抗ca724单克隆抗体产生的杂交瘤的制作方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及糖抗原CA724单克隆抗体产生的杂交瘤。
[0002]【背景知识】
[0003]糖抗原CA72-4是一种分子量约为220_400kDa的黏蛋白样高分子量的糖蛋白，它是一种相对特异的胃肠道及卵巢肿瘤的标志物，85%?95%的胃癌患者中可检测出其升高，故可作为诊断胃癌的可靠指标。临床大多数据研究发现，CA72-4值的高低与胃癌的瘤体大小，浸润程度，病理类型，淋巴结转移及远处转移呈现正相关性，故该指标可作为胃癌发展程度的一个可靠检测指标。CA72-4作为肿瘤标志物，对结直肠肿瘤有一定的诊断和鉴别诊断价值。CA72-4能较好地鉴别良性结直肠病变和恶性肿瘤。另外，CA72-4与结直肠癌的临床分期、肿瘤细胞分化有关；临床分期越高，分化程度越低，该标志物阳性率越高，所以CA72-4对于监测结直肠癌术后疗效及是否复发有一定的意义。CA72-4还是卵巢上皮性癌尤其是黏液性卵巢癌较好的血清肿瘤标志物，即使在交界性黏液性肿瘤其阳性率也较高。它对卵巢癌疗效观察具有重要意义，可作为卵巢癌术后和化疗后的动态检测指标。CA72-4在多种恶性肿瘤中均有表达，它是一种广谱的肿瘤标志物，测定血清CA72-4对卵巢癌、胃癌、直肠癌、肝癌和肺癌有一定的临床应用价值。
【
【发明内容】
】
[0004]本发明的目的在于提供一种抗CA724单克隆抗体以及建立一种简单且具高灵敏度的检测CA724含量的方法，该方法可应用于癌症的检测。以解决现有的单克隆抗体检测CA724的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。
[0005]本发明获得了能够产生特异性识别CA724的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株1-5-2与杂交瘤细胞株1-19-1，此2株细胞株分别在2015年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201588与CCTCC NO:C201589。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别CA724的两个不同表位，通过1-5-2与1-19-1的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。
[0006]因此，本发明提供了下面所述的I至3的内容:
[0007]1.抗CA724的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC NO:C201588和CCTCC NO:C201589。
[0008]2.抗CA724的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCC NO:C201588和CCTCC NO:C201589的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为1-5-2和1_19_1。
[0009]3.如权利要求2所述的抗CA724单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CA724，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C201588杂交瘤分泌的抗体1-5-2和保藏号为CCTCC NO:C201589杂交瘤分泌的抗体1-19-1，其步骤包括:
[0010](I)以所述的两两配对的单克隆抗体1-5-2包被；
[0011](2)加入待测样品孵育；
[0012](3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体1-19-1作为二抗，加入反应体系；
[0013](4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；
[0014](5)结果表明检测的灵敏度很高。
【【附图说明】】
[0015]附图1显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗CA724单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果。
[0016]附图2显示的是标记HRP的抗CA724单克隆抗体滴度测量结果。
[0017]附图3显示的是夹心法ELISA(S-ELISA)系统的检测灵敏度。
【【具体实施方式】】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阐述了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。
[0019]实施例1:动物免疫
[0020]选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量为IKU的糖抗原CA724与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，IKU每只每次，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫。免疫程序:经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与福氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融入口 ο
[0021]实施例2:杂交瘤细胞的构建
[0022]1、骨髓瘤细胞株的培养及制备
[0023](I)本发明采用的是SP2/0骨髓瘤细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12小时。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养，使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期)；
[0024](2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中，离心，弃上清，悬起，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
[0025]2、脾细胞的制备
[0026](I)将小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；
[0027](2)将小鼠消毒固定在解剖板上，在超净工作台中取脾，放在12mL培养基的培养皿中，剥掉粘连组织，研磨脾脏，直至剩白色组织为止，吸管全部吸起，再缓慢打出使组织块粘连的管壁上，离心，弃上清，加1mL的红细胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培养基终止其反应，离心后，弃上清，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
