抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗P16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其 产生的抗P16单克隆抗体和应用。
【背景技术】
[0002] 人细胞周期依赖性激酶抑制基因（CDKN2A)为抑癌基因，编码两种不同的细胞周 期抑制蛋白pl6INK4a和pl4ARF。pl6INK4a简称：pl6,是由外显子la、2和3编码；而 pl4ARF，简称：pl4,是由外显子1 0、2和3编码。虽然两者含有共同的外显子2和3,但由 于0RF读码框不一样，pl6与pl4的AA序列完全不一样。研究表明，pl6能与⑶K4/6结合 抑制其激酶的活性，从而发挥细胞周期调控作用。由于P16参于调控细胞周期的作用，所以 其在肿瘤发生过程中也发挥着重要的作用，多项研究表明，P16表达量的变化及突变的发生 与肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等多肿瘤 的发生相关。
[0003] 目前临床上主要通过免疫组织化学（IHC)病理实验检测肿瘤组织中pl6蛋白的表 达状况。IHC实验的核心为特异性结合pl6蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整 个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对P16蛋白的单克隆抗 体具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供一种抗pl6蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pl6 单克隆抗体和应用。本发明所述单克隆抗体可与P16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋 白无交叉反应，显著提高了P16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤 细胞内P16蛋白表达水平，可应用于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺 癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等相关肿瘤组织中P16的表达水平。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种单克隆抗体，其与pl6蛋白特异性结合。
[0007] 在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNo. 11088 的杂交瘤细胞株产生。
[0008] 本发明还提供了所述单克隆抗体在制备用于检测pl6蛋白的免疫检测工具中的 应用。
[0009] 在本发明的一些具体实施方案中，所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试 纸。
[0010] 本发明还提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括所述单克隆抗体。
[0011] 本发明还提供了所述单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试剂或试剂盒中的 应用。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试 剂或试剂盒中的应用中所述组织细胞为肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、 胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。所述相关肿瘤为与上述组织、细胞相同的肿瘤。
[0013] 本发明还提供了一种标记组织细胞的试剂盒，包括所述单克隆抗体。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒中所述组织细胞为肺癌、肝癌、恶性 胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。所述相关肿瘤 为与上述组织、细胞相同的肿瘤。
[0015] 本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo. 11088。
[0016] 与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株（保藏编号为CGMCC No. 11088)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体0TI7B10。本发明还提供了单克隆抗 体0TI7B10在制备用于检测pl6蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体0TI7B10的 免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体0TI7B10在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发 明所述单克隆抗体可与P16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高 了P16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内pl6蛋白表达水平， 可应用于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等 相关肿瘤组织中P16的表达水平。
[0017] 生物保藏说明
[0018] 用于保藏的杂交瘤细胞株0TI7B10的分类命名为：pl6蛋白单克隆抗体杂交瘤细 胞株；
[0019] 保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0020] 保藏单位简称：CGMCC;
[0021] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
[0022] 保藏日期：2015年07月03日；
[0023]保藏编号：CGMCCNo. 11088。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0025] 图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为0RF区；
[0026] 图2示实施例2重组pl6蛋白Westernblot检测结果图，以anti-His检测重组 P16蛋白在E.Coli细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的E.Coli细胞裂解液为抗原的 检测结果、泳道R为转染pET-His-rpl6质粒的E.Coli细胞裂解液抗原的检测结果；
[0027] 图3示实施例2重组pl6蛋白SDS-PAGE结果图，用镍亲和层析柱纯化重组P16蛋 白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；
[0028] 图4示实施例3以单克隆抗体0TI7B10识别293T细胞过表达的pl6全长蛋白以 及肿瘤细胞系MCF7内源pl6蛋白的Westernblot检测结果图；
[0029] 图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人结肠癌免疫组化结果图（一抗为pl6 单克隆抗体0TI7B10);
[0030] 图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人宫颈癌免疫组化结果图（一抗为P16 单克隆抗体0TI7B10);
[0031] 图7示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肝癌免疫组化结果图（一抗为pl6 单克隆抗体0TI7B10);
[0032] 图8示实施例50riGene蛋白芯片鉴定结果图（一抗为pl6单抗0TI7B10，1:100; 二抗为DyLight649_conjugatedAffiniPureFragmentGoat-anti-MouseIgG，1:400)。
【具体实施方式】
[0033] 本发明公开了一种抗pl6蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pl6单克隆抗 体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。
[0034] 本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（简称为CGMCC)，保藏日期为2015年07月03日，保藏编号为CGMCCNo. 11088。
[0035] 本发明还提供了一种特异性结合pl6蛋白的单克隆抗体0TI7B10,由上述杂交瘤 细胞株产生。
[0036] 本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
[0037] (1)重组表达载体的构建：根据pl60RF核苷酸序列（pl60RF核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，468bp;pl6氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示）
[0038] 设计引物PCR扩增pl60RF第lbp位到第417bp位序列，基因两侧分别引入限 制性内切酶位点Sgfl和Mlul，插入表达载体pET23a-N-His，构建pl6的重组表达质粒 pET-His-rP16 ;上游扩增引物序列，SEQIDNO. 3:CACGCGATCGCCATGGAGCCGGCGGCGGGGAG下 游扩增引物序列SEQIDNO. 4:ACCGACGCGTATCGGGGATGTCTGAGGGACCT
[0039] (2)pl6重组蛋白的表达与纯化：将pl6重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心 获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的P16重组蛋白；
[0040] (3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的pl6重组蛋白免疫Balb/c小鼠， 取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤 细胞，获得能分泌抗P16特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为0TI7B10,亚型鉴定为IgGl;通 过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得pl6单克隆抗体0TI7B10。分别通过 WesternBlot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
[0041] 本发明还提供了单克隆抗体0TI7B10在制备用于检测pl6蛋白的免疫检测工具中 的应用。
[0042] 具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
[0043] 在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗 体0TI7B10,可检测组织细胞中pl6的表达状况。
[0044] 本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所 述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与P16的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于肺癌、肝癌、 恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等相关肿瘤。
[0045] 与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株（保藏编号为CGMCC No. 11088)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体0TI7B10。本发明还提供了单克隆抗 体0TI7B10在制备用于检测pl6蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体0TI7B10的 免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体0TI7B10在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发 明所述单克隆抗体可与P16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高 了P16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内pl6蛋白表达水平， 可应用于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等 相关肿瘤组织中P16的表达水平。
[0046] 本发明提供的一种单克隆抗体及其用途、产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株、 含有该单克隆抗体的诊断工具中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0047] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0048] 实施例1、pl6重组表达质粒的构建
[0049] 以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒RC220937(含pl60RF468bp)为 模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和Mlul，克隆0RF第lbp至468bp到表达载 体pET23a-N-His，建立pl6重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。
[0050] 实施例2、pl6重组蛋白的表达与纯化
[0051] 1、转化E.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀， 冰浴30min后42°C热激90s，然后将其继续冰浴l-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗 LB培养基，于37°C摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿 倒置于37°C恒温培养箱中培养过夜。
[0052] 2、裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37°C、200rpm培养至0D值达到0. 4~ 0. 6时加入IPTG(终浓度ImM)诱导培养7h。离心