人单克隆抗-pd-l1抗体和使用方法
【专利说明】人单克隆抗-PD-L1抗体和使用方法
[0001] 相关申请 本申请要求提交于2012年10月4日的美国临时申请号61/709, 731和提交于2013年 3月13日的美国临时申请号61/779,969的优先权和利益，其内容通过引用各自以其整体结 合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明主要涉及抗-PD-Ll (也称为程序化细胞死亡1配体1或B7H1)抗体及其使 用方法。
[0003] 发明背景 免疫系统必须实现在有效应答以清除致病体和保持耐受以防止自身免疫疾病之间的 平衡。T细胞对于保持这种平衡是关键的，并且它们的适当的调节主要通过B7-CD28家族的 分子协调。B7家族成员（其行使配体的功能)和CD28家族成员（其行使受体的功能)之间的 相互作用提供了关键的正信号，其不仅发起、提高和维持T细胞应答，而且在适当时还促进 限制、终止和/或消弱τ细胞应答的关键负信号。CD28家族的一个成员，称为ro-i (也称 为程序化细胞死亡-1)在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上被增量调节。Η)-1在B7家族 中有两个鉴定出的配体，PD-Ll (也称为BH71或程序化细胞死亡-1配体1)和TO-L2。虽然 主要在活化的抗原呈递细胞（APC)上发现ro-L2的表达倾向于为更受限的，但ro-Ll的表 达为更普遍的，包括造血谱系（其包括活化的T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞和巨噬细 胞）和外周非淋巴组织（其包括心、骨骼、肌肉、胎盘、肺、肾和肝组织）的细胞。PD-Ll的普 遍表达暗示它在调节ro-1/PD-Ll-介导外周耐受中的重要作用。
[0004] PD-Ll和ro-ι之间的结合对于T细胞应答的调节具有意义深远的作用。具体而 言，ro-Li/ro-1相互作用抑制τ细胞增殖和效应子细胞因子(其介导τ细胞活性和免疫应 答，例如IL-2和IFN- γ )的产生。此负调节功能对于阻止T细胞-介导的自身免疫和免疫 病理学是重要的。然而，还已表明，PD-1/ro-Ll轴在T细胞衰竭中发挥作用，由此负调节功 能抑制T细胞对宿主的危害的应答。对T细胞的长期或慢性抗原刺激可诱导负免疫反馈机 制，其抑制抗原特异性应答并导致病原体的免疫逃避。T细胞衰竭还可导致抗原-特异性T 细胞自身的渐进性物理缺失（progressive physical deletion)。F1D-I的T细胞表达在慢 性抗原刺激期间被增量调节，并且其与I3D-Ll的结合导致在CD4+(T辅助细胞）和CD8+(细 胞毒性T淋巴细胞或CTL)T细胞两者中效应子功能的阻断，因此暗示在T细胞衰竭的诱导 中PD-1/PD-L1相互作用。
[0005] 最近，已表明一些慢性病毒感染和癌症发展了免疫逃避策略，其通过引起ro-i/ ro-Ll-介导的τ细胞衰竭而特别地利用ro-1/PD-Li轴。多种人肿瘤细胞和肿瘤相关抗原 呈递细胞表达高水平的ro-Ll，这暗示所述肿瘤诱导τ细胞衰竭以逃避抗-肿瘤免疫应答。 在慢性HIV感染期间，HIV-特异性CD8+ T细胞在功能上被损害，表现为产生细胞因子和效 应子分子的能力降低和增殖能力降低。研究已表明ro-ι在HIV感染个体的HIV-特异性 ⑶8+ T细胞上高表达，这表明阻断ro-1/PD-Ll通路对于HIV感染和AIDS患者的治疗可具 有治疗潜能。综合在一起，阻断ro-1/PD-Ll通路的作用剂将为多种癌症、HIV感染和/或与 T-细胞衰竭相关的其它疾病和病况提供新的治疗方法。因此，对可阻断或阻止ro-1/PD-Ll 相互作用的作用剂存在迫切的需要。
[0006] 发明简述 本发明基于结合ro-Li的单克隆抗体的发现。所述单克隆抗体为全人抗体。所述抗体 结合ro-Li。所述抗体在本文中被称为huro-Li抗体。
[0007] PD-Ll也被称为程序化细胞死亡1配体1、程序化死亡配体1、ro⑶1配体1、 PDCD1L1、PDL1、B7 同系物 1、B7H1、B7-H、CD274 和 CD274 抗原。
[0008] 本发明提供分离的人源化单克隆抗体，其具有：具有三个CDR (其分别包含氨基酸 序列 SYGIS (SEQ ID N0:57)、WISAYNGNTNYAQKLED (SEQ ID N0:70)和 ALPSGTILVGGWFDP (SEQ ID N0:86))的重链和具有三个CDR (其分别包含氨基酸序列TRSSGNIASNYVQ (SEQ IDN0:101)、EDNQRPS(SEQIDN0:115)和QSYDSSNLWV(SEQIDN0:1 27))的轻链；具有 三个 CDR (其分别包含氨基酸序列 SYALS (SEQ ID N0:58)、AISGGGGSTYYADSVKD (SEQ ID N0:71)和DVFPETFSMNYGMDV (SEQ ID N0:87))的重链和具有三个CDR (其分别包含氨基 酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID N0:102)、GKNNRPS (SEQ ID N0:116)和 NSRDSSGNHYV (SEQ ID N0:128))的轻链；具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列DYAMH (SEQ ID N0:60)、 LIS⑶GGSTYYADSVKD (SEQ ID N0:73)和VLLPCSSTSCYGSVGAFDI (SEQ ID N0:88))的重链和 具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列GGSDIGRKSVH (SEQ ID NO: 103)、SDRDRPS (SEQ ID NO: 117)和QVWDNNSDHYV (SEQ ID NO: 129))的轻链；具有三个CDR(其包含氨基酸序列NYDMS (SEQ ID N0:61)、RVNWNGGSTTYADAVKD (SEQ ID N0:74)和 EFVGAYDL (SEQ ID N0:89))的 重链和具有三个CDR(其分别包含氨基酸序列TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID N0:104)、DVSNRPS (SEQ ID NO: 118)和SSYTSSTLP (SEQ ID NO: 130))的轻链；具有三个CDR (其分别包含氨 基酸序列 GLYIH (SEQ ID N0:62)、WIIPIFGTANYAQKFED (SEQ ID N0:75)和 GLRWGIWGWFDP (SEQ ID N0:90))的重链和具有三个CDR (其分别包含氨基酸序列RASQSIGNSLA (SEQ ID NO: 105)、GASSRAT (SEQ ID NO: 119)和 QQHTIPTFS (SEQ ID NO: 131))的轻链；具 有三个 CDR (其分别包含氨基酸序列 DNAIS (SEQ ID N0:63)、WIIPIFGKPNYAQKFED (SEQ ID N0:76)和TMVRGFLGVMDV (SEQ ID N0:91))的重链和具有三个CDR (其分别包含氨基 酸序列 RASQGIGSYLA (SEQ ID N0:106)、AASTLQS (SEQ ID N0:120)和 QQLNNYPIT (SEQ ID N0:132))的轻链；具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列SYAMS (SEQ ID N0:64)、 AISGSGGSTYYADSVKD (SEQ ID N0:77)和 DQFVTIFGVPRYGMDV (SEQ ID N0:92))的重链和 具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列S⑶KLGNKYAY (SEQ ID NO: 107)、QDIKRPS (SEQ ID NO: 121)和QTWDNSVV (SEQ ID NO: 133))的轻链；具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列 SYAIS (SEQ ID N0:57)、WIIPIFGTANYAQKFED (SEQ ID N0:78)和 GRQMFGAGIDF (SEQ ID N0:93))的重链和具有三个CDR(其分别包含氨基酸序列TRSSGSIDSNYVQ (SEQ ID N0:108)、 EDNQRPS (SEQ ID NO: 115)和 QSYDSNNRHVI (SEQ ID NO: 134))的轻链；具有三个 CDR (其 分别包含氨基酸序列 TYALN (SEQ ID N0:65)、RIVPLIGLVNYAHNFED (SEQ ID N0:79)和 EVYGGNSDY (SEQ ID勵:94))的重链和具有三个〇?(其分别包含氨基酸序列了1?36见6了附￥0 (SEQ ID NO: 109)、EDYRRPS (SEQ ID NO: 122)和 QSYHSSGWE (SEQ ID NO: 135))的轻链； 具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列SHGIT (SEQ ID N0:66)、WISAHNGHASNAQKVED (SEQ IDN0:80)和VHAALYYGMDV(SEQIDN0:95))的重链和具有三个⑶R(其分别包含氨基酸 序列 GGNNIGSKGVH (SEQ ID N0:110)、DDSDRPS (SEQ ID N0:123)和 QVWDSSSDHWV (SEQ ID N0:136))的轻链；具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列RHGMH (SEQ ID N0:67)、 VISHDGSVKYYADSMKD (SEQ ID N0:81)和GLSYQVSGWFDP (SEQ ID NO:%))的重链和具有三个 CDR(其分别包含氨基酸序列 TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:111)、EDNQRPS (SEQ ID Ν0:11δ) 和QSYDSTTPSV (SEQ ID NO: 137))的轻链；具有三个CDR (其分别包含氨基酸序列SYGIS (SEQ ID N0:58)、WTSPHNGLTAFAQILED (SEQ ID N0:82)和 VHPVFSYALDV (SEQ ID N0:97)) 的重链和具有三个CDR(其分别包含氨基酸序列TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 112)、EDNQRPS (SEQ ID NO: 115)和 QSYDGITVI (SEQ ID NO: 138))的轻链；具有三个 CDR (其分别包含 氨基酸序列 TYAFS (SEQ ID N0:68)、RIIPILGIANYAQKFED (SEQ ID N0:83)和 DGYGSDPVL (SEQ ID N0:98))的重链和具有三个CDR (其分别包含氨基酸序列TRSSGSIASHYVQ (SEQ IDN0:113)、EDNKRPS(SEQIDN0:124)和QSYDSSNRWV(SEQIDN0:139))的轻链 ；或具有 三个 CDR (其分别包含氨基酸序列 NYGIS (SEQ ID N0:69)、WISAYNGNTNYAQKVED (SEQ ID N0:84)和⑶FRKPFDY (SEQ ID N0:99))的重链和具有三个⑶R (其分别包含氨基酸序列 TLRSGLNVGSYRIY(SEQIDN0:114)、YKSDSNKQQAS(SEQIDN0:125)和MIWYSSAW(SEQID NO: 140))的轻链；其中所述抗体结合人ro-Li。
