿瘤的生长，连续3周向小鼠进行SC104给药(200μg/剂)，向具有C170肿瘤3mm2提取物移植的小鼠或者向抗体给药前已经允许生长5天的C170肿瘤。动物利用单独的SC104，5-FU/亚叶酸以最大承受剂量进行处理，或者利用它们的组合处理三周的时间。图26a显示了SC104或5-FU/亚叶酸单独对新移植的肿瘤产生了50％的肿瘤生长抑制。相比较，二者的组合显示了对生长的协同抑制。当这种交错终止开始的时候，所有组中的肿瘤直至第16天都显示了肿瘤生长的随时间增长。从第9天开始，联合处理组显示了对生长的显著抑制，当与如下所述的其它所有组相比较的时候SC104和5-FU，第9天；37％抑制，p＝0.004；第12天；59％抑制，p＝0.002；第14天；74％抑制，p＝＜0.001；第16天；76％抑制，p＝＜0.001。
5-FU，第9天；40％抑制，p＝0.004；第12天；45％抑制，p＝0.004；第4天；58％抑制，p＝＜0.001；第16天；62％抑制，p＝＜0.001。
SC104，第9天；32％抑制，p＝0.017；第12天；44％抑制，p＝0.004；第14天；54％抑制，p＝0.001；第16天；62％抑制，p＝＜0.001。所有的统计表通过ANOVA进行评定。
在SC104处理组和接受细胞毒性剂，5-FU/亚叶酸的组之间没有显著的区别。这显示出与利用SC104，5-FU或其组合处理的小鼠的生存力有显著改善的相关性(图26b)。SC104和5-FU联合处理的组显示了提高的生存力，当与利用载体对照处理组和下述的5-FU处理组相比的时候组合载体p＝0.0038.
组合细胞毒性剂p＝0.0111(所有统计由Log Rank得到)SC104的剂量很好地被所有小鼠耐受，显示出没有体重丢失以及没有任意其它的整体病理学(图26c)。最后，当SC104进行治疗性给药时，在C170异种移植物植入后7天，无论是5FU还是单独SC104都没有显著抑制生长，但是当其与5-FU/亚叶酸结合的时候二者都显著抑制了肿瘤生长并且提高了生存力(图27)。SC104加5-FU/亚叶酸表现出在最终重量/时间方面出现显著降低，并且在C170皮下异种移植物模型中在提高生存力的情况下抑制了肿瘤生长。
序列表<110>斯堪赛尔有限公司林达·达兰特蒂娜·帕森斯<120>作为潜在抗肿瘤治疗剂的单克隆抗体SC104及其特异性结合至唾液酸丁糖基碳水化合物的衍生物<130>P37068WO<150>GB 0410627.4<151>2004-05-12<160>28<170>patentIn version 3.2<210>1<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
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1.一种分离的特异性结合因子，能结合一种唾液酸丁糖基碳水化合物并且不需要免疫效应细胞就能直接诱导细胞死亡。
2.一种分离的特异性结合因子，能结合一种唾液酸丁糖基碳水化合物，这种唾液酸丁糖基碳水化合物能被包含一或多个结合结构域的一种因子结合，所述结合结构域选自这些结构域，其包含基本如图1a氨基酸序列的第44或49至54、69至84和117至127位残基所列出的氨基酸序列。
3.权利要求2的结合因子，其中所述结合结构域包含基本如图1a的第117至127位残基所列出的氨基酸序列。
4.权利要求2或3所述的特异性结合因子，包含一或多个结合结构域，所述结合结构域选自这些结构域，其包含基本如图1a的氨基酸序列的第44或49至54、69至84或117至127位残基所列出的氨基酸序列。
5.权利权利4的结合因子，包含基本如图1a的第117至127位残基所列出的氨基酸序列。
6.权利要求5的结合因子，进一步包含基本如图1a所示氨基酸序列的第44或49至54位残基和第69至84位残基所列出的结合结构域的一个或全部两个。
7.前述任一项权利要求的结合因子，其中所述或每个结合结构域由人抗体框架携带。
8.权利要求4、5或6的结合因子，包含基本如图1a中所示氨基酸序列的第19至138位残基所列出的氨基酸序列。
9.前述任一项权利要求的结合因子，进一步包含人恒定区。
10.一种分离的特异性结合因子，能结合一种唾液酸丁糖基碳水化合物，所述唾液酸丁糖基碳水化合物能被包含一或多个结合结构域的一种因子结合，所述结合结构域选自这些结构域，其包含基本如图1c氨基酸序列的第46至55、71至77和110至118位残基所列出的氨基酸序列。
11.权利要求10的结合因子，其中所述结合结构域包含基本如图1c氨基酸序列的第110至118位残基所列出的氨基酸序列。
12.权利要求10或11的结合因子，包含一或多个结合结构域，所述结合结构域选自这些结构域，其包含基本如图1c氨基酸序列的第46至55、71至77和110至118位残基所列出的氨基酸序列。
13.权利要求12的结合因子，包含一种结合结构域，所述结合结构域包含基本如图1c氨基酸序列的第110至118位残基所列出的氨基酸序列。
14.权利要求13的结合因子，进一步包含基本如图1c氨基酸序列的第46至55位残基和第71至77位残基所列出的结合结构域的一个或全部两个。
15.权利要求10-14中任一项的结合因子，其中所述或每个结合结构域由人抗体框架携带。
16.权利要求12、13或14的结合因子，包含基本如图1c所示氨基酸序列的第23至128位残基所列出的序列。
17.权利要求10至16中任一项的结合因子，进一步包含人恒定区。
18.一种特异性结合因子，其包含权利要求2至9中任一项的结合因子以及权利要求10至17中任一项的结合因子的组合或联合。
19.前述任一项权利要求的结合因子，用于医药。
20.一种药物组合物，包含权利要求1至18中任一项的结合因子以及药物可接受的赋形剂、稀释剂、载体、缓冲剂或稳定剂。
21.一种治疗患者中肿瘤的方法，其包括向所述患者施用有效剂量的权利要求1至18中任一项的结合因子。
22.权利要求1至18中任一项的结合因子在制造用于治疗肿瘤的药物中的应用。
23.作为组合制剂含有权利要求1至18中任一项的特异性结合因子和活性剂的产品，用于同时、分开或先后的用于肿瘤治疗。
24.权利要求23的产品，其中所述活性剂是阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、伊立替康和/或顺铂。
25.编码权利要求1至18中任一项的结合因子的核酸。
26.一种唾液酸丁糖基碳水化合物，其能被权利要求1至18中任一项的特异性结合因子结合。
27.权利要求26的唾液酸丁糖基碳水化合物，其位于脂或蛋白质骨架上。
全文摘要
本发明提供一种分离的特异性结合因子(member)，其可以结合唾液酸丁糖基碳水化合物并直接诱导细胞死亡而不需要免疫效应细胞。这种结合因子可以是抗体或其一部分。本发明还提供这种结合因子在医药中的应用以及编码这些结合因子的核酸。
文档编号C07K16/44GK1961004SQ200580015323
公开日2007年5月9日 申请日期2005年5月11日 优先权日2004年5月12日
发明者林达·吉利恩·达兰特, 蒂娜·帕森斯 申请人:斯堪赛尔有限公司