[0028]3、细胞融合
[0029]加强免疫后3天做细胞融合。
[0030]细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1: 10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为1-5-2和1-19-1。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5% CO2的培养箱中封闭培养12天。
[0031]实施例3:单克隆抗体的制备及筛选
[0032]1、单克隆抗体的制备
[0033]从实施例2中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与CA724抗原反应的单克隆抗体。
[0034]2、单克隆抗体的筛选
[0035](I)将10uL浓度为100IU/mL的CA724抗原到96孔板的每个孔格中，于4°C过夜后使其固定于固相；
[0036](2)用150uL浓度为I %的牛血清白蛋白进行封闭2小时；
[0037](3)将10uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37°C反应2小时，然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37°C反应I小时；
[0038](4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min ;
[0039](5)添加50uL浓度为0.lmol/L的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度；
[0040](6)选出吸光度大约为3的1-5-2和1_19_1，并通过有限稀释法进行亚克隆。
[0041]3、单克隆抗体的大量制备及和纯化
[0042]将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为1_5_2和1-19-1。
[0043]4、单克隆抗体效价的测定
[0044]所筛选出的2种mAb的效价通过ELISA方法来测定。分别加入1_5_2、1-19-1 (10ug/mL)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色，两种mAb效价达到10 9以上(附图1所示)。
[0045]实施例4:单克隆抗体的标记及滴度的测定
[0046]将纯化出得各抗体按常规方法进行HRP标记，标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定，将浓度为100IU/mL的CA724抗原固定在96孔微板上(10uL/孔)。使用I %的牛血清白蛋白进行封闭2小时，加标记的单克隆抗体(第一孔稀释100倍)，从第二孔开始做4倍稀释，于室温下反应2小时。添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，用0.1mol/L的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度，按实施例3中的方式获得针对固定在固相中的抗原的滴度。结果表明具有有效的滴度(附图2所示)。
[0047]实施例5:双抗体夹心ELISA检测CA724方法的建立
[0048](I)以所述的两两配对的单克隆抗体之一包被，0.5ug/mL的单克隆抗体以10uL/孔的量加到微孔板土，于4°C孵育24小时固定于固相；
[0049](2)孔格使用含有 0.1 % Tween 20 的 pH 值为 7.4 的 20mM PBS (PBST)，以 200uL/孔的量洗涤2次。以150uL/孔的量加入I %牛血清白蛋白进行封闭2小时；
[0050](3)孔格用PBST以200uL/孔的量洗涤4次，加入由起始浓度10IU/mL连续4倍稀释CA724抗原，于室温温育2小时，然后加入HRP标记的另一株抗体(I: 5000 ； 10uL/孔)并于室温温育2小时；
[0051](4)添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，加入0.lmol/L的硫酸来终止反应并测量450nm的吸光度；
[0052](5)结果表明检测的灵敏度很高(附图3所示)。
【主权项】
1.抗CA724的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCCNO:C201588和CCTCC NO:C201589。2.抗CA724的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCCNO:C201588和CCTCC NO:C201589的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为1-5-2和1-19-1。3.如权利要求2所述的抗CA724单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CA724，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C201588杂交瘤分泌的抗体1-5-2和保藏号为CCTCC NO:C201589杂交瘤分泌的抗体1_19_1其步骤包括: (1)以所述的两两配对的单克隆抗体1-5-2包被； (2)加入待测样品孵育； (3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体1-19-1作为二抗，加入反应体系; (4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值； (5)结果表明检测的灵敏度很高。
【专利摘要】抗糖抗原CA724单克隆抗体产生的杂交瘤的制备，属于免疫分析医学领域。本发明提供了一种特异性识别糖抗原CA724的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测糖抗原CA724的高灵敏度的方法。CCTCC NO：C20158820150717
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/577, C12N5/20, C07K16/18, G01N33/574
【公开号】CN105132377
【申请号】CN201510454053
【发明人】刘云成, 李喜梅, 赵洪梅, 李春雷, 董小芳, 崔嵩
【申请人】大庆麦伯康生物技术有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月25日