[0009] 在一个方面，抗体为单价的或二价的。在另一方面中，抗体为单链抗体。
[0010] 本发明提供单链抗体，其包括：含SEQ ID NO: 1的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 3的Vj亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 5的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 7的八核苷酸序 列；含SEQ ID NO: 9的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 11的V J亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 13的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 15的V1核苷酸序列；含SEQ ID NO: 17的Vh核苷酸 序列和含SEQ ID NO: 19的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 21的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 23的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 25的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 27的Vl 核苷酸序列；含SEQ ID NO: 29的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 31的八核苷酸序列；含 SEQ ID NO: 33的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 35的V J亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 37 的Vh核苷酸序列和含SEQ ID NO: 39的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 41的V!^亥苷酸序 列和含SEQ ID NO: 43的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 45的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 47的V』亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 49的苷酸序列和含SEQ ID NO: 51的V』亥 苷酸序列；或含SEQ ID NO: 53的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 55的八核苷酸序列。 [0011] 在另一个方面中，本发明提供单链抗体，其包括：含SEQ ID NO: 2的％氨基酸序列 和含SEQ ID NO: 4的 '氨基酸序列；含SEQ ID NO: 6的￥11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 8的'氨基酸序列；含SEQ ID NO: 10的V 11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 12的八氨基酸 序列；含SEQ ID NO: 14的￥11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；含SEQ ID NO: 18的Vh氨基酸序列和含SEQ ID NO: 20的Vl氨基酸序列；含SEQ ID NO: 22的Vh氨基 酸序列和含SEQ ID NO: 24的'氨基酸序列；含SEQ ID NO: 26的V 11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 28的八氨基酸序列；含SEQ ID NO: 30的V基酸序列和含SEQ ID NO: 32的Vl 氨基酸序列；含SEQ ID NO: 34的￥11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 36的八氨基酸序列；含 SEQ ID NO: 38的V1^基酸序列和含SEQ ID NO: 40的V1氨基酸序列；含SEQ ID NO: 42 的Vh氨基酸序列和含SEQ ID NO: 44的八氨基酸序列；含SEQ ID NO: 46的V 11氨基酸序 列和含SEQ ID NO: 48的八氨基酸序列；含SEQ ID NO: 50的V 基酸序列和含SEQ ID NO: 52的 '氨基酸序列；或含SEQ ID NO: 54的V 基酸序列和含SEQ ID NO: 56的Vl 氨基酸序列。
[0012] 在一些方面中，抗体具有在KT5 M-KT12 M的范围内的结合亲和力。
[0013] 在另一方面中，抗体是双特异性抗体，其还结合至肿瘤-相关抗原、细胞因子或细 胞表面受体。例如，所述肿瘤-相关抗原是CAIX。例如，所述细胞因子是IL-10。例如，所 述细胞表面受体是CCR4、IL21R、BTLA、HVEM或??Μ3。
[0014] 本发明提供连接至治疗剂的抗体。例如，所述治疗剂是毒素、放射性标记、siRNA、 小分子或细胞因子。
[0015] 本发明提供产生任何上述抗体的细胞。
[0016] 本发明还提供选择性杀伤肿瘤细胞的方法，其包括将所述细胞与任何上述抗体接 触。在一方面中，通过抗体-依赖性细胞毒性（ADCC)、补体依赖性细胞毒性（CDC)、抗体依 赖性细胞吞噬（ADCP)产生选择性杀伤。在另一方面中，所述肿瘤细胞表达ro-Li。
[0017] 本发明还提供阻止或逆转T细胞衰竭的方法，其包括向有需要的受试者给予含任 何上述抗体的组合物。
[0018] 本发明还提供提高对抗原的免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者给予含任 何上述抗体的组合物。在一方面中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或肿瘤相关抗原。在另一方 面中，所述病毒抗原是HIV。在另外的方面中，所述肿瘤相关抗原是CAIX。在另一方面中， 抗体在暴露于抗原之前或之后被给予。在另一方面中，所述抗体的给予引起抗原特异性T 细胞活性增加。在另一方面中，T-细胞是效应子T细胞。
[0019] 本发明还提供治疗或缓解癌症的症状的方法，其包括向有需要的受试者给予含任 何上述抗体的组合物。例如，所述癌症是肾细胞癌或乳腺癌。例如，所述癌症是其中过量表 达F 1D-Ll的癌症。在另一实例中，所述癌症是诱导T细胞哀竭的癌症。
[0020] 本发明还提供治疗或缓解慢性病毒感染的症状的方法，其包括向有需要的受试者 给予含任何上述抗体的组合物。例如，所述慢性病毒感染是HIV感染。例如，所述慢性病毒 感染是诱导T细胞衰竭的病毒感染。
[0021] 本发明提供核酸序列，其包括 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53 或 55 的核酸序列。
[0022] 在另一方面中，本发明提供核酸序列，其编码SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、 18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54 或 56 的多肽。
[0023] 在另一方面中，本发明提供多肽，其包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54 或 56 的氨基酸序列。
[0024] 在另一方面中，本发明提供载体，其包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53或55的核酸序列。本发明提 供载体，其包含 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、42、44、46、48、50、52、54或56的核酸序列。本发明另外提供细胞，其包含上述载体的任 一种。
[0025] 本公开的任何方法中的给予途径包括但不限于肠胃外（例如，静脉内）、皮内、皮 下、口服（例如，吸入）、经皮（即，局部）、经粘膜和直肠给予。
[0026] 本公开的任何方法中的受试者是，例如，哺乳动物。所述哺乳动物是，例如，人。
[0027] 本发明的其它特征和优势依据以下详述的说明书和权利要求将显而易见，并且包 含在其中。
[0028] 附图简述 图1.抗-PD-Ll scFv-噬菌体克隆（14个克隆）的氨基酸序列。展示了对于IGHV和 IGLV/IGKV两者的构架区1-4 (FW1-4)、互补决定区1-3 (CDR1-3)和家族命名。使用Kabat 编号。检索表："."与共有区匹配的AA、"X"非共有区AA和为空白（即没有AA)。
[0029] 图2.通过FACS进行的huro-Ll抗体与人ro-Ll (hro-Ll)表达细胞的结合分析。 测试四种类型的细胞，其包括亲本细胞系300. 9和hPD-Ll、hPD-L2或人C型凝集素结构域 家族2成员（hCLEC2D)转染的300. 9细胞。GF1538是抗hPD-Ll的人源化抗体。GF1757是 抗hPD-L2的人源化抗体。第二抗体是PE-山羊抗-人IgG。
[0030] 图3.在竞争性FACS分析中通过抗-PD-Ll噬菌体-抗体对hPD-1结合至hPD-Ll 的抑制。测试呈噬菌体-scFv形式的所有抗-M3D-Ll抗体对hPDl-hFc融合蛋白与hPD-Ll 表达293T细胞的结合的抑制。将IO12 pfu的噬菌体-scFv与约0. 25 yg/mL的可溶 性hPDl-hFc混合并加入至hPD-Ll表达质粒转染的293T细胞。在洗涤之后，将细胞与 FITC-抗-人IgG抗体一起孵育以测量hPDl-hFc与细胞表面上的hPD-Ll的结合。
[0031] 图4.在竞争性FACS分析中通过抗-PD-Ll可溶性抗体对hPD-Ι结合至hPD-Ll的 抑制。将所有抗-M 3D-Ll抗体以所示浓度与hPD-Ll表达质粒转染的300. 9细胞预孵育30 分钟，随后将0. 125 μ g的hPD-Ι-小鼠 IgG2a加入各反应物中并孵育另外30分钟。在洗涤 之后，将PE-山羊-抗-小鼠 IgG2a Ab加入并接着洗涤和FACS分析。GF1538是抗hPD-Ll 的人源化Ab。GF1757为抗hPD-L2的人源化Ab。
[0032] 图5.双特异性抗体的设计和形成。
[0033] 图6.双特异性抗体（bsAb)构建体的确定。A)识别CAIX和H)-L1的双特异性抗 体的图示和连接CH3结构域的"结进孔（knob into hole)"方法。B)三种类型的bsAb构 建体的图示，其在CH2结构域中具有不同的突变以改变ADCC活